Name: High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per identificare proteine che inducono memoria fenotipica duratura in Saccharomyces cerevisiae. Questa tecnica consente di esplorare l'eredità basata sulle proteine in modo imparziale.

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Ringraziamo Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She e Susan Lindquist per la loro assistenza nello sviluppo i dosaggi utilizzati in questa carta, come pure gli utenti per i loro commenti riflessivo.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I prioni lievito primi sono stati identificati dai loro fenotipi insoliti e perplessi modelli di ereditarietà. Le caratteristiche di questi prioni furono poi utilizzate per costruire algoritmi e strumenti computazionali alla schermata per proteine prioniche aggiuntive. Il metodo descritto qui, al contrario, è sperimentale e si basa sulla sovraespressione transitoria per creare un duraturo cambiamento-a stabile stato codificato nella conformazione della proteina. Tuttavia, se l'efficienza di "semina" Assemblea del prion d...

Sistemi biologici spesso esperienza transitorie fluttuazioni in abbondanza di proteine. Se questi hanno un impatto duraturo nel plasmare il fenotipo di un organismo o delle generazioni future rimane poco chiaro. I più noti casi di questa biologia coinvolgono una rara classe di proteine, i prioni, che guidano l'emergere dei tratti ereditari senza alcuna modifica del genoma. Invece, queste particelle di fectious proteinaceous e neltrasmettono fenotipi tramite auto-perpetuante cambiamenti di conformazione della proteina1,2. Questo tipo di ereditarietà è stato scoperto come la causa dei modelli di ereditarietà insoliti di una devastante malattia neurodegenerative. Tuttavia, gli studi negli organismi che variano dai funghi ai mammiferi3,4,5,6,7,8,9,10 da allora hanno rivelato che il prione-come gli elementi possono conferire valore adattativo. Ciò nonostante, i prioni sono stati visti come un affascinante ma rara stranezza biologica.
Questa saggezza prevalente si svolge in parte perché la caratterizzazione di base proteica eredità lungo è stata limitata da un piccolo insieme di esempi. I recenti sforzi di screening sistematico hanno ampliato significativamente questa immagine individuando diversi nuovi bona fide prioni11 e quasi due dozzine di proteina domini12 con la capacità di conversione conformazionali del prione-come combustibile. Tuttavia, poiché questi approcci sono generalmente concentrati su pregiudizi di sequenza dell'amminoacido forte, i prioni che sono stati scoperti condividono le proprietà biochimiche del fondatore lievito prioni [PSI+]13,14, [URE3]15e [RNQ+]11,16. Questi includono: 1) modulare domini che sono ricchi di tratti lungo polimerici di asparagina (N) e glutammina (Q), 2) assembly in un amiloide [PRION+] conformazione17,18,19e 3) completano dipendenza da disaggregase funzione di Hsp104 per la propagazione di fedeli da madre a figlia13,20,21. Infatti, molti bona fide prioni, tra cui [GAR+], [Het-s] e anche l'originale del prion (PrPSc), sarebbe saltato sotto tali criteri rigorosi. Forse ancora più importante, sarebbero in grado di catturare qualsiasi nuovi meccanismi di ereditarietà su base proteica22. Quindi, l'ampiezza biologica vera di tali fenomeni può essere molto più comune in natura di quanto si pensasse.
Per studiare questa domanda, una strategia di alto-rendimento, tutto il proteoma è stato impiegato. Un segno distintivo di tutti i prioni, tra cui PrPSc, [GAR+], e [Het-s], è che la sovraespressione transitoria delle proteine causale aumenta fortemente il tasso del prione acquisizione15,23,24,25,26. Abbiamo approfittato di questa funzionalità per sistematicamente chiedere, su tutto il lievito ORFeome, se stati stabili basati su proteine, epigenetici potrebbero essere iniziati inducendo transitoriamente la sovraespressione delle singole proteine. È ben noto che la sovraespressione della proteina può alterare fenotipi27. Tuttavia, proteine prioniche sono insoliti perché loro sovrapproduzione temporanea produce un cambiamento nel fenotipo che è ereditabile per molte centinaia di generazioni dopo la sovraespressione iniziale. Abbiamo precedentemente preso vantaggio di questa funzione, così come i modelli di ereditarietà insoliti di elementi genetici basati su proteine, per identificare decine di proteine che sono in grado di heritably necessità di cablaggio fenotipiche paesaggi senza alterare il genoma28. Anche se alcuni identificati proteine precedentemente erano conosciuti come i prioni, la maggior parte erano non, sottolineando la potenza di questo approccio per scoprire nuove forme di ereditarietà a base di proteine.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato di guanidina</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Cloruro</td></tr> di <tr><td>manganese</td> chimico <td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Bromuro di</td></tr><tr><td>etidio</td><td>chimico Sigma</td><td>E1510</td><td>Acido</td></tr><tr><td>5-fluoroorotico</td> chimico <td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Ceppo</td></tr><tr><td>di lievito BY4741 MAT&alpha; (il suo3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2&Delta; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Ceppo di lievito</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>Libreria plasmidico</td></tr><tr><td>FLEXGene</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Libreria plasmidico</td></tr><tr><td>Destrosio (glucosio)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Raffinosio</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Galattosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Componente media</td></tr><tr><td>peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Componente media</td></tr><tr><td>bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Componente media</td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Componente media</td></tr><tr><td>lievito base di azoto senza aminoacidi</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Componente media</td></tr><tr><td>agar</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Adenina solfato</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Istidina</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>biotinilato DNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>zimoliasi 100T (enzima litico del lievito)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Lettore di micropiastre enzimatico</td></tr><tr><td></td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Impilatore</td></tr> di <tr><td>micropiastre</td><td>BioTek BioStack3</td><td></td><td>Piastra per apparecchiature</td></tr><tr><td> riempitrice</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Robot per la manipolazione dei liquidi</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Attrezzatura</td></tr></tbody></table>

high throughput screening per eredità a base di proteine in s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

La codifica di informazioni biologiche che sono accessibile alle generazioni future è generalmente ottenuta tramite modifiche alla sequenza di DNA. Longeva eredità codificati in proteina conformazione (anziché sequenza) lungamente è stato osservato come lo spostamento di paradigma, ma rara. Esempi di tali elementi epigenetici meglio caratterizzati sono i prioni, che possiedono un comportamento auto-assemblante che può guidare la manifestazione ereditabile di nuovi fenotipi. Molti prioni archetipici visualizzare un notevole pregiudizio sequenza N/Q-ricco e assemblare un ovile dell'amiloide. Queste caratteristiche insolite hanno informato la maggior parte degli sforzi di screening per identificare nuove proteine prioniche. Tuttavia, almeno tre prioni noti (tra cui il prione fondatore, PrPSc) non porto queste caratteristiche biochimiche. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo alternativo per sondare l'ambito dell'eredità a base di proteine basata su una proprietà di azione di massa: la sovraespressione transiente di proteine prioniche aumenta la frequenza in cui acquisiscono una conformazione di auto-applicazione di modelli. Questo articolo descrive un metodo per analizzare la capacità del lievito ORFeome a suscitare l'ereditarietà a base di proteine. Utilizzando questa strategia, abbiamo trovato in precedenza che &gt; 1% di proteine del lievito potrebbe alimentare l'emergere dei tratti biologici che erano longevi, stabile e ha presentato più di una mutazione genetica. Questo approccio può essere impiegato in elevato throughput attraverso ORFeomes intero o come un paradigma di screening mirato per reti genetiche specifiche o stimoli ambientali. Come schermi genetici avanti definiscono numerose vie di segnalazione e di sviluppo, queste tecniche forniscono una metodologia per indagare l'influenza dell'eredità di base di proteine nei processi biologici.

Si sa che la sovraespressione proteica altera in modo significativo i fenotipi cellulari27. Infatti, con un approccio di screening iniziale, sono stati ottenuti in modo riproducibile centinaia di nuovi fenotipi attraverso la sovraespressione di cloni provenienti dall'ORFeoma del lievito, utilizzando soltanto dieci agenti stressanti. Tuttavia, i saggi descritti in precedenza permettono di valutare se le cellule conservano fenotipi stabili a lungo termine anche dopo ...

Questo protocollo descrive una metodologia di alto-rendimento allo schermo funzionalmente per base di proteine di ereditarietà in S. cerevisiae.

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

L'obiettivo generale di questo fenotipaggio ad alto rendimento del lievito è quello di identificare proteine in grado di indurre una memoria fenotipica duratura derivante da un'espressione precedente, come proxy per l'ereditarietà mediata da proteine. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei prioni del lievito, ad esempio: quante proteine possono indurre questo tipo di ereditarietà? Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di analizzare un gran numero di proteine e vie metaboliche in modo non selettivo.Iniziare questa procedura coltivando le cellule di lievito appropriate in una piastra a 96 pozzetti a 30 gradi Celsius, come descritto nel protocollo testuale. Ispezionare visivamente le colture per confermare che siano saturo, le cellule devono essere visibili ad occhio nudo sul fondo di ogni pozzetto. Utilizzare un robot per la manipolazione di liquidi per preparare piastre a 384 pozzetti, contenenti 45 microlitri del mezzo appropriato per pozzetto.Per prima cosa, distribuire Scal-URA nei pozzetti di una piastra a 384 pozzetti. Successivamente, distribuire Scal-URA insieme allo stressore di interesse nei pozzetti di una seconda piastra; in questo esperimento viene utilizzato cloruro di manganese 20 millimolare come stressore. In terzo luogo, distribuire SD-URA, che non indurrà l'espressione del plasmide, insieme al cloruro di manganese in un'altra piastra.Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenente le colture sul robot per la manipolazione dei liquidi e inoculare un array da uno a quattro di un microlitro da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti in quattro pozzetti separati di ciascuna piastra a 384 pozzetti riempita con un mezzo diverso. Posizionare immediatamente le piastre con le cellule su un impilatore per micropiastre a temperatura ambiente e con anidride carbonica atmosferica. Impostare il protocollo per un ciclo continuo di 72 ore, misurando la densità ottica a 600 nanometri con il lettore di micropiastre.Dopo le misurazioni della crescita, trasferire un microlitro per pozzetto delle colture SCal-URA indotte, che hanno subito un'eccessiva espressione proteica, in nuove piastre a 384 pozzetti contenenti 45 microlitri per pozzetto di mezzo ST-URA, che non permette l'espressione proteica del plasmide. Parallelamente, effettuare inoculi analoghi in un secondo set di piastre a 384 pozzetti contenenti 45 microlitri per pozzetto di ST-URA, partendo dalle colture cresciute in ST-URA in presenza dell'agente stressante. Posizionare le piastre in una camera umidificata e far crescere le colture per 48 ore a 30 gradi Celsius fino alla saturazione.Dopo 48 ore, utilizzare le piastre per reinoculare un microlitro per pozzetto in piastre a 384 pozzetti contenenti 45 microlitri per pozzetto di ST-URA. Successivamente, effettuare un reinoculo separato di un microlitro per pozzetto dalla stessa piastra sorgente in una piastra a 384 pozzetti separata contenente 45 microlitri per pozzetto di ST-URA con l'agente di stress. Posizionare immediatamente le piastre con le cellule sul microstacker a temperatura ambiente e anidride carbonica atmosferica e impostare il protocollo per un ciclo continuo di 48 ore, misurando la densità ottica a 600 nanometri mediante un lettore di micropiastre.Al termine delle misurazioni della crescita, utilizzare il software del lettore di piastre per esportare le misurazioni del tempo rispetto alla densità ottica a 600 nanometri come tabella XY. Raggruppare le colonne delle misurazioni della densità ottica per ogni replicato biologico e calcolare la media. Creare un grafico XY di tempo rispetto alla densità ottica a 600 nanometri per ottenere le curve di crescita.Per colture che presentano differenze significative nella crescita in risposta a un determinato stressore, a seconda della sovraespressione della proteina ancestrale, prelevare un microlitro da ciascun replicato biologico, diluire in 10 millilitri di acqua e quindi piastrare 50 microlitri su piastre contenenti 5-FOA. Incubare a 30 gradi Celsius per tre giorni. Se il numero di colonie per piastra risultasse troppo elevato o troppo scarso, regolare opportunamente il fattore di diluizione.Da 100 a 200 colonie per piastra è l'ideale. Scegliere da otto a 32 colonie singole utilizzando bastoncini di legno sterilizzati in autoclave e trasferirle su piastre a 96 pozzetti contenenti 150 microlitri di SDCSM per pozzetto. Posizionare le piastre in una camera umidificata e far crescere fino alla saturazione per 48-72 ore a 30 gradi Celsius.Utilizzare queste colture per inoculare due nuovi set di piastre a 96 pozzetti contenenti 150 microlitri per pozzetto di SDCSM, sia in presenza che in assenza dell'agente stressante. Posizionare le piastre su un microdispenser per piastre e impostare il protocollo per misurare la densità ottica a 600 nanometri in un ciclo continuo di 48 ore. Dopo 48 ore, analizzare i dati come mostrato in precedenza e verificare che le differenze significative nella crescita osservate in precedenza siano mantenute anche dopo la perdita del plasmide.Le cellule che mantengono i fenotipi indotti vengono quindi sottoposte a test per verificare i caratteristici segni distintivi dell'eredità basata su proteine, come descritto nel protocollo testuale. Questo screening per l'eredità proteica ha rivelato che la sovraespressione transitoria della sequenza codificante aperta di PSP1 determina una resistenza al cloruro di manganese che viene mantenuta per centinaia di generazioni nelle cellule, molto tempo dopo che la sovraespressione è cessata. Algoritmi predittivi di prioni hanno valutato l'estremità C-terminale di PSP1 come moderatamente simile ai prioni.Al contrario, gli algoritmi hanno predetto praticamente nessuna caratteristica significativa di sequenza di tipo prionico per la maggior parte delle proteine induttrici recuperate nel test, come mostrato da questa analisi rappresentativa. Le misurazioni della crescita di ceppi e SDCSM in presenza di cloruro di manganese, normalizzate rispetto a un controllo corrispondente di PSP1 naïve privo di PSP1, hanno indicato che l'inibizione della disgregasi HSP104 non compromette la resistenza al cloruro di manganese dipendente da PSP1, mentre l'eliminazione della chaperonina HSP70 e del gene PSP1 abolisce ereditariamente questo fenotipo. Tutte le spore provenienti da singoli tetradi di incroci tra ceppi che presentano lo stato fenotipico dipendente da PSP1 e ceppi naïve mostrano resistenza al cloruro di manganese, indicando un'ereditarietà non mendeliana del fenotipo.Un confronto dell'infettività per la trasformazione proteica tra lisati di controllo e lisati contenenti PSP1 utilizzati come materiale trasmissibile ha mostrato che oltre il 53% delle cellule naive trasformate con PSP1 inoculato ha acquisito il corrispondente fenotipo di resistenza al cloruro di manganese. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in un paio di settimane, compresi i passaggi di incubazione, e la preparazione della maggior parte delle fasi di screening può richiedere meno di due ore al giorno, anche con un elevato numero di piastre. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di pianificare con precisione ciò che si desidera testare in anticipo e tenere presente la scala dell'esperimento.Ora, questo è particolarmente importante per i principianti della tecnica. Seguendo questa procedura, altri metodi come quelli descritti nel protocollo testuale possono essere eseguiti per determinare se i fenotipi osservati nel test mostrano un vero e proprio modello di ereditarietà di tipo prionica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare l'ampia portata della biologia dei prioni in saccharomyces cerevisiae. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come progettare un test ad alto rendimento per nuove forme di ereditarietà basata su proteine nei lieviti, sia in modo non selettivo che mirato.Non dimenticare che alcuni agenti chimici stressanti, come gli agenti danneggianti il DNA, possono essere estremamente pericolosi e precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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