Name: Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e lanalisi degli isolati risultanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Scopri il biopanning semi-automatizzato per isolare reagenti peptidici ad affinità da librerie batteriche. Questo metodo riduce i falsi positivi e accelera la scoperta di agenti di cattura specifici per applicazioni diagnostiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di US Army Research Laboratory (ARL) Postdoctoral Fellowship Program, amministrato da Oak Ridge Associated Università attraverso un contratto con ARL, attraverso la nomina del Dr. Justin P. Jahnke. Restanti finanziamenti è stata fornita dai sensori e direzione di dispositivi elettrone alle ARL. Gli autori inoltre vorrei ringraziare il laboratorio Daugherty alle UCSB per condividere la libreria batterica display e informazioni per la clonazione il reagente YPet Mona, Dr. Bryn Adams per supporto nella clonazione il reagente YPet Mona a ARL, Dr. Joshua Kogot per il suo lavoro iniziale su e formazione in biopanning di librerie visualizzazione batterica, Alena calma di Edgewood chimico e biologico Center per la condivisione di plasmidi utilizzati per esprimere e purificare Elser e proteine rivax, Brandi Dorsey per il supporto tecnico per isolamento di PA associazione peptidi, Qin Guo per il supporto tecnico di esperimenti preliminari per l'isolamento di peptidi associazione Elser e Dr. Jessica Terrell per utili discussioni riguardanti questo manoscritto.

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Biopanning esposizione batterica librerie è stato un approccio di successo per l'isolamento dei reagenti di affinità, e peptidi offrono un'alternativa utile agli anticorpi per riconoscimento quando criteri specifici sono necessari, come la stabilità in ambienti estremi. Biopanning di queste librerie è stato semplificato utilizzando i metodi di autoMCS descritti qui, e una piattaforma di autoMCS disponibili in commercio si estende questa tecnologia ad un pubblico più ampio. Rispetto ai tradizionali alternati MCS/FACS metodi di ordinamento per batterico visualizzano librerie, metodi di autoMCS sono meno costosi perché non richiedono un investimento in uno strumento più costoso, FACS capace di cernita e di isolare le cellule associate, piuttosto che il tipo del citometro a flusso utilizzato qui, che solo è capace di analisi 14. I passaggi critici per il successo biopanning di autoMCS includono la separazione programma selezione, negativo l'ordinamento contro potenziali cross-reattivi per ridurre i falsi positivi, arricchimento libreria utilizzando FACS per determinare quando smettere di biopanning, di monitoraggio e analisi intelligente della piscina candidato per evitare la selezione di ingombrante di centinaia di candidati.
Negli esempi descritti nel presente documento viene biopanning successo della libreria display batteriche selezionate per due obiettivi separati, PA ed Elser, anche se con strategie di analisi leggermente diversa a causa delle differenze nelle sequenze del peptide per ciascun pool di candidati dopo quattro turni di biopanning. PA è stato il caso più semplice, con l'analisi di sequenza che dimostrano tendenze chiare dalle sequenze peptidiche che ripetuto almeno una volta in 144 colonie. Questo è stato da solo sufficiente a determinare una sequenza di consenso per la destinazione di PA e quelle colonie che conteneva il consenso o una sequenza simile sono stati i migliori candidati in termini del rapporto di associazione alla PA contro associazione per il controllo negativo di streptavidina. Tuttavia, questo non sarà sempre il caso. Per la destinazione di Elser, 100 colonie sequenziamento ha portato cinque sequenze ripetute, ma la tendenza in queste sequenze era meno chiara, diverso da una tendenza a contenere residui dell'amminoacido aromatico e acido aspartico o asparagina. Il predetto "consenso" delle sequenze ripetute solo potrebbe sono stati prodotto e testato per affinità di Elser, ma poiché nessuna sequenza padre contenuto quella sequenza consenso esatto, siamo tornati alla lista delle colonie sequenziate e osservato che altri candidati che aveva tendenze più in comune tra loro. Infatti, due colonie conteneva una sequenza simile al "consenso" dalle ripetizioni da solo, (FWDTWF invece di FWAWF), che aveva la stessa tendenza dei residui di acido aspartico, fenilalanina e triptofano, ma con diversa spaziatura. Uno di questi peptidi era una sequenza ripetuta, uno non era. Queste due sequenze, insieme a una terza sequenza contenente una variante simile, sono stati tra i primi 5 leganti testati in termini di affinità per Elser. Il raccoglitore superiore generale, AX-A05, visualizzato anche tendenze simili. I risultati per Elser dimostrano che un approccio che alterna diverse volte tra l'analisi di sequenza e l'analisi di affinità e specificità a volte sarà necessario, a seconda della destinazione scelta. I risultati per la destinazione di Elser dimostrano anche il livello di specificità che possono essere raggiunti nel corso di una proteina molto simile (rivax 1,15).
I programmi di autoMCS selezionati per i nostri studi sono stati Posselds e Posseld, entrambi per selezione positiva delle cellule bersaglio con etichetta con bassa frequenza, a meno di 5% della popolazione iniziale. In entrambi i casi, le cellule passano attraverso due colonne magnetiche. Nel caso del programma di Posselds, tuttavia, le cellule passano più lentamente attraverso la prima colonna per aumentare l'esposizione tempo 41. Oltre alle descrizioni programma fornite dal produttore del dispositivo commerciale autoMCS (Vedi Materiali tavolo) 41, questi programmi sono stati scelti dopo un iniziale confronto di diversi programmi di potenziale. Capacità di ogni programma per evitare di tirare fuori falsi positivi da una cultura omogenea delle cellule di controllo negativo e di isolare con successo un noto raccoglitore ad un target di interesse da una coltura mista che contiene le cellule di controllo negativo addizionate con una diminuzione percentuale di legante noto, sono stati confrontati. Se si discosti significativamente dalle applicazioni descritte qui, un simile confronto potrebbe essere utile nella selezione del programma per la nuova applicazione. Tuttavia, precedentemente pubblicato risultati confrontando questi due programmi (Posseld e Posselds) per l'isolamento dei peptidi affinità reagenti per PA hanno mostrato che utilizzando uno di questi programmi per tutti i quattro giri di biopanning ha condotto all'isolamento di peptidi con simili affinità e specificità per la PA e la determinazione del consenso WXCFTC. Le differenze principali sono stati quello Posseld, con il suo tasso di flusso più veloce, ordinato più rapidamente e affinità per la destinazione obbligatoria di conseguenza era più alto dopo solo due giri di biopanning, mentre usando il Posselds portato a ulteriori sequenze uniche dopo quattro turni di biopanning 14. imparare da questo, la strategia è stata cambiata leggermente quando biopanning per peptidi associazione Elser incorporare entrambi i benefici: Posselds è stato utilizzato per giro 1 per consentire più tempo di esposizione durante questo passaggio critico dove la diversità è più alto, ma poi la programma è stato commutato a Posseld per l'isolamento più veloce dei leganti affinità più alti durante i giri 2-4 1,15. Questo sembrava essere ideale per Elser, soprattutto perché il nMFI e le percentuali di legame erano entrambe più alto per Elser ordinamento giro 4 rispetto al PA ordinamento round 4 con entrambi i programmi (Figura 2 e Figura 3 e Sarkes et al 2015 14), ma un confronto diretto, utilizzando una strategia contro l'altro con la stessa destinazione sarebbe richiesto per un confronto più conclusivo. Quale programma è meglio per una particolare applicazione può dipendere l'obiettivo individuale, la libreria di ordinamento utilizzata e il livello di espressione di peptidi che si ottiene con qualsiasi variazione delle condizioni qui descritte.
Non discusse qui sono risultati potenziali da biopanning con materiali abiotici, ma abbiamo anche usato la stessa libreria di esposizione batterica per biopanning contro massa alluminio 2. Questo studio non è stato eseguito utilizzando autoMCS, ma studi simili potrebbero essere compiuti utilizzando autoMCS se il materiale è disponibile su, o potrebbe essere rivestito su o coniugato a, magnetic beads. Nello studio alluminio alla rinfusa, struttura secondaria modellazione e analisi individuale dell'amminoacido era utile per capire che cosa stava guidando l'affinità di legame dei peptidi isolati, poiché nessuna sequenza di consenso era determinato 2. Anche con bersagli biologici, questo può essere necessario per comprendere ciò che sta guidando l'affinità di legame per alcune destinazioni, motivo per cui il foglio di lavoro generato dalla macro "eCPX_Sequencing" include una scheda con analisi di frequenza dei residui individuali. Se nessuna sequenza ripetuta è visto oltre alla mancanza di un consenso, e frequenza di residuo non mostra nessun modello, tuttavia, altri tipi di analisi possono essere richiesti. Inoltre, ulteriore ordinamento giri potrebbe essere necessario evitare lo screening di un numero molto maggiore di candidati per la down-selezione di quelli con affinità sufficienti per la destinazione desiderata.
Con la crescente disponibilità di sequenziamento di nuova generazione, uno studio più approfondito potesse essere eseguito per determinare i candidati più promettenti prima del test di affinità e a determinare il grado di arricchimento dopo ogni turno di biopanning. Tuttavia, sequenze di passare alla fase di analisi associazione potrebbero essere necessario essere ricreati per clonazione, se non sono abbastanza alta frequenza per isolare facilmente con sequenziamento sistematico Colonia di decine o centinaia di colonie. Come la tecnologia avanza, diventando meno costosi e più sistematico, e soprattutto con un'opzione per l'isolamento di Colonia, sarà probabilmente essere il modo migliore per analizzare i dati biopanning. Può portare alla delucidazione delle sequenze modo individuale e l'intera libreria, evolvere. Inoltre, i batteri nella libreria di ordinamento possono mutare nel tempo, che potrebbe influenzare ordinamento verso le cellule con tassi di crescita più veloce o batteri che iperesprimono genomici proteine capaci di legare un materiale anche senza visualizzazione dell'impalcatura e peptide espressione, per istanza. Per questo motivo, una volta candidati promettenti emergono, vale la pena di isolare il DNA del plasmide, retransforming fresco e. coli e confermando il legame del peptide via FACS. Se si prevede di utilizzare il peptide in un formato senza cellula, affinità anche dovrebbero essere valutati per il peptide gratis. Ad esempio, i reagenti di affinità del peptide scoperti attraverso display batterica per la destinazione SEB erano prodotta sinteticamente off-cellula ed analizzati con metodi più tradizionali quali analisi enzima-collegata metologie (ELISA) e il cellulare (via FACS) e fuori delle cellule (via ELISA) affinità sono stati confrontati usandoil dalul K determinato da entrambi metodi 7.
Anche se la forza dell'interazione biotina-streptavidina rende una strategia ideale per l'acquisizione del bersaglio di proteine e peptidi associati, questa procedura può essere modificata per altre strategie di acquisizione. Accoppiamento diretto della proteina a biglie magnetiche, come la resina epossidica e perle di acido carbossilico, ha avuto successo e rimuove un passaggio di associazione. Tuttavia, il collegamento diretto può ostacolare potenziali siti di legame in un modo specifico o non specifico, a seconda della strategia di attacco. Un ulteriore vantaggio a usando le perle di streptavidina è che meno stabile della proteina target può essere appena biotinilati in 30 min o memorizzati congelati, se necessario, mentre le perline se stessi tendono a richiedere più lunga incubazione con la proteina per cross-linking e sono generalmente conservato a 2-8° C. La concentrazione di partenza suggerita di proteine biotinilate target qui, 600 nM, ha avuto successo per bersagli multipli, ma potrebbe essere possibile isolare i reagenti di cattura del peptide con affinità aumentata se questa concentrazione è ridotta. Inoltre, questo metodo può essere esteso a e modificato per altre librerie di esposizione batterica ed altri organismi. Ad esempio, questi passaggi possono essere eseguiti in assenza di ossigeno per uso con gli anaerobi, o in altri ambienti per l'utilizzo con extremophiles per isolare i peptidi con proprietà uniche. I peptidi e/o consenso determinato per una particolare destinazione di interesse può essere potenzialmente utilizzato il cellulare come una vita materiale, o prodotta sinteticamente off-cellula. Peptidi prodotte sinteticamente possono essere ulteriormente regolate per lo sviluppo di maggiore affinità e agenti di proteina catalizzata Capture (PCC) più robusti per l'uso in sensori, o per altre applicazioni in cui gli anticorpi sarebbero stati utilizzati in genere per l'associazione o riconoscimento 38,55. Modellistica molecolare è utilizzabile anche per aiutare a determinare vincolante posizione del peptide con il suo obiettivo, come recentemente è stato effettuato per i peptidi associazione Elser e consenso elencati nella Figura 5 1. Nel complesso, biopanning esposizione batterica librerie per i reagenti peptide affinità è un'alternativa veloce, semplice e potente per la produzione di anticorpi per il riconoscimento e la rilevazione di bersagli proteici e questo semi-automatico biopanning approccio ha prodotto risultati affidabili con applicazioni di vasta portata.

Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta del reagente di affinità, con batterico visualizzare librerie una fonte conveniente per peptide affinità reagenti 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Allo stesso modo dei fagi di visualizzazione 25,26 e lievito visualizzare 27,28, i peptidi sono esposti sulla superficie delle cellule e sono disponibili da associare agli obiettivi sia biotici ed abiotici, con queste interazioni guidato da sia la spina dorsale del peptide e le proprietà uniche delle catene laterali dell'amminoacido 29. In contrasto con visualizzazione dei fagi, i batteri stessi sono auto-replicanti e contengono tutto materiale genetico necessario per la visualizzazione senza eluizione del fago associato e reinfezione delle cellule. In contrasto con visualizzazione di lievito, display batterica è più veloce a causa il rapido (circa 20 min 30) raddoppiando il tempo di Escherichia coli. I reagenti di affinità del peptide risultante possono essere prodotto fuori cella da utilizzare in una varietà di piattaforme 16,17,26 di rilevamento e hanno il potenziale per uso come materiali viventi quando visualizzato su-cell 2 , 31 , 32. rispetto agli anticorpi monoclonali per il riconoscimento di obiettivi specifici, i peptidi sono molto più piccole e più flessibili, e librerie visualizzazione del peptide possono essere facilmente manipolate a livello del DNA, per evitare gli aminoacidi specifici, quale cisteina 33 . Peptidi sono sempre più sfruttati per terapeutica 34,35,36 e altre applicazioni dove gli anticorpi in genere sarebbero utilizzati a causa della loro facilità di individuazione, riproducibile sintetico (cella ) produzione e manutenzione superiore di prestazioni in ambienti estremi, fornendo un reagente funzionale anche dopo l'esposizione ad alte temperature o stoccaggio a lungo termine senza refrigerazione 37,38. La capacità di superare la catena del freddo per la conservazione dei reagenti è di particolare interesse per il dipartimento della difesa, per esempio, che deve operare in ambienti estremi. Stabilità termica è stata pertanto una caratteristica desiderabile per i reagenti di affinità riconoscendo le destinazioni selezionate date come esempi in questo manoscritto.
Recentemente, librerie di visualizzazione batterica di biopanning è diventato ancora più semplice e affidabile con l'uso di semi-automatica magnetico-attivato delle cellule ordinamento (MACS o MCS) metodi 9,14,39. Questi metodi sono stati dimostrati per bersagli biologici utilizzando diversi simili piattaforme con diversi vantaggi, tra cui un commercialmente disponibile di ordinamento automatizzato magnetico-attivato delle cellule (autoMACS o autoMCS) strumento di ordinamento (Vedi tabella di materiali) 1,14,15 e dispositivi più specializzati che racchiudono il campione in una cartuccia usa e getta 7,9 o chip 39, una preziosa specifica per l'uso con gli organismi o le tossine che sono di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) o superiore7. Questi metodi semi-automatizzati potrebbero essere esteso per ordinare per peptidi in grado di legarsi ai materiali abiotici in se i materiali sono magnetici o hanno la capacità di essere rivestito su magnetic beads e per l'uso con diversi organismi (come batteri anaerobici) se l'ordinamento e le condizioni di crescita sono alterate. Oltre alle librerie visualizzazione batterica di ordinamento, lo strumento di autoMCS commerciale utilizzato qui anche è stato utilizzato in parte per le fasi iniziali della scoperta di frammenti di anticorpo umano a catena singola visualizzata sulla superficie del lievito, seguita da ulteriore isolamento utilizzando fluorescente attivato Cell Sorting (FACS) 40. I vantaggi primari ad semi-automazione sono diminuiti ordinamento tempo e fatica e più robusto e riproducibile eliminazione delle cellule non associate da biglie magnetiche durante le fasi di lavaggio, che porta alla riduzione di falsi positivi, meno giri di ordinamento richiesti e meno complicati downstream analisi 9,14. Nel caso lo strumento commerciale autoMCS, ci sono più programmi pre-caricati che possono essere ottimale per diverse applicazioni, quali negativo pre-ordinamento (svuotamento), priorità purezza, minimizzando il volume di campione finale e aumentando o diminuendo la sensibilità per l'isolamento di cellule rare 41.
Il focus di questo lavoro è dimostrare la metodologia per biopanning una biblioteca di esposizione batterica utilizzando lo strumento di autoMCS disponibili in commercio e di esporre il processo di pensiero applicato nell'analisi e riducendo al minimo la piscina risultante dei candidati in al fine di facilitare l'estensione ad altre applicazioni. La libreria di display utilizzata qui (Vedi tabella materiali) 12,13 contiene circa 109- 1011 15-mer unico peptidi visualizzati tramite una versione modificata della proteina della membrana esterna batterica OmpX in un natura non vincolata alla superficie delle cellule, che dovrebbe essere rappresentativo del peptide libero in soluzione, se prodotta sinteticamente. Questa impalcatura di proteine inoltre contiene un peptide di controllo positivo P2X al C-terminale per il monitoraggio di espressione attraverso il legame YPet Mona. Tuttavia, una biblioteca acquistata o romanzo con diversità adatto e altre caratteristiche necessarie per l'applicazione specifica desiderata dovrebbe funzionare allo stesso modo con questa procedura di biopanning, anche se alcuni cambiamenti minori possono essere richiesti. Nella Figura 1è illustrato uno schema di questo protocollo di biopanning. Inoltre, il protocollo potrebbe essere adattato ad altri automatizzato piattaforme ordinamento magnetici e altre strategie di ordinamento. Cernita manuale magnetico con un magnete di benchtop è stata dimostrata con successo, anche se con analisi a valle più complicato e che richiede tempo richiesto dovuto aumentato falsi positivi 14e ciò nonostante fornisce un'opzione alternativa per la autoMCS passi se nessuna cella magnetica automatica l'ordinamento dispositivo è disponibile.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>Separatore cellulare automatizzato per l'uso con microsfere magnetiche Luria</td></tr><tr><td>Brodo, Miller (LB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Terreno di crescita</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-500</td><td>Agente</td></tr> <tr><td>addensante/gelificanteeCPX 3.0 Libreria di peptidi con display batterico</td><td>Cytomx Therapeutics</td><td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td> <td>Libreria di visualizzazione di peptidi su cellule. Fornito dai collaboratori dell'USCB.</td></tr><tr><td>L-arabinosio</td><td>Sigma</td><td>A3256-500G</td><td>Zucchero, per l'induzione dell'espressione proteica</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4 (PBS)</td><td>Amresco</td><td>0780-10L</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina, No-Weigh</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21327</td><td>Aggiunge la molecola di biotina alle ammine primarie</td></tr><tr><td>Pierce Kit di quantificazione della biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI28005</td><td>Assicura che la molecola di biotina sia legata in modo covalente alla proteina</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>Perle magnetiche per la cattura delle proteine congugate con biotina</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td>Proteina, utilizzata come agente bloccante per il legame non specifico</td></tr> del <tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>Zucchero, per la crescita e l'impedimento dell'espressione proteica inducibile</td></tr><tr><td>Ypet Mona</td><td>UCSB e ARL</td><td>N/A</td><td>Controllo positivo per il monitoraggio dell'espressione di eCPX 3.0. Prodotto da autori e collaboratori; Vedere i riferimenti 12 e 13.</td></tr><tr><td>Dylight 488 NHS Ester</td><td>Thermo Scientific</td><td>46403</td><td>Per coniugare il bersaglio proteico al fluoroforo</td></tr><tr><td>Streptavidina, R-Ficoeritrina coniugato (SAPE)</td><td>Thermo Scientific</td><td>S866</td><td>Controllo negativo per il monitoraggio del legame non specifico alla streptavidina</td></tr><tr><td>BD FACSFlow</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>342003 Buffer per l'esecuzione di colonne</td></tr> <tr><td></td><td>autoMACS per strumenti FACSMiltenyi Biotech</td><td>130-021-101</td><td>per la separazione MACS</td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer &ndash; Tampone di separazione MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td>Per la manutenzione degli strumenti autoMACS. Pericolo: contiene lo 0,09% di azide.</td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio autoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-987</td><td>Per la manutenzione degli strumenti autoMACS</td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td>VWR</td><td>E505-4L</td><td>Decontaminazione di autoMACS</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G6279-1L</td><td>Per scorte di congelamento batterico</td></tr><tr><td>Chill 15 rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-952</td><td>Per la separazione MACS</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton, Dickinson e società</td><td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td><td>Per la valutazione del legame dei peptidi al bersaglio</td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton, Dickinson e società</td><td>659523</td><td>Per la valutazione del legame dei peptidi al concentratore di</td></tr><tr><td>particelle magnetiche Dynabeads MPC-S</td><td>bersaglio Thermo Scientific</td><td>A13346</td><td>Separatore cellulare da banco per l'uso con biglie magnetiche</td></tr><tr><td>Sequenziamento di colonie</td><td>Genewiz</td><td>N/A; Servizi di sequenziamento https://www.genewiz.com/</td> <td>DNA e colonie</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td><td>Per l'uso con macro di analisi di sequenza</td></tr><tr><td>Antigene protettivo dell'antrace (PA)</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td><td>171</td><td>Proteina bersaglio utilizzata come esempio per risultati rappresentativi.</td></tr><tr><td>Abrax</td><td>ECBC e ARL</td><td>N/A</td><td>Proteina bersaglio utilizzata come esempio per risultati rappresentativi. Prodotto da autori e collaboratori; Vedere i riferimenti 1 e 15.</td></tr><tr><td>Rivax</td><td>ECBC e ARL</td><td>N/A</td><td>Proteina bersaglio utilizzata come esempio per risultati rappresentativi. Prodotto da autori e collaboratori; Vedere i riferimenti 1 e 15.</td></tr></tbody></table>

biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta di reagente di affinità del peptide per il riconoscimento degli obiettivi sia biotici e abiotici. I reagenti di affinità del peptide possono essere utilizzati per applicazioni simili agli anticorpi, tra cui rilevamento e terapeutica, ma sono più robusti e in grado di eseguire in ambienti più estremi. Arricchimento specifico degli agenti di acquisizione di peptide ad un target di proteina di interesse è migliorata utilizzando metodi di ordinamento semi-automatizzati che migliorare associazione e lavare i passaggi e quindi diminuiscono l'avvenimento dei raccoglitori di falsi positivi. Un metodo di ordinamento semi-automatico è descritto nel presente documento per uso con una commerciale automatizzata magnetico attivato cella ordinamento dispositivo con un display batterico senza vincolato ordinamento biblioteca esprimendo casuale 15-mer peptidi. Con lievi modifiche, questi metodi sono estensibili ad altri automatizzato dispositivi, altre librerie di ordinamento e altri organismi. Un obiettivo primario di questo lavoro è quello di fornire una metodologia globale ed esporre il processo di pensiero applicato nell'analisi e riducendo al minimo la piscina risultante dei candidati. Queste tecniche includono l'analisi di associazione sul cellulare mediante fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), per valutare l'affinità e specificità durante l'ordinamento e nel confronto tra singoli candidati, e l'analisi del peptide sequenze per identificare tendenze e sequenze di consenso per capire e potenzialmente migliorare l'affinità e specificità per la destinazione di interesse.

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta dei reagenti di affinità del peptide, un'alternativa affidabile agli anticorpi. Il metodo di ordinamento semi-automatizzato nel presente documento ha razionalizzato biopanning per ridurre l'occorrenza di falsi positivi. Qui illustriamo il processo di pensiero e tecniche applicate nella valutazione dei candidati e minimizzazione dell'analisi a valle.

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Gli obiettivi generali di questa procedura di bio-panning sono isolare rapidamente agenti di cattura peptidici per un particolare bersaglio proteico di interesse ed eliminare in modo rapido ed efficace i candidati non specifici dall'ulteriore analisi a valle. Questo metodo può essere utilizzato per la scoperta di reagenti peptidici ad affinità robusta in diverse applicazioni, dal rilevamento di minacce biologiche alla diagnosi di malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i reagenti peptidici ad affinità possono essere isolati rapidamente in circa una settimana senza richiedere una formazione particolarmente approfondita.Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per scoprire reagenti peptidici ad affinità per uso extracellulare, i peptidi potrebbero anche essere impiegati come materiali viventi. In generale, l'aspetto più complesso per chi si approccia per la prima volta a questo metodo è l'analisi sequenziale a valle dei candidati, che interagisce fortemente con i protocolli sperimentali qui mostrati. Il bio-panning di librerie a esposizione batterica è un processo ciclico che inizia con un arricchimento negativo contro le microsfera magnetiche stesse, al fine di rimuovere eventuali leganti non specifici per il materiale delle microsfere o per eventuali proteine di cattura associate.La frazione negativa che non si lega alle perle magnetiche deve essere conservata. Si può eseguire un'ulteriore selezione negativa contro eventuali bersagli proteici con reattività incrociata, e nuovamente si conserva la frazione negativa che non si lega alle perle magnetiche. I successivi passaggi di selezione positiva sono molto simili alla selezione negativa contro un bersaglio proteico, ma in questo caso si conserva la frazione positiva legata alle perle magnetiche.Per il sorting positivo della libreria con visualizzazione batterica, inoculare innanzitutto 500 millilitri di Luria Broth Miller supplementato con cloramfenicolo, o LBCM-25, con circa 1 × 10¹¹ cellule di una libreria diversificata per il sorting con visualizzazione batterica precedentemente privata di peptidi indesiderati mediante sorting negativo. Incubare la libreria a 37 gradi Celsius a 225 giri al minuto fino a quando la coltura raggiunge un OD 600 compreso tra 0,5 e 0,55. Indurre quindi l'espressione del peptide con il 0,04% di L-arabinosio per 45 minuti a 37 gradi Celsius sotto agitazione.Al termine del periodo di induzione, mettere la coltura sul ghiaccio. E raccogliere due volte dieci alla undicesima cellule batteriche mediante centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in 1,5 millilitri di PBS con un leggero movimento rotatorio.E suddividere i batteri in più tubi microcentrifuga, secondo necessità, per una seconda centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in un millilitro di PBS integrato con la biotinilazione della proteina bersaglio di interesse, per un'incubazione di 45 minuti a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante. Nel frattempo, lavare 100 microlitri di microsferette codificate con streptavidina in un millimetro di PBS aggiunto di albumina sierica bovina, o BSA, mediante centrifugazione.Posizionare le perle lavate in un separatore magnetico da banco ed eliminare con attenzione il sopranatante, avendo cura di non disturbare il pellet. Alla fine dell'incubazione rotante, centrifugare le cellule per raccogliere qualsiasi bersaglio non legato nel sopranatante e risospendere il pellet cellulare batterico con la proteina bersaglio legata in un millilitro di PBS aggiunto di BSA. Utilizzare l'intero volume di cellule batteriche per risospendere il pellet delle perle.Incubare a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante per 30 minuti. Successivamente, posizionare la soluzione di perle e batteri sul ghiaccio. Accendere lo strumento Auto Max per inizializzare il sistema e selezionare "wash now", "rinse" ed "run" nel menu di separazione per preparare i tubi con i tamponi di lavaggio e di esecuzione forniti dal produttore.Al termine del lavaggio, eseguire una nuova prime delle linee utilizzando il buffer PBS con BSA. Quando lo strumento è pronto, trasferire la miscela di batteri e perline in una provetta conica da 15 millilitri e risciacquare la provetta con ulteriori 500 microlitri di PBS fresco con BSA. Recuperare il lavaggio contenente la miscela di batteri e perline e posizionare la provetta nello slot del portaprovette conico a quattro gradi Celsius.Posizionare provette da raccolta vuote da 15 millilitri negli alloggiamenti per la selezione positiva e negativa del rack e trasferire il rack sulla piattaforma dello strumento. Assegnare un programma di separazione per ogni campione presente sul rack, aggiungendo un passaggio di risciacquo tra ogni campione e dopo l'ultimo campione. Selezionare esegui per avviare la separazione cellulare e okay o continua per confermare la disponibilità di quantità sufficiente di tampone.Al termine del programma, rimuovere il rack e posizionare la frazione positiva, contenente sia i batteri che le perle, sul ghiaccio. Dopo aver preparato le linee come appena dimostrato, utilizzando i tamponi di esecuzione e lavaggio del produttore, selezionare accensione e sì per spegnere lo strumento e verificare che nella bottiglia della soluzione di conservazione sia presente etanolo al 70% per la decontaminazione. Quando lo spegnimento del sistema sarà completato, le bottiglie diventeranno viola.La macchina può essere spenta. Successivamente, utilizzare l'intera frazione positiva ottenuta dal sorting per inoculare un litro di LBCM25 integrato con D-glucosio, per una coltura notturna a 37 gradi Celsius con agitazione. Per analizzare il successo dell'isolamento del reagente di affinità dopo ogni ciclo di sorting, alla fine dell'induzione del peptide post-sorting, aggiungere cinque microlitri di cellule indotte a 25 microlitri delle soluzioni indicate nella tabella.Dopo un'incubazione di 45 minuti sul ghiaccio, raccogliere i batteri in ciascuna soluzione mediante centrifugazione ed aspirare il sopranatante da ogni campione. Con i tubi del campione sul ghiaccio, selezionare amministratore nel software dello strumento FAX e aprire la cartella di analisi appropriata. Fare clic su nuovo esperimento.Quindi fare clic con il tasto destro per rinominare l'esperimento e fare clic su fogli di lavoro globali. Fare clic sull'icona del grafico a punti nel foglio di calcolo del foglio di lavoro globale per creare un nuovo grafico a dispersione. Successivamente, selezionare il grafico a punti stesso e selezionare l'icona dell'ispettore.Fare clic sulle caselle accanto agli assi X e Y nella finestra aperta per regolare gli assi su una visualizzazione bi-esponenziale e chiudere la finestra dell'ispettore. Fare clic sull'esperimento e creare un nuovo campione, facendo clic con il tasto destro per rinominare il campione in base alle esigenze sperimentali. Quindi fare clic sul segno più per espandere il campione e rinominare il campione.Per eseguire un campione di controllo negativo, risospendere il pellet contenente solo PBS in 500 microlitri di tampone di corsa FAX freddo su ghiaccio, mescolando accuratamente mediante pipettaggio. Trasferire il campione in una provetta FAX, agitando delicatamente per mantenere le cellule in sospensione, e caricare il campione nel tubo di iniezione del campione o SIT dello strumento. Fare doppio clic sulla provetta del campione corrente e fare clic su "acquired data".Quindi visualizzare gli eventi nel grafico a dispersione di area di scatter laterale rispetto a scatter anteriore precedentemente preparato, regolando la soglia di tensione del tubo fotomoltiplicatore nella scheda soglia secondo necessità, in modo che le cellule del controllo negativo si posizionino vicino al centro. Quando il campione viene letto correttamente, regolare la velocità di flusso in modo da visualizzare da 200 a 2.000 eventi al secondo e fare clic su registra dati per acquisire un minimo di 10.000 eventi. Al termine dell'acquisizione di tutti gli eventi, rimuovere il tubo del campione dal SIT.Selezionare l'icona del cancello poligonale e disegnare un cancello attorno alla maggior parte della popolazione cellulare nel grafico a dispersione. Fare clic con il tasto destro sul grafico a punti per selezionare "Mostra gerarchia delle popolazioni" e fare clic su P1 nella gerarchia delle popolazioni, quindi creare un nuovo grafico a punti per visualizzare la popolazione P1. Fare clic con il tasto destro su ciascun asse per impostare l'asse Y sull'area FITC e l'asse X sull'area dello scatter in avanti, quindi regolare gli assi su una visualizzazione bi-esponenziale.Utilizzare la finestra poligonale per delimitare le cellule del controllo negativo il più strettamente possibile lungo i lati superiore e sinistro della popolazione e selezionare P2 nella gerarchia delle popolazioni, quindi fare clic con il tasto destro per scegliere l'opzione "inverti finestra". Meno dell'1% della popolazione deve trovarsi al di fuori della finestra. Fare clic con il tasto destro sul diagramma a punti con la finestra P2 per selezionare "mostra popolazioni" e scegliere le popolazioni P2 e non P2 da visualizzare.Quindi fare clic con il tasto destro sul diagramma a punti con la finestra P2 per selezionare "crea vista statistiche" e fare clic con il tasto destro sulla finestra della vista statistiche per selezionare "modifica vista statistiche". Nella scheda popolazioni, aggiungere o rimuovere le popolazioni in base alle necessità, inclusa la popolazione genitrice P1. P2 e non P2 dovrebbero essere già visualizzati.Quindi, nella scheda statistiche, aggiungere l'area media FITC e qualsiasi altra statistica di interesse e fare clic su OK per chiudere la finestra. Fare clic con il tasto destro sul grafico a dispersione P2 e selezionare duplica per creare un grafico a punti simile per l'area PE rispetto all'area FSC. Regolare l'asse Y e utilizzare il campione con solo PBS per delimitare la popolazione P3.Quindi invertire il gate. E visualizzare le popolazioni appropriate. Una volta impostati tutti i gate appropriati, utilizzare il foglio di calcolo per analizzare tutti i campioni, registrando circa 10.000 eventi per provetta.Come in questo esperimento rappresentativo, il legame di Ypet Mona a un peptide di controllo positivo fissato può aiutare a monitorare il livello di espressione della libreria di peptidi indotta all'interno della popolazione. Le cellule che non presentano peptidi sulla superficie vengono generalmente eliminate durante il processo di selezione, come osservato nei terzo e quarto round. L'arricchimento della libreria per peptidi che si legano alla specifica molecola bersaglio di interesse viene tipicamente ottenuto entro tre round di selezione positiva.Proseguire con un quarto ciclo di selezione può essere vantaggioso poiché le sequenze peptidiche con affinità più elevata già presenti nel terzo ciclo sono probabilmente ulteriormente arricchite nel quarto ciclo, facilitando la riduzione del numero di candidati potenziali. La specificità viene valutata confrontando il legame al bersaglio previsto con il legame a eventuali bersagli potenzialmente reattivi incrociati, come quelli utilizzati per la selezione negativa. L'analisi delle sequenze ottenute al quarto ciclo di selezione rivela tipicamente sequenze ripetute, che rappresentano ottimi punti di partenza per le analisi di affinità e specificità.L'analisi dell'allineamento delle sequenze può essere utilizzata per rivelare la presenza di una sequenza consenso che facilita la selezione dei candidati. Una colonia rappresentativa per ciascuna sequenza ripetuta può quindi essere ulteriormente analizzata in base ai dati sull'affinità e specificità direttamente sulla cellula, al fine di valutare il legame del peptide con la proteina bersaglio e con proteine cross-reattive. Una volta acquisita padronanza, un intero esperimento biologico con analisi iniziale di affinità e specificità può essere completato in meno di due settimane, se eseguito correttamente.Quando si esegue l'intera procedura, è importante ricordare che potrebbe essere necessario alternare più volte tra la valutazione del legame e le analisi di sequenza per comprendere appieno il processo coinvolto nell'affinità di legame. Abbiamo incluso un file macro supplementare che abbiamo sviluppato per automatizzare gran parte dell'analisi dei peptidi e per ottimizzare ulteriormente la selezione dei candidati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare rapidamente agenti di cattura peptidici da una libreria con visualizzazione batterica e di come eliminare i candidati non specifici da ulteriori analisi a valle.Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come ALIZA per confermare l'affinità e la specificità del legame alle cellule non target.

semi-automated-biopanning-bacterial-display-libraries-for-peptide

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo video dimostra un metodo per studiare le interazioni proteina-farmaco utilizzando la biopanoramica basata su biosensore QCM della libreria di peptidi visualizzati dai fagi T7. La biopanazione di fagi che visualizzano un peptide specifico sul biosensore QCM consente l'isolamento specifico di peptidi ad alta affinità, seguito dal sequenziamento degli amminoacidi, che aiuta a identificare siti di interazione specifici sulla proteina bersaglio.

Biopanning basato su biosensori per microbilance a cristalli di quarzo per studiare le interazioni proteina-farmaco

Questo video mostra una tecnica che applica la tecnologia dei microarray di peptidi per profilare la specificità degli anticorpi che riconoscono le modifiche post-traduzionali (PTM) sui peptidi istonici. Un vetrino di microarray contenente peptidi istonici immobilizzati coniugati con fluorofori con combinazioni note di PTM viene trattato con anticorpi specifici per PTM target. Questo processo aiuta a identificare la specificità dell'anticorpo per il bersaglio e la sua potenziale reattività...

Una tecnologia di microarray peptidici per la profilazione della specificità degli anticorpi

Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

Forniamo un metodo per lo screening simultaneo di una libreria di frammenti di anticorpi per l'affinità di legame e la solubilità citoplasmatica utilizzando la via di traslocazione gemella-arginina di Escherichia coli, che ha un meccanismo di controllo della qualità intrinseco per il ripiegamento intracellulare delle proteine, per visualizzare i frammenti di anticorpi sulla membrana interna.

Display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Qui presentiamo un metodo per selezionare per nuove varianti della ligase biotina-proteina E. BirA che biotinyili uno specifico peptide bersaglio. Il protocollo descrive la costruzione di un plasmide per la visualizzazione batterica del peptide bersaglio, la generazione di una libreria BirA, la selezione e la caratterizzazione delle varianti BirA.

Visualizzazione del peptide batterico per la selezione di nuovi enzimi biotinylami

La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l'affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l'ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

L'interazione tra i canali HCN e la loro subunità accessoria è stato identificato come un obiettivo terapeutico nel Disturbo Depressivo Maggiore. Qui, un metodo di polarizzazione basato fluorescenza per identificare piccole molecole inibitrici di questa interazione proteina-proteina, è presentato.

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Scopri il biopanning semi-automatizzato per isolare reagenti peptidici ad affinità da librerie batteriche. Questo metodo riduce i falsi positivi e accelera la scoperta di agenti di cattura specifici per applicazioni diagnostiche.

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e lanalisi degli isolati risultanti (Video) | JoVE Journal

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

Esplora altri video