Name: Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara a creare un ponte con cellule di Schwann in un condotto polimerico per rigenerare assoni nel midollo spinale del ratto. Questa tecnica chirurgica promuove la guarigione delle lesioni spinali.

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Vorremmo ringraziare il vettore virale e animale core nel progetto di Miami alla cura paralisi per produrre la cura degli animali lenti-GFP-virus e fornendo, rispettivamente e l'istologia e Imaging Core per l'uso del criostato, microscopio confocale, e microscopio a fluorescenza con Stereo Investigator. Finanziamento è stato fornito da NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge è il Christine E Lynn distinto professore di neuroscienze.

femmina ratti Fischer adulti (peso corporeo di 180-200 g) sono alloggiati secondo linee guida NIH e USDA. L'Animal Care istituzionali ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Miami ha approvato tutte le procedure di animali.
 1. preparazione pre-trapianto <ol><li>preparazione Conduit.
	<ol><li>Poi tagliato a 5 mm di lunghezza con una lama #10 sotto un microscopio per dissezione. 
		Nota: Il diametro interno del condotto è tra 2.4-2.7 mm; il diametro esterno è fra 2.5-2.8 mm.</li>
		<li>Piegare il tubo dolcemente lungo il lato longitudinale ( Figura 1A). Tagliare quattro piccole incisioni circa 0,4 mm di lunghezza e almeno 1 mm dalle aperture del condotto e circa 1 mm a pezzi con bordo dritto Allerød forbici ( Figura 1B).
		<ol><li>Aprire il condotto ( Figura 1) e tagliare tra due incisioni lungo lo stesso lato creando due finestre affiancate ( Figura 1). Assicurarsi che le finestre possono essere aperto e chiuso correttamente lungo il lato uncut.</li>
		</ol></li> <li>Sterilizzare i condotti in etanolo di 75% per 25 min in una capsula Petri 10 cm. Sciacquare i condotti una volta per 4 min con 1x tamponato fosfato salino (PBS) e i condotti di trasferimento con pinze sterili per un nuovo piatto di Petri di 10 cm. Sciacquare i condotti due volte con PBS 1X per 25 minuti ciascuno,.</li>
		<li>Conservare i condotti in PBS 1X fino alla chirurgia. 
		Nota: Molti condotti possono essere sterilizzati in una sola volta. Conservare i condotti in provette da centrifuga separata sterili da 1,5 mL per mantenerli sterili.</li>
	</ol></li> <li>Verde proteina fluorescente (GFP)-preparazione delle cellule di Schwann (SC) <ol><li>preparare colture purificate di SC dai nervi tibiali del Fischer femmina adulto ratti come descritto in precedenza 43. Al completamento di questo passaggio, piastra SCs su poli-L-lisina (PLL)-rivestito-10cm di Petri e mantenere in mezzo D10 / 3M; questi SCs sono definiti come passaggio 0. 
		Nota: D10 / 3M medium è composto dei seguenti: Estratto 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina-streptomicina (pen/strep), ipofisi di 20 µ g/mL, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin in Dulbecco &#39; s modificato Eagle &#39; medium (DMEM) di s.</li>
		<li>Ricostituire con medium fresco D10/3M (7 mL/10 cm di Petri) ogni 3-4 giorni.</li>
		<li>Cultura Split SC una volta che raggiunge la confluenza di 70-80%.
		<ol><li>Medio di rimuovere e sciacquare due volte con Hank &#39; soluzione salina (HBSS) senza calcio o magnesio equilibrata di s.</li>
			<li>Aggiungere 5 mL di tripsina/EDTA 0,25% per ogni 10 cm di Petri e incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA).</li>
			<li>Aggiungere 5 mL di mezzo di D10 (10% FBS e 1% pen/strep in DMEM) in una provetta da centrifuga da 50 mL per neutralizzare la tripsina.</li>
			<li>Delicatamente dispensare la tripsina/EDTA soluzione in Petri piatto più volte per staccare SCs. rimuovere la sospensione cellulare dal piatto e inserire la provetta da centrifuga preparato nel passaggio precedente. Risciacquare il piatto con 5 mL di terreno di D10 e posizionarlo nella provetta da centrifuga per massimizzare la raccolta delle cellule.</li>
			<li>Centrifugare le cellule a 370 x g per 5 min a 4 o C. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 4 mL di terreno di D10/3 M per ogni scatola di Petri Spalato.</li>
			<li>Dispensare 1 mL di sospensione di SC e 6 mL di terreno di D10 / 3M in una capsula Petri 10 cm; ogni divisione di Petri si tradurrà in 4 capsule di Petri. Questi SCs sono definiti come passaggio 1.</li>
			<li>Ricostituire con mezzo D10/3M fresco il giorno dopo il placcaggio e ogni 3-4 giorni dopo il placcaggio.</li>
			<li>Una volta la SCs raggiungere 70-80% confluenza, ripetere i passaggi 1.2.3.1 per 1.2.3.6. La SCs sono ora al passaggio 2.</li>
		</ol></li> <li>Trasducono il SCs una volta raggiunta la confluenza del 50%, con un vettore lentivirale codificante GFP in D10/3M medio durante la notte ad una molteplicità di infezione di 30 come precedentemente descritto 44 , 45 .</li>
		<li>Ricostituire con medium fresco D10 / 3M il giorno successivo e ogni 3-4 giorni dopo il placcaggio.</li>
		<li>Una volta che raggiungono la GFP-SCs confluenza di 70-80%, ripetere i passaggi 1.2.3.1 per 1.2.3.5 ma Risospendere la GFP-SCs in 6 mL di terreno di D10 invece. Pipettare 15 µ l della sospensione di GFP-SC in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e aggiungere 15 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4%. Flick delicatamente la provetta da centrifuga e Pipettare 10 µ l della miscela in una camera della diapositiva conta cellulare.
		<ol><li>Porre il vetrino in un contatore di cellule automatizzato e determinare la densità delle cellule.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugare le cellule a 370 x g per 5 min a 4 o C. Rimuovi il sovranatante, risospendere con 1,5 mL di mezzo di congelamento per ogni 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispensare 1,5 mL di sospensione di GFP-SC in un vial criogeniche e congelare a -80 o C per almeno 24 h prima di trasferirsi in azoto liquido per deposito. 
		Nota: Congelamento medio: 25% FBS e 8% dimetilsolfossido in DMEM.</li>
		<li>SCs-GFP scongelare una settimana prima dell'intervento chirurgico.
		<ol><li>Aggiungere 10 mL D10 liquido in una provetta da centrifuga 50ml.</li>
			<li>Scongelare i flaconcini di GFP-SCs congelati in bagnomaria a 37 o C fino a parzialmente scongelati.</li>
			<li>Rimuovere la sospensione di GFP-SC dal flaconcino criogenico e inserire la provetta da centrifuga 50 mL preparato in 1.2.8.1. Delicatamente dispensare la soluzione su e giù ripetutamente.</li>
			<li>Centrifugare le cellule a 370 x g per 5 min a 4 o C. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 4 mL di terreno di D10/3 M per ciascun flaconcino scongelato.</li>
			<li>Pipettare 2 mL di sospensione di GFP-SC e 5 mL di terreno di D10 / 3M in una capsula Petri 10 cm; ogni flaconcino deve comportare 2 capsule di Petri. Il GFP-SCs è definito come passage 3. 
			Nota: Una capsula di Petri 10 cm solitamente produce circa 8 x 10 6 GFP-SCs dopo una settimana.</li>
		</ol></li> <li>Il giorno dell'intervento chirurgico, ripetere il passaggio 1.2.6. Uso la densità delle cellule calcolata nel passaggio 1.2.10.</li>
		Tubi <li>dispensare aliquote di 3 x 10 6 GFP-SCs nella centrifuga sterili da 1,5 mL basati sulla densità della cella calcolata dal passaggio 1.2.9. Centrifugare le aliquote di GFP-SC 370 x g per 5 min a 4 o C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM/F12 per ciascuna aliquota e centrifugare a g. 370 x 
		Nota: Ogni animale riceve 3 x 10 6 GFP-è utilizzato con GFP-SCs SCs. Medium con siero fino a questo passaggio.</li>
		<li>Mantenere GFP-SCs su ghiaccio fino al momento del trapianto.</li>
	</ol></li></ol> 2. Completare il Transection al livello toracico 8 (T8) <ol><li>animale preparazione per la chirurgia <ol><li>Anesthetize una femmina Fischer ratto (180-200 g) con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (60 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (5 mg/kg di peso corporeo). Monitorare la profondità dell'anestesia prima di procedere al passaggio successivo controllando punta pizzicotti e occhio lampeggiante responses.</li>
		<li>Radere la parte posteriore del ratto con un clipper elettrico e pulire la pelle con etanolo al 70%. Applicare il lubrificante oftalmico in entrambi gli occhi. Trasferire l'animale nella tabella di chirurgia su un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea a circa 37 o C. posto l'animale su un rotolo così le vertebre sono facilmente accessibili. 
		Nota: Il rotolo può essere fatto da tovagliolo di carta o 2 in x2 in garza che può essere sterilizzato. Più grandi rotoli sono raccomandati quando T7-T9 deve essere disteso sulla parte superiore del rotolo.</li>
	</ol></li> <li>T7 alla laminectomia T9 <ol><li>individuare il punto di riferimento per i processi spinous T9-T11. 
		Nota: Il divario tra T9, T10 e T11 è piccolo rispetto ad altri segmentin la regione. Dopo aver posizionato il ratto sul rullo, T9-T11 apofisi si sentirà come un piccolo urto triangolare attraverso la pelle.</li>
		<li>Fare un'incisione mediana di 4-5 cm della pelle usando una lama #10 da T4 a T11. Praticare una piccola incisione dello strato grasso superficiale con forbici curve con estremità smussate di sezionare il grasso. 
		Nota: Altri tipi di strumenti possono essere utilizzati per separare il grasso ma forbici curve con estremità smussate abilitare il metodo più efficace e meno invasivo per separazione grassi.</li>
		<li>Individuare il T7 ai processi spinous T9 utilizzando il dorso della lama #10. Tenere il muscolo a su T4 con il forcipe smussato e fare un'incisione nel muscolo lungo ogni lato delle vertebre da T6-T10. Effettuare il taglio più vicino le vertebre come possibile fare un'apertura pulita e minimale ferire l'animale.</li>
		<li>Isolare ogni singolo processo spinous da T7 T9 tagliando i muscoli e legamenti tra T6 e T7, T7 e T8, T8 e T9 e T9 e T10 con una lama di 10 #.</li>
		<li>Utilizzare una Pinza ossivora per rimuovere qualsiasi muscoli e legamenti sulle lamine da T7 a T9. Rimuovere i muscoli e i legamenti lateralmente possibile fino a quando i divari tra le apofisi trasverse da T7 a T9 sono visibili.</li>
		<li>Rimuovere il processo spinous T9 con una Pinza ossivora. Tenere il processo spinous T8 con forcipe smussato e sollevare delicatamente per elevare la lamina di T9 presso la piccola apertura tra i processi T9 e T10.</li>
		<li>Rimuovere la lamina a partire dall'apertura e rostralmente in movimento con una Pinza ossivora al T9. Rimuovere la lamina lateralmente per quanto possibile; radici dorsali dovrebbe essere visibile dopo il laminectomy.</li>
		<li>Una volta rimossa la lamina, ripetere il processo per T8 e T7. 
		Nota: Durante la laminectomia, utilizzare lance di assorbimento per rimuovere il sangue pur continuando con laminectomia. Caso di sanguinamento in eccesso, posizionare una spugna compressa presso il luogo di spurgo e aggiungere soluzione fisiologica per aiutare con la coagulazione del sangue.</li>
	</ol></li> <li>Transection a T8 <ol><li>posto del riavvolgitore intorno T7 a T9. Dopo aver rimosso tutte le lamine, assicurarsi che i divari tra le apofisi trasverse sono visibili, soprattutto a T8. Anche esaminare le ossa lungo la lunghezza su entrambi i lati tra T7 a T9 per garantire non ci sono nessun frammenti di ossa che sporgono verso l'esterno. 
		Nota: Questa lacuna a T8 è importante per l'esecuzione il transection completo. Le vertebre lungo la lunghezza dovrebbero essere rimosso per facilitare l'inserimento conduit.</li>
		<li>Taglio dorsale e radici ventrali sopra e sotto T8 utilizzando angolato forbici di primavera. Aggiungere soluzione fisiologica al midollo spinale e attendere che il sangue coaguli. Nota: questo passaggio è importante per l'inserimento corretto conduit.</li>
		<li>Mettere le forbici angolate primavera sopra il midollo spinale le lacune tra le apofisi trasverse a T8 e fare un taglio di recidere completamente il midollo spinale. Inserire un piccolo pezzo di schiuma compressa il divario risultante di 2-2,5 mm e aggiungere soluzione fisiologica per l'area immediatamente.</li>
	</ol></li></ol> 3. Inserimento di Conduit <ol><li>durante l'attesa per i ceppi di cavo mozzata raggiungere emostasi, estrarre un condotto da 1X PBS. Tagliare i triangoli di assorbimento in pezzi lunghi sottili e metterli nel raccordo per rimuovere l'eccesso di PBS. Verificare che le finestre pre-tagliate sono aperte.</li>
	<li>Rimuovi saline e sangue utilizzando sottili lunghi pezzi di triangoli di assorbimento. Sollevare i due ceppi del midollo spinale con un microspatula per garantire la buona separazione. Il ceppo rostrale con il microspatula di sollevare delicatamente e scivolare il condotto sopra il ceppo con le finestre di fronte a se stessi. Assicurarsi che sia inserito il ceppo intero e non c'è Nessun sanguinamento in eccesso nel raccordo.</li>
	<li>Delicatamente sollevare il ceppo caudale e scivolare l'altra estremità del condotto sopra il ceppo. Assicurarsi che sia inserito il ceppo intero e le finestre sono sulla superficie dorsale ( Figura 2A).</li>
</ol> 4. Cellula di Schwann / Matrix iniettabili (Vedi tabella materiali) preparazione e iniezione <ol><li>durante l'attesa per il cavo mozzato raggiungere emostasi, rimuovere il supporto sopra il pellet di GFP-SC (preparato al punto 1.2). Risospendere il GFP-SCs in 10 µ l di freddo DMEM/F12. Aggiungere 10 µ l di gel iniettabile freddo alla sospensione cellulare e mescolare bene dal ripetuto pipettaggio. Mantenere la miscela di matrice di GFP-SC/DMEM/F12/iniettabili su ghiaccio fino al completamento di inserimento conduit.</li>
	<li>Dopo aver verificato che le finestre sulla superficie dorsale sono aperte ( Figura 2A), iniettare 20 µ l della miscela matrice GFP-SC/DMEM/F12/iniettabili il condotto attraverso uno dei pre-tagliata windows 46 utilizzando un western blot, carico di punta e una micropipetta. Se la miscela di matrice SC/DMEM/F12/iniettabile dovrebbe riempire troppo il condotto, rimuovere l'eccesso con triangoli di assorbimento. Chiudere le finestre dopo l'iniezione; la sutura non è necessaria ( Figura 2B).</li>
</ol> 5. Ferita di chiusura e cura postoperatoria <ol><li>sutura del muscolo strati e strati di grasso superficiali. Pulire la pelle con etanolo al 70% e poi fiocco (ad es., utilizzando clip ferita) Chiudi la pelle. Tenere gli animali in un incubatore termicamente regolamentato, fino a quando non riacquistano la coscienza. Trasferire gli animali nuovamente dentro le gabbie. Fornire l'acqua con un tubo di alimentazione lungo e posizionare le palline dell'alimento la biancheria da letto per un facile accesso.</li>
	<li>Amministra buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo) due volte al giorno per 3 giorni per via sottocutanea a partire immediatamente dopo l'intervento chirurgico per ridurre il dolore. Iniettare la gentamicina (5 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea una volta al giorno per 7 giorni immediatamente dopo l'intervento chirurgico per prevenire e ridurre le infezioni. Iniettare 10 mL di soluzione di Ringer lattato sonerie per via sottocutanea due volte al giorno per 7 giorni per idratazione.</li>
	<li>Empty vesciche manualmente due volte al giorno fino alla vescica funzionano restituisce. In caso di infezione della vescica, quindi somministrare 10 mL di soluzione salina per via sottocutanea fino a quando l'urina diventa chiaro. Se non c'è nessun miglioramento in due giorni, iniettare la gentamicina (5 mg/kg peso corporeo, una volta al giorno) per via sottocutanea fino a quando l'urina diventa chiaro.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La fase più critica nella creazione di un modello efficace transection è recidere il midollo spinale in uno o due tagli. Un 2-2.5 mm di distanza tra i ceppi rostrale e caudale del midollo spinale dovrebbe essere presente nel sito di transection. (1) le radici dorsali/ventrali non sono stati rimossi correttamente, (2) il dura ventrale non è stato rimosso adeguatamente, e/o (3) l'animale non è stato posizionato correttamente sul rullo posizionato sotto di lei sono i tre motivi più probabili per un tale divario non appare.<...

Riparazione di lesioni del midollo spinale è un problema complesso e impegnativo che richiederà una strategia di trattamento combinatorio che coinvolgono, ad esempio, l'uso delle cellule e un biomateriale per fornire un microambiente favorevole per la funzione delle cellule trapiantate e axon rigenerazione al luogo della ferita. Emisezione1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transection completo10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelli vengono spesso utilizzati per valutare gli effetti delle terapie a base di biomateriale bridging. Il vantaggio dell'utilizzo di un modello di emisezione è che fornisce maggiore stabilità per il costrutto bridging rispetto al transection completo. Tuttavia, nei modelli emisezione, è difficile dimostrare la rigenerazione dell'assone come risultato del metodo terapeutico applicato a causa della presenza del tessuto ha risparmiato. Il modello di transection completo è il metodo più rigoroso per dimostrare la rigenerazione assonale.
Vari materiali naturali e sintetici sono stati studiati per l'uso come un gel iniettabile, un gel pre-formato inseriti nei modelli emisezione o contusione, o come un condotto strutturato di emisezione o completare il transection modelli (dettagliati nel23 recensioni , 24 , 25). in situ gelificante di una miscela di iniettabili matrice/SC crea un'interfaccia più permissiva tra il trapianto e il cavo di host per l'assone attraversamento26,27 rispetto agli impianti di pre-gellati matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelificante ammessi la matrice rifinire i contorni intorno le interfacce host irregolari mentre un condotto più rigido e strutturato o un gel pre-formato meno modellabile non poteva. Un condotto strutturato fornisce spesso Contatta stabilità di guida e dell'impianto in contrasto con una matrice iniettabile. I protocolli presentati qui descrivono una procedura chirurgica che si avvale di una matrice della membrana dello scantinato iniettabili (ad es., matrigel, vedi che la Tabella dei materiali, di cui al come iniettabili matrice qui) e di un condotto strutturato per valutare la rigenerazione assonale nel modello di ferita del midollo spinale più rigoroso.
Elettrofilati poli-vinylidenedifluoride-strato (PVDF-TrFE) allineati fibrosi condotti cavi sono utilizzati nel nostro approccio sperimentale. PVDF-TrFE è un polimero piezoelettrico che genera una carica transitoria quando meccanicamente deforme e ha dimostrato di promuovere la rigenerazione di estensione e assone del neurite sia in vitro29,30 e in vivo 31. elettrofilatura è un comune metodo di fabbricazione di impalcatura che possa rapidamente produrre impalcature fibrose affidabili utilizzando una varietà di polimeri con proprietà controllabile come allineamento della fibra, fibra diametro e spessore dell'impalcatura per neurale e per altre applicazioni32,33,34.
Numerosi studi del ratto SCs trapiantate nei siti di lesione del midollo spinale hanno dimostrato trattamento efficacia5,9,18,19,20,21 ,26. Questi trapianti sono neuroprotective per il tessuto che circonda la lesione, ridurre la dimensione della lesione cavità e promuovere la rigenerazione assonale nel sito di lesione/trapianto e mielinizzazione degli assoni rigenerati. SCs umana può essere autologously trapiantato, un vantaggio rispetto alla maggior parte degli altri correlati neurali cellule24. Dopo una biopsia di nervo periferico, SCs può essere isolato e purificato e prolifereranno fino alla quantità desiderata per il trapianto negli esseri umani. Trapianto autologo di SC per i pazienti danneggiati del midollo spinale ha dimostrato di essere sicuro in Iran35,36,37,38, Cina39,40e la Stati Uniti41,42. SCs sono noti a secernere numerosi fattori neurotrofici e importante per la crescita dell'assone proteine della matrice extracellulare e a svolgere un ruolo essenziale nella rigenerazione assonale dopo lesione del nervo periferico. Nostro obiettivo è quello di descrivere i metodi che possono indagare disegni conduit per migliorare il risultato del trapianto di SC in un modello di transection del midollo spinale del ratto completa.

<table><tbody><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 10 cm</td><td>VWR</td><td>25382-428</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>"DMEM/F12" in protocollo.</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>"Pen/Strep" in protcol.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH300-70-03</td><td>"FBS" in protocollo.</td></tr><tr><td>Estratto ipofisario</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-215</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin</td><td>R& D Systems</td><td>396-HB/CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>"PLL" in protocollo.</td></tr><tr><td>Medium Eagle's modificato di Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td> <td>"DMEM" in protocollo.</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>"HBSS" in protocollo.</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Femmina di ratto Fischer (160-180g)</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas forbice, dritto</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Vedco Inc</td><td>5098976106</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd Inc</td><td>AnaSed</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-010-02</td><td>Può essere qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Micro Spatola</td><td>FST</td><td>10089-11</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Forbici curve con estremità smussata</td><td>FST</td><td>14017-18</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Pinze smussate</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td>Può essere qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Forbici a molla angolate</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td>Può essere di qualsiasi marca a scelta.</td></tr><tr><td>Triangoli di assorbimento</td><td>FST</td><td>18105-03</td><td>Può essere di qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>"Schiuma compressa" in protocollo.</td></tr><tr><td>#10 lame</td><td>Sklar</td><td>06-3010</td><td>Può essere qualsiasi marca di scelta.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>"Matrice iniettabile" nel protocollo.</td></tr><tr><td>Anticorpo della proteina fluorescente anti-verde di pollo</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo dell'ibridoma RT97 di topo</td><td>DSHB</td><td>RT97</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-neurofilamento di coniglio</td><td>Encor Biotechnology, Inc</td><td>PRCA-NF-H</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale della proteina acida fibrillare gliale di coniglio</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-pollo IgG (H + L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21244</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 capra anti-topo IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocale</td><td>Nikon</td><td>clsi</td><td></td></tr></tbody></table>

trapianto di schwann cells pvdf-trfe condotto a ponte ratto transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Tra i vari modelli per la ferita del midollo spinale nei ratti, il modello di contusione viene utilizzato più spesso perché è il tipo più comune di ferita del midollo spinale umano. Il modello di transection completo, anche se non come clinicamente rilevanti come il modello di contusione, è il metodo più rigoroso per valutare la rigenerazione assonale. Nel modello di contusione, è difficile distinguere rigenerata da assoni germogliati o risparmiati a causa della presenza di rimanere ferita post del tessuto. Nel modello transection completo, un metodo di transizione è necessario colmare la lacuna e creare continuità dalla rostrale ai monconi caudali al fine di valutare l'efficacia dei trattamenti. Una chirurgia ponte affidabile è essenziale per verificare le misure di risultato riducendo la variabilità a causa del metodo chirurgico. I protocolli descritti qui sono utilizzati per preparare Schwann cellule (SCs) e condotti prima del trapianto, transection completo del midollo spinale al livello toracico 8 (T8), inserire il condotto e trapiantare SCs in conduit. Questo approccio viene utilizzato anche in situ gelificante di matrice della membrana dello scantinato iniettabili con trapianto di SC che consente la crescita assonale migliorata attraverso le interfacce rostrale e caudale con il tessuto ospite.

L'obiettivo dell'utilizzo di questa tecnica chirurgica è quello di valutare l'uso di un tubo strutturato e matrice iniettabili che massimizza la funzione SC dopo trapianto in midolli spinali transected completati. Tre settimane dopo il trapianto, gli animali sono perfusi con paraformaldeide al 4% e le colonne vertebrali sono grossolanamente dissecate e risolto nel fissativo stesso per altre 24 ore. Il midollo spinale viene poi sezionato e i campioni per sezioni sagittali criostato vengono...

Questo articolo descrive una tecnica per inserire un cavo condotto tra i ceppi del midollo spinale dopo il transection completo e riempimento con cellule di Schwann (SCs) e matrice di iniettabili della membrana basale al fine di colmare e promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap.

Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica è utilizzare un condotto riempito con cellule di Schwann e una matrice iniettabile per creare un ponte tra i monconi del midollo spinale completamente trasectati, al fine di favorire la rigenerazione degli assoni attraverso il ponte. Il nostro obiettivo è ponteggiare una lesione del midollo spinale nel ratto per ripristinarne la funzionalità. La lesione che stiamo utilizzando consiste nella creazione di un difetto da trasessione completa.Solo utilizzando questo tipo di lesione possiamo affermare con certezza che gli assoni si sono rigenerati quando li ritroviamo nel sito della lesione. Il ponte che stiamo utilizzando è un canale polimerico contenente cellule di Schwann, fondamentali per la rigenerazione degli assoni. In questo video mostriamo come inserire un tale ponte in un difetto da sezione completa.I ricercatori alle prime armi con questo metodo dovranno esercitarsi, poiché la sezione completa del midollo spinale e l'inserimento del condotto possono risultare difficili per i principianti. Prima di iniziare la procedura, utilizzare una lama numero 10 per tagliare il condotto a cinque millimetri. Questa operazione può essere eseguita anche sotto un microscopio stereoscopico, se preferito.Piegare delicatamente il condotto lungo il lato longitudinale e utilizzare forbici dritte di Vannas per praticare quattro piccole incisioni lunghe circa 0,4 millimetri, a una distanza di almeno un millimetro dalle aperture e distanziate tra loro di circa un millimetro. Successivamente, dispiegare il condotto e tagliare tra le due incisioni lungo lo stesso lato per creare due finestre affiancate, assicurandosi che le finestre possano essere aperte e chiuse correttamente lungo il lato non tagliato. Per eseguire la laminectomia T7-T9, dopo aver verificato l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi in un ratto femmina Fischer anestetizzato del peso di 180-200 grammi, individuare il punto di riferimento per i processi spinosi T9-T11.Saranno percepibili come una piccola protuberanza triangolare attraverso la cute. Utilizzando una lama numero 10, effettuare un'incisione cutanea mediana lunga quattro-cinque centimetri da T4 a T11, seguita da una piccola incisione nel tessuto adiposo superficiale con forbici curve a punta ottusa. Dopo aver dissezionato il grasso, utilizzare la lama numero 10 per individuare i processi spinosi T7-T9 e usare pinze ottuse per trattenere il muscolo all'incirca a livello di T4. Effettuare un'incisione muscolare lungo ciascun lato delle vertebre da T6 a T10, il più vicino possibile alle vertebre, per ottenere un'apertura pulita e causare il minimo danno all'animale.Posizionare il retra­tto­re intorno a T7-T9. Utilizzare la lama numero 10 per tagliare i muscoli e i legamenti tra i singoli apofisi da T6 a T10 e usare un rongeur per rimuovere qualsiasi muscolo o legamento sulle lamine da T7 a T9 il più lateralmente possibile. Quando risultano visibili gli spazi tra le apofisi trasverse da T7 a T9, utilizzare il rongeur per rimuovere l’apofisi spinosa di T9, sollevando delicatamente l’apofisi spinosa di T8 con pinze ottuse per sollevare la lamina di T9 attraverso la piccola apertura tra le apofisi di T9 e T10. Successivamente, utilizzare il rongeur per rimuovere la lamina il più lateralmente possibile, partendo dall’apertura e procedendo in direzione rostrale a T9. Quando tutte le lamine sono state rimosse, verificare che gli spazi tra le apofisi trasverse siano visibili, in particolare a livello di T8, ed esaminare le ossa su entrambi i lati tra T7 e T9 per accertarsi che non vi siano frammenti ossei sporgenti verso l’esterno e che le radici dorsali diventino visibili.Utilizzando forbici a molla angolari, recidere le radici dorsali e ventrali sopra e sotto il livello T8 e aggiungere soluzione salina al midollo spinale per favorire l'arresto dell'emorragia. Successivamente, posizionare le forbici a molla angolari sopra il midollo spiniale negli spazi tra i processi trasversi a livello T8 ed eseguire un singolo taglio per sezionare completamente il tessuto nervoso. Inserire un piccolo pezzo di schiuma compressa nel gap risultante, di due a 2,5 millimetri, e aggiungere immediatamente soluzione salina sulla zona.Nel frattempo che i monconi del cordone reciso raggiungono l'emostasi, tagliare i triangoli assorbenti in strisce sottili e lunghe ed estrarre un condotto dallo stoccaggio in PBS. Inserire alcuni triangoli all'interno del condotto per rimuovere l'eccesso di PBS e verificare che le finestre pre-tagliate siano aperte. Successivamente, rimuovere il mezzo da un pellet di cellule di Schwann GFP e risospendere le cellule di Schwann in 10 microlitri di DMEM/F-12 freddo.Aggiungere 10 microlitri di gel iniettabile freddo alla sospensione cellulare e mescolare bene mediante pipettaggio ripetuto. Successivamente, posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio. Quando i monconi del cordone sono pronti, rimuovere la schiuma compressa e quindi utilizzare pezzi lunghi dei triangoli assorbenti per rimuovere la soluzione salina e il sangue dall'area di laminectomia.Quindi, utilizzare una microspatola per sollevare delicatamente il moncone rostrale ed inserire il condotto sul moncone con le finestre rivolte verso l'alto, avendo cura che l'intero moncone sia inserito e che non vi sia un eccesso di sanguinamento all'interno del condotto. Sollevare delicatamente il moncone caudale ed inserire l'altra estremità del condotto su di esso, avendo cura che l'intero moncone sia inserito e che le finestre siano sulla superficie dorsale. Quindi, utilizzare una micropipetta dotata di punta per caricamento di western blot per iniettare 20 microlitri della miscela iniettabile di matrice di cellule di Schwann GFP nel condotto attraverso una delle finestre precedentemente tagliate e chiudere le finestre.Una nota di cautela. È molto importante che i monconi del cordone vengano maneggiati nel modo più rapido e accurato possibile. Un ritardo potrebbe causare un'infiammazione dei monconi, rendendo difficile far scivolare il condotto sopra il midollo spinale e provocando ulteriori lesioni.Tre settimane dopo il trapianto, le immagini fluorescenti confocali di sezioni sagittali di tessuto spinale ottenute con criostato rivelano una distribuzione uniforme delle cellule di Schwann lungo e all'interno del condotto, nonché la presenza di vasi sanguigni e assoni mielinizzati al centro del ponte. La rigenerazione assonale è inoltre strettamente associata alla presenza delle cellule di Schwann, confermando l'efficacia dell'utilizzo di un ponte di cellule di Schwann all'interno di un condotto strutturato per promuovere la rigenerazione assonale lungo il ponte tra i monconi rostrale e caudale. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere completata in 45 minuti se eseguita correttamente.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il tracciamento con EndoRay, per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, quanti assoni rigenerano all'interno del ponte e quanti di questi escono dal ponte per reinnervare il midollo spinale? Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sezionare il midollo spinale, inserire un condotto e iniettare cellule all'interno di una matrice per creare un ponte affidabile per la rigenerazione assonica e per altre valutazioni degli esiti.

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Lesione traumatica al midollo spinale interrompe la comunicazione con il cervello. Per ripristinare la connettività perso utilizziamo un innesto del nervo periferico di fornire un substrato per la rigenerazione delle fibre in combinazione con fattori neurotrofici e matrice di modulazione degli enzimi per rimuovere molecole inibitrici per promuovere la crescita a lunga distanza.

La combinazione di innesto del nervo periferico e Matrix modulazione di riparare il cavo feriti Rat spinale

Prendi un ratto anestetizzato con un nervo sciatico destro intatto esposto, che controlla il movimento e la sensazione delle gambe.Asportare un segmento nervoso, creando una lacuna, recidendo gli assoni neuronali e interrompendo la trasmissione del segnale.Gli assoni distali recisi si deteriorano, staccando le cellule nervose specializzate o cellule di Schwann.Sutura un'impalcatura nervosa conduttiva bionica, un tubo morbido con microcanali, all'epinevrio, lo strato esterno del nervo, ad...

Riparazione dei nervi mediante un'impalcatura conduttiva bionica combinata con la stimolazione elettrica

Fonte: Lee, Y., et.al. Trapianto di cellule di Schwann all'interno di condotti PVDF-TrFE per colmare i monconi del midollo spinale di ratto transetto per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il divario. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'uso di un condotto polimerico piezoelettrico seminato con cellule di Schwann per promuovere la rigenerazione degli assoni in un midollo spinale di ratto sezionato. Il condotto fornisce una guida strutturale, mentre le sue proprietà...

Condotti con semina cellulare di Schwann per la rigenerazione assonale dopo una lesione del midollo spinale

Matrici di fibrina che contengono fattori di crescita sono stati usati per mantenere le cellule staminali neurali innestate nei siti di completo recisione del midollo spinale. Cellule trapiantate completamente riempite la cavità della lesione e differenziate in diversi tipi di cellule neurali, tra cui i neuroni che si estendevano assoni nel midollo spinale ospite su lunghe distanze.

Promozione della sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali con fibrina e fattore di crescita Cocktails dopo gravi lesioni del midollo spinale

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un sistema radio-telemetrico per registrare i parametri cardiovascolari in T4 midollo spinale ratti transected otto settimane successive tronco cerebrale embrionale delle cellule staminali neurali innesto nel sito della lesione. Telemetria è una tecnica avanzata per valutare con precisione la funzione cardiovascolare in coscienti liberi di muoversi midollo spinale topi feriti.

Un sistema radio-telemetria per monitorare la funzionalità cardiovascolare in ratti con midollo spinale e Transection embrionali staminali neurali Innesti cellulari

Lesioni del midollo spinale è una condizione traumatica che provoca grave morbilità e mortalità elevata. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un modello contusione di lesioni del midollo spinale nei topi seguita da un trapianto di cellule staminali neurali.

Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

Le gravi lesioni del midollo spinale spesso provocano difetti tissutali. Vengono descritte due possibilità per colmare con successo tali lacune per promuovere l'adattamento tissutale, le risposte rigenerative e il miglioramento funzionale nei ratti attraverso l'impianto di un sistema di microconnettori meccanici dopo una lesione acuta e cinque settimane dopo la completa transezione del midollo spinale.

Strategie sperimentali per colmare grandi lacune tessuto nel midollo leso spinale dopo acuta e cronica Lesione

Qui, presentiamo una tecnica in vivo per il trasferimento genico alle cellule di Schwann (SC) nel nervo sciatico del roditore. Questa semplice tecnica è utile per studiare i meccanismi di segnalazione coinvolti nello sviluppo e nel mantenimento delle SC mielinizzanti.

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L'elettroporazione è un approccio efficace per trasportare geni degli interessi nelle cellule. Applicando questo approccio in vivo sui neuroni del ganglio di topo adulto radice dorsale (DRG), descriviamo un modello per lo studio di rigenerazione dell'assone in vivo.

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Questo video dimostra il modello di trapianto ortotopico aortica come un semplice modello per studiare lo sviluppo di vasculopatia trapianto (TVP) nei ratti.

Trapianto ortotopico aortica: un modello di ratto per studiare lo sviluppo di vasculopatia cronica

Impara a creare un ponte con cellule di Schwann in un condotto polimerico per rigenerare assoni nel midollo spinale del ratto. Questa tecnica chirurgica promuove la guarigione delle lesioni spinali.

Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap (Video) | JoVE Journal

Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap

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