Confocale Imaging di Neuropeptide Y-pHluorin: una tecnica per visualizzare esocitosi di granuli di insulina in isolotti intatti Murine ed umani

L'obiettivo generale di questo saggio è visualizzare l'esocitosi dei granuli di insulina in tempo reale in isolotti pancreatici integri mediante microscopia confocale. Questo metodo risponderà a domande fondamentali nel campo del diabete. Ad esempio, cosa regola l'esocitosi dell'insulina?

Questo è fondamentale perché la fusione dei granuli è l'evento più importante nella vita di una cellula beta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo utilizzare isolotti intatti e osservare gli eventi di fusione all'interno di cellule nel loro ambiente naturale. Madina Mahkmutova, una studentessa di dottorato del nostro laboratorio, illustrerà la tecnica.

Al ricevimento delle isole pancreatiche, trasferirle in provette falcon da 50 millilitri e centrifugare la sospensione delle isole a 1.000 giri al minuto per cinque minuti. Le isole si raccoglieranno sul fondo della provetta; trasferire le isole in due millilitri di mezzo di coltura CMRL in piastre di Petri da 35 millimetri non trattate per colture cellulari e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore prima dell'infezione virale. Dopo l'isolamento, risospendere circa l'equivalente di isole pancreatiche di topo in due millilitri di mezzo di coltura CMRL e trasferirle in piastre di Petri da 35 millimetri non trattate per colture cellulari.

Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore prima dell'infezione virale. Per eseguire l'infezione virale, aggiungere da cinque a 10 microlitri di virus stock a ciascuna piastra di Petri da 35 millimetri contenente isolotti umani o di topo in due millilitri di mezzo di coltura CMRL. Dopo aver coltivato gli isolotti per 24 ore, aspirare il mezzo e sostituirlo con due millilitri di mezzo di coltura CMRL privo di virus.

Coltivare le isole per quattro-sei giorni, sostituendo il mezzo ogni tre giorni. Preparare la soluzione extracellulare combinando i reagenti elencati qui e quindi sterilizzare il tampone mediante filtrazione. Preparare il mezzo con glucosio basale a una concentrazione finale di tre millimolari di glucosio, aggiungendo 75 microlitri di soluzione madre di glucosio due molare a 50 millilitri di soluzione extracellulare.

Quindi, per preparare un mezzo iperglicemico con una concentrazione finale di glucosio di 16 millimolari, aggiungere 400 microlitri di soluzione stock di glucosio 2 molare a 50 millilitri di soluzione extracellulare. Diluire qualsiasi stimolo aggiuntivo e la soluzione extracellulare contenente tre millimolari di glucosio. Prima di iniziare un esperimento, pretrattare le coprioggetti con 30 microlitri di soluzione di poli-d-lisina ad un milligrammo per millilitro e incubare per un'ora.

Quindi utilizzare acqua per risciacquare accuratamente le coprioggetti. Almeno un'ora prima dell'esperimento, trasferire un gruppo di isolotti in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente soluzione extracellulare con tre millimoli di glucosio. Mantenere gli isolotti rimanenti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

30 minuti prima di iniziare un esperimento, fissare il vetrino coprioggetto alla camera di imaging utilizzando della vaselina siliconica per sigillarlo. Successivamente, fissare la camera di imaging alla piattaforma di imaging. Poi, mediante pipetta, trasferire da 20 a 30 isolotti nell'area del vetrino coprioggetto trattata con poli-d-lisina e lasciare che gli isolotti aderiscano alla superficie per 20 minuti.

Questo passaggio è fondamentale per il successo dell'esperimento e raccogliamo circa da 20 a 30 isolotti in meno di 10 microlitri di tampone, attendendo quindi per 20 minuti. È importante non far asciugare completamente il vetrino, per evitare danni agli isolotti. Mentre gli isolotti aderiscono al vetrino, preparare il sistema di perfusione utilizzando acqua per risciacquarlo accuratamente.

Quindi aggiungere ogni soluzione a un canale diverso, seguendo questa tabella. Rimuovere tutte le bolle dal sistema aprendo ciascun canale separatamente e lasciando scorrere la soluzione per alcuni minuti. Assicurarsi che il flusso sia costante e che i tubi non presentino perdite.

Successivamente, collegare il riscaldatore in linea singolo al tubo di uscita della perfusione e regolare la temperatura del buffer in uscita a 37 gradi Celsius. Quindi, preparare la pompa a vuoto. Collegare i tubi, accendere la pompa e assicurarsi che il liquido venga aspirato.

Posizionare la piattaforma di imaging con gli isolotti sullo stage del microscopio e collegarla al sistema di perfusione e alla pompa a vuoto. Successivamente, riempire delicatamente la camera di imaging con la soluzione extracellulare contenente tre millimoli di glucosio. Per eseguire l'imaging confocale, individuare gli isolotti nel campo del microscopio utilizzando un ingrandimento basso.

Dopo aver messo a fuoco le isole, passare a obiettivi con ingrandimento maggiore. Aprire il software di acquisizione e attivare la modalità di scansione residente. Selezionare l'acquisizione xyzt, quindi per configurare le impostazioni di acquisizione, accendere il laser al argon e impostarlo al 30%, quindi attivare la linea laser a 488 nanometri, regolando la potenza del laser a circa il 50% per l'eccitazione del pHluorin.

Raccogliere l'emissione tra 505 e 555 nanometri, utilizzando lo spettro di emissione di EGFP come riferimento. Selezionare una risoluzione di 512 per 512 pixel. Iniziare l'acquisizione immagini premendo il pulsante live e regolare i livelli di guadagno.

Impostare l'inizio dello stack z mettendo a fuoco la parte superiore dell'isola e selezionando "inizio", quindi spostarsi sull'ultimo piano messo a fuoco e selezionare "n". Scegliere una dimensione dello stack z di cinque micrometri. Impostare l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni stack z vicino a 1,5-2 secondi e selezionare l'opzione "acquisisci fino a interruzione" per l'acquisizione continua.

Quindi, premere il pulsante di avvio per iniziare l'acquisizione delle immagini. Consultare il protocollo scritto per i protocolli di stimolazione necessari per indurre l'esocitosi dei granuli. Utilizzando lo scanner integrato, vengono acquisite immagini confocali dell'isola sotto forma di registrazioni in time-lapse in meno di due secondi.

Inoltre, questa tecnica può essere combinata con coloranti per l'imaging funzionale, come quelli per il potenziale di membrana o per il calcio libero citosolico. Per determinare se NP Y-pHluorin è effettivamente uno strumento adatto per monitorare la dinamica dei granuli di insulina, gli isolotti infettati sono stati immunomarcanti con anticorpi diretti contro GFP per NP Y-pHluorin e contro gli ormoni dell'isolotto insulina, somatostatina o glucagone. La maggior parte delle cellule che esprimevano NP Y-pHluorin erano cellule beta, poiché esprimevano anche insulina.

Solo poche cellule alfa positive al glucagone o cellule delta positive alla somatostatina sono state etichettate con GFP. In modo importante, nelle cellule infette, la fusione NP Y è co-localizzata con l'insulina. Questa figura dimostra che il pHluorin è un sensore di pH efficace.

Dato che l'aumento del pH intracellulare mediante cloruro di ammonio 50 millimolare ha determinato un incremento superiore al 500% della fluorescenza intracellulare, quando il pH all'interno del granulo aumenta in seguito alla fusione con la membrana plasmatica e all'apertura del poro di fusione, i granuli contenenti NP Y-pHluorin diventano visibili in condizioni che stimolano l'esocitosi dell'insulina, come la depolarizzazione della membrana indotta da cloruro di potassio. Mediante l'acquisizione confocale in time-lapse di isolotti infettati con NP Y-pHluorin, è possibile visualizzare singoli eventi secretori nelle cellule beta all'interno di isolotti integri.

Questi si verificano in risposta a una depolarizzazione diretta della membrana indotta da cloruro di potassio o da diversi altri stimoli fisiologici. Alla concentrazione basale di glucosio extracellulare, si osserva poca attività secretoria. Tuttavia, la fusione dei granuli con la membrana plasmatica è innescata in risposta alla stimolazione con elevata concentrazione di glucosio.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunocitochimica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio perché la fusione dei granuli avviene in specifiche regioni della cellula. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata per esplorare il profilo temporale della secrezione dei granuli di insulina in popolazioni di cellule beta, negli isolotti umani.