Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

L'obiettivo generale di questo nuovo sistema modello basato sul DNA è quello di comprendere le proprietà fondamentali di una classe di polimeri semiflessibili, che descrive anche il comportamento di una classe vitale di biopolimeri. Questo nuovo metodo ci permette di studiare questioni chiave nel campo della metafisica morbida, in particolare, permette di esplorare il comportamento dei filamenti semiflessibili e la loro disposizione in reti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le proprietà meccaniche dei filamenti endovivi sono accessibili sperimentalmente e possono essere regolate con precisione.

I polimeri semiflessibili sono definiti dalle proprietà speciali dei filamenti, che in precedenza erano trattate solo nel quadro teorico a causa della mancanza di sistemi sperimentali sintonizzabili. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla quantità che definisce i polimeri semiflessibili, può anche essere applicato come nuovo idrogel per studiare la migrazione cellulare in matrici di diversa rigidità senza modificare la dimensione della maglia sottostante. La più piccola unità ripetitiva nel nanotubo può essere pensata come un anello unitario.

Molti di questi anelli unitari si impilano durante l'ibridazione. Questo porta alla formazione di nanotubi allungati. Per iniziare, risospendere gli oligonucleotidi liofilizzati in acqua purificata e seguire gli ulteriori passaggi di risospensione indicati nel manuale corrispondente dell'azienda.

Regolare la quantità di acqua per ottenere una concentrazione finale di 200 micromolari. Determinare la concentrazione dei singoli filamenti di DNA per verificare i valori forniti dal distributore poiché l'esatta stechiometria è fondamentale per il processo di assemblaggio. Utilizzando una micropipetta, mescolare i filamenti di DNA della stessa concentrazione in un contenitore adatto al termociclatore per formare le provette di DNA e l'elica desiderate.

Ibridare i tubi del DNA e dell'elica in un termociclatore utilizzando i parametri trovati nel protocollo di testo. Conservare il DNA ibridato e le provette dell'elica per un massimo di 3 settimane a 4 gradi Celsius senza degradazione rilevabile. Prima di eseguire la reologia, diluire accuratamente il campione fino alla concentrazione finale desiderata utilizzando il tampone del campione, se necessario.

Scegliere una geometria appropriata per il reometro a taglio dinamico. Quindi, caricare il campione sul reometro. Per evitare potenziali effetti di evaporazione, passivare l'interfaccia aria-acqua del campione e dell'ambiente attraverso 1 tecnica su 3.

Circondare il campione con 2,5 millilitri di bagno tampone per campioni. In alternativa, aggiungere al campione un tensioattivo appena al di sotto della concentrazione di micelle. In alternativa, utilizzare la siringa Hamilton per circondare il campione con lipidi per evitare il contatto diretto del campione con l'aria.

Sigillare la camera del campione utilizzando un tappo dotato di spugne bagnate. E, se possibile, utilizzare un bagnomaria aggiuntivo per sopprimere ulteriormente l'evaporazione. Avviare la misura utilizzando il software specifico del reometro a temperatura ambiente permettendo al campione di equilibrarsi per 2 ore a temperatura ambiente.

Il tempo di equilibratura è fondamentale per consentire al sistema termoflesso di raggiungere uno stato randomizzato isotropo completo, poiché questa è l'unica conferma che consente il confronto tra le diverse misure. Dopo la misurazione, elaborare i dati come descritto nel protocollo di testo. Preparare 8 aliquote da 12 microlitri per ogni campione utilizzando da 1 a 4 micromolari di DNA per filamento, 12,5 millimolari di cloruro di magnesio e 1x colorante di gel di acido nucleico.

Inoltre, fai un controllo negativo senza DNA, ma includi la colorazione in gel di acido nucleico. Trasferire le aliquote su una piastra PCR in tempo reale e sigillare con pellicola adesiva. Centrifugare la piastra a 100 volte G per 1 minuto a temperatura ambiente per eliminare le bolle di gas.

È fondamentale rimuovere le bolle di gas perché possono espandersi durante le misurazioni e i campioni non possono essere analizzati. Dopo la centrifugazione, caricare la piastra sigillata in un sistema di PCR quantitativa in tempo reale. Programmare un programma di ricottura per denaturare il DNA a novanta gradi Celsius per 10 minuti e abbassare rapidamente la temperatura a settantadue gradi Celsius.

Quindi la temperatura dovrebbe diminuire lentamente di 0,5 gradi Celsius ogni trenta minuti. Dopo che il segnale è diminuito, accelerare la rampa di temperatura. Assicurarsi che il coperchio del ciclatore si riscaldi ad almeno cento gradi Celsius per evitare la condensazione del campione evaporato sulla pellicola adesiva.

Durante l'assemblaggio, eccitare i campioni con un laser a ioni argon a quattrocentottantotto nanometri e rilevare la fluorescenza a cinquecentocinquanta nanometri quando si utilizza un colorante CY3. Per altri coloranti, scegliere una combinazione di emissione di eccitazione appropriata. Misura il segnale di fluorescenza il più spesso possibile per aumentare la qualità complessiva del segnale utilizzando la fotocamera integrata.

Vengono mostrati dati grezzi rappresentativi di una misura reologica che rivelano l'elasticità della rete. Qui è mostrato lo sweep temporale durante il tempo di equilibrio. Questo grafico rivela il comportamento dipendente dalla deformazione della rete.

In questo grafico, il comportamento dipendente dalla frequenza della rete è evidente. A questo punto vengono scelti i valori ad una determinata frequenza. I valori per la popolazione specifica del tubo elicoidale del DNA sono stati confrontati con la concentrazione.

Questo processo è stato ripetuto per tutti i tubi del DNA e dell'elica. La pendenza è stata quindi estratta in un appezzamento logaritmico che ha prodotto l'esponente della legge di potenza. Infine, i valori sono stati ritracciati rispetto alla lunghezza persistente per ciascuna concentrazione misurata.

Questi grafici permettono di estrarre la scala del modulo elastico di plateau rispetto alla lunghezza di concentrazione e persistenza. Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della materia soffice e della fisica dei polimeri per esplorare l'effetto della rigidità del filamento per la classe dei polimeri semiflessibili. Seguendo questa procedura, possono essere affrontati ulteriori effetti come la recitazione delle reti entangled, le reti di attraversamento in generale e il processo di formazione della struttura.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione su come ibridare i nanotubi di DNA e su come misurare le proprietà reologiche delle loro reti.