In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare la metodologia per le registrazioni elettrofisiologiche dei nervi sensoriali del colon-retto in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della penna in vitro, come il contributo della sensibilità degli efferens periferici esterni alla corretta iperalgesia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la distinzione del colon-retto in modo simile a come la distinzione carotidea viene eseguita in vivo, negli animali o nei pazienti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché localizzare i gangli e sezionare i nervi è relativamente difficile. Per iniziare questa procedura, esporre la cavità addominale di un ratto profondamente anestetizzato eseguendo un'incisione sulla linea mediana sulla parete addominale utilizzando un bisturi. Successivamente, tira da parte il mesentere e gli altri tessuti per esporre il colon-retto.

Quindi, posizionare l'animale sotto il microscopio da dissezione. Attraverso un'attenta dissezione, localizzare il ganglio pelvico sinistro e identificare i nervi pelvici e i nervi splancnici lombari che lo uniscono. Successivamente, tagliare questi nervi a pochi millimetri di distanza dal ganglio pelvico.

La localizzazione del ganglio pelvico e la dissezione dei nervi è la fase più critica e difficile di questa procedura. Quindi, taglia l'osso della sinfisi per esporre il retto. Rimuovere i tessuti sopra il colon-retto e fare attenzione a lasciare intatto il ganglio pelvico.

Dopo aver sacrificato il ratto mediante iniezione endovenosa di un sovradosaggio di pentobarbital, sezionare il colon a circa tre centimetri sopra il ganglio pelvico e rimuovere il colon-retto dall'animale usando una pinza. Successivamente, trasferire il colon-retto in una capsula di Petri riempita con soluzione di Krebs pre-raffreddata. Rimuovere le feci sciacquando delicatamente il colon.

Successivamente, rimuovere con cura il residuo della vescica urinaria e gli altri tessuti, senza compromettere il ganglio pelvico. In questa procedura, posizionare il colon in una camera di registrazione e cospargere continuamente il tessuto con una soluzione di Krebs carbogenata. Successivamente, incannulare il colon-retto sia all'estremità orale che anale, quindi iniziare l'infusione intraluminale del colon con soluzione fisiologica nella direzione orale-anale, dopodiché, individuare il ganglio pelvico principale sotto il microscopio da dissezione e utilizzare spilli per insetti per esporre il ganglia.

Con un'attenta dissezione, trovare un ramo sottile del nervo che emana dal ganglio e corre verso il colon, quindi tagliare il nervo vicino al ganglione. Prima del passaggio successivo, accendere il bagno di riscaldamento e mantenere la soluzione di Krebs a 34 gradi Celsius. Ora, ispezionare una pipetta di vetro pre-estratta al microscopio da dissezione.

Rompere la punta dell'elettrodo con un paio di pinze in modo che sia di dimensioni compatibili con il diametro del nervo da registrare. Successivamente, smussare la punta posizionandola vicino a una svasatura più chiara. I nuovi a questa metodologia possono anche trovare difficile smussare la punta dell'elettrodo compatibilmente con le dimensioni del nervo.

Quindi, posizionare l'elettrodo smussato nel portaelettrodo, quindi collegare una siringa da 10 millilitri alla porta laterale del supporto per l'applicazione di una pressione negativa o positiva all'elettrodo. Successivamente, collegare il supporto allo stadio principale dell'amplificatore biologico e montare lo stadio principale su un manipolatore. Successivamente, spostare l'elettrodo nel bagno di tessuto e riempire l'elettrodo con la soluzione di Krebs applicando un'aspirazione delicata fino a quando non tocca il filo d'argento del supporto.

Quindi, posizionare la punta dell'elettrodo vicino all'estremità tagliata del nervo e applicare una pressione negativa per aspirare il nervo nell'elettrodo. Quindi, applicare più pressione negativa, in modo che circa un millimetro del nervo venga tirato nell'elettrodo e formi una tenuta ermetica. Ora accendi il bioamplificatore e imposta il filtro da 300 a tremila hertz.

Monitora il segnale sull'oscilloscopio e registra il segnale nervoso e il segnale di pressione intraluminale nel software di elaborazione dei dati spike. Quindi, applicare la distensione a rampa del colon chiudendo il rubinetto a tre vie sulla cannula di uscita mentre si infonde continuamente per via intraluminale. Monitorare la pressione intraluminale fino a raggiungere i 60 millimetri di mercurio, quindi aprire il rubinetto a tre vie sulla cannula drenante.

Ripetere questa procedura a intervalli regolari di quindici minuti e applicare farmaci extra o intraluminalmente per testare la sensibilità chimica dei nervi afferenti. Ecco l'illustrazione schematica del setup sperimentale per la preparazione del tubo del colon-retto ex vivo con una registrazione rappresentativa da un nervo distale al ganglio pelvico. Nelle preparazioni di ratti normali, i nervi afferenti del colon hanno tipicamente un basso livello di attività spontanea regolare.

La distensione a rampa del colon induce un aumento graduale della velocità di sparo. La proprietà meccanosensoriale di ciascun nervo è rappresentata tracciando la curva di risposta nervosa afferente della pressione intraluminale. In alternativa, la registrazione può essere effettuata da un ramo dei nervi pelvici prossimale al ganglio pelvico.

Il profilo dell'attività meccanosensoriale dei nervi pelvici prossimali è solitamente simile a quello osservato nel nervo distale al ganglio pelvico. L'analisi delle componenti principali delle forme d'onda dei potenziali d'azione dalla registrazione multiunità può essere effettuata per discriminare l'attività di una singola unità. Ecco le forme d'onda sovrapposte di due singoli afferens pelvici.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dell'anatomia dei principali gangli pelvici e degli altri nervi ed essere in grado di localizzare i gangli per sezionare i nervi e registrare l'attività afferente. Un vantaggio di questo protocollo è che può consentire il confronto delle proprietà elettrofisiologiche e dei profili farmacologici dei nervi afferenti pelvici e splancnici.