High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

L'obiettivo generale di questa fenotipizzazione del lievito ad alto rendimento è quello di individuare le proteine che illecitano una memoria fenotipica duratura dell'espressione passata, come proxy per l'ereditarietà basata sulle proteine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del lievito Prione, come ad esempio, quante proteine può ereditare illecitamente di questo tipo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile eseguire lo screening di molte proteine e percorsi in modo imparziale.

Inizia questa procedura facendo crescere le cellule di lievito appropriate in una piastra a 96 pozzetti a 30 gradi Celsius, come descritto nel protocollo di testo. Ispezionare visivamente le colture per confermare che le colture siano sature, le cellule dovrebbero essere visibili ad occhio, sul fondo di ogni pozzetto. Utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per preparare piastre da 384 pozzetti, contenenti 45 microlitri del terreno appropriato per pozzetto.

Innanzitutto, erogare Scal-URA nei pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Quindi erogare Scal-URA più il fattore di stress di interesse nei pozzetti di una seconda piastra, 20 millimolari di cloruro di manganese vengono utilizzati come fattore di stress in questo esperimento. In terzo luogo, dispensare SD-URA, che non indurrà l'espressione plasmidica, più cloruro di manganese in un'altra piastra.

Abbassare la piastra da 96 pozzetti contenente le colture sul robot per la manipolazione dei liquidi e inoculare da uno a quattro array di un microlitro da ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti, in quattro pozzetti separati di ogni piastra da 384 pozzetti riempiti con un terreno diverso. Posizionare immediatamente le piastre con le celle su un impilatore di micropiastre a temperatura ambiente e anidride carbonica atmosferica. Imposta il protocollo per un ciclo continuo di 72 ore, misurando la densità ottica a 600 nanometri con il lettore di micropiastre.

Dopo le misurazioni della crescita, trasferire un microlitro per pozzetto delle colture indotte da SCal-URA che hanno sperimentato una sovraespressione proteica in nuove piastre da 384 pozzetti, contenenti 45 microlitri per pozzetto di terreno ST-URA che non consente l'espressione proteica del plasmide. Parallelamente, eseguire inoculazioni analoghe di una seconda serie di piastre da 384 pozzetti contenenti 45 microlitri per pozzetto di ST-URA dalle colture che sono state coltivate in ST-URA in presenza del fattore di stress. Metti le piastre in una camera umidificata e fai crescere le piastre per 48 ore a 30 gradi Celsius fino alla saturazione.

Dopo 48 ore, utilizzare le piastre per reinoculare un microlitro per pozzetto in piastre da 384 pozzetti contenenti 45 microlitri per pozzetto di ST-URA. Quindi, eseguire una reinoculazione separata di un microlitro per pozzetto dalla stessa piastra di origine in una piastra separata da 384 pozzetti contenente 45 microlitri per pozzetto di ST-URA con il fattore di stress. Posizionare immediatamente le piastre con le celle del microstacker a temperatura ambiente e anidride carbonica atmosferica e impostare il protocollo per un ciclo continuo di 48 ore, misurando la densità ottica a 600 nanometri con un lettore di micropiastre.

Una volta completate le misurazioni della crescita, utilizzare il software di lettura delle piastre per esportare il tempo rispetto alla densità ottica alle misurazioni a 600 nanometri come tabella XY. Raggruppare le colonne delle misure di densità ottica per ogni replica biologica e calcolare la media. Crea un grafico XY del tempo rispetto alla densità ottica a 600 nanometri per generare curve di crescita.

Per le colture che hanno scelto differenze di crescita significative in risposta a un dato fattore di stress, dipendenti dalla sovraespressione proteica ancestrale, prelevare un microlitro da ciascuna replica biologica, diluire in 10 millilitri di acqua e quindi impiattare 50 microlitri su piastre contenenti 5-FOA. Coltiva a 30 gradi Celsius per tre giorni. Se ciò si traduce in un numero eccessivo o insufficiente di colonie per piastra, regolare di conseguenza il fattore di diluizione.

L'ideale è da 100 a 200 colonie per piastra. Prelevare da otto a 32 colonie singole con stuzzicadenti in autoclave e fissarle su piastre da 96 pozzetti contenenti 150 microlitri di SDCSM per pozzetto. Metti le piastre in una camera umidificata e cresci fino a saturazione per 48-72 ore a 30 gradi Celsius.

Utilizzare queste colture per inoculare due nuovi set di piastre da 96 pozzetti contenenti 150 microlitri per pozzetto di SDCSM, sia con che senza il fattore di stress. Posizionare le piastre su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per misurare la densità ottica a 600 nanometri su un ciclo continuo di 48 ore. Dopo 48 ore, analizzare i dati come mostrato in precedenza e confermare che le differenze di crescita significative osservate in precedenza si mantengono dopo la perdita di plasmidi.

Le cellule che mantengono i fenotipi indotti vengono quindi testate per i classici segni distintivi dell'ereditarietà basata sulle proteine, come descritto nel protocollo di testo. Questo screening dell'ereditarietà basato sulle proteine ha rivelato la sovraespressione transitoria del frame di lettura aperto PSP1, guida una resistenza al cloruro di manganese che è stata mantenuta per centinaia di generazioni nelle cellule, molto tempo dopo che la sovraespressione era cessata. Gli algoritmi di previsione dei prioni hanno valutato il terminale finale di PSP1 come moderatamente simile ai prioni.

Al contrario, gli algoritmi non hanno previsto praticamente alcuna caratteristica significativa della sequenza simile ai prioni dalla maggior parte delle proteine induttrici recuperate sullo schermo, come mostrato da questa analisi rappresentativa. Le misurazioni della crescita dei ceppi e del SDCSM con cloruro di manganese, normalizzati a un corrispondente controllo naive PSP1 minus, hanno indicato che l'inibizione della disaggregasi HSP104 non compromette la resistenza al cloruro di manganese PSP1-dipendente, mentre la rimozione dello chaperone HSP70 e del gene PSP1 elimina ereditariamente questo fenotipo. Tutte le spore provenienti da singole tetradi di incroci tra ceppi, che ospitano lo stato fenotipico dipendente da PSP1 e ceppi naïve, mostrano resistenza al cloruro di manganese, indicando un'eredità non mendeliana del fenotipo.

Un confronto dell'infettività per la trasformazione proteica tra i lisati finti e PSP1 che ospita lisati come materiale trasmissibile, ha mostrato che oltre il 53% delle cellule naive trasformate con PSP1 seminata, ha ricevuto il corrispondente fenotipo di resistenza al cloruro di manganese. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio di settimane, comprese le fasi di incubazione e la preparazione della maggior parte delle fasi di screening può essere eseguita in meno di due ore al giorno, anche con un gran numero di piastre. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di pianificare esattamente ciò che si desidera testare in anticipo e tenere presente la scala dell'esperimento.

Ora questo è particolarmente importante per i principianti della tecnica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come quelli descritti nel protocollo di testo, per determinare se i fenotipi osservati nello screening mostrano un vero e proprio modello di ereditarietà simile ai prioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare l'ampiezza della biologia dei prioni nel servizio sacrale CI.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare uno screening ad alto rendimento per nuove forme di ereditarietà a base di proteine nel lievito, in modo imparziale e mirato.

Non dimenticare che alcuni fattori di stress chimico come gli agenti che danneggiano il DNA possono essere estremamente pericolosi e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale.