Name: Una guida per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione della struttura di umana IKK1/α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Scopri la produzione, la cristallizzazione e la determinazione strutturale di IKK1/α umano per comprendere le funzioni di segnalazione. Questo metodo facilita la progettazione razionale di farmaci.

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Ringraziamo il personale presso il beamlines 19ID, 24ID e 13ID alla Advanced Photon fonte, Lemont, IL, per il supporto durante la raccolta di dati su vari cristalli. Siamo grati a Dmitry Lyumkis, Istituto di Salk per noi il recupero la mappa di cryo-EM bassa risoluzione alle fasi iniziali di EM mappa/modello edificio, che è stato usato per costruire il modello di ricerca molecolare sostituzione IKK1 iniziale. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti da sovvenzioni NIH AI064326, CA141722 e GM071862 a GG. SP è attualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio Fellow.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
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<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
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<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Soluzione di produzione, la cristallizzazione e la struttura delle due proteine IKK relative Abbiamo precisato per determinare la struttura di cristallo dei raggi x di IKK1/α con la nozione che sarebbe stato un esercizio relativamente semplice, dato la nostra esperienza con la produzione della proteina IKK2/β, cristallizzazione e determinazione della struttura. Tuttavia, siamo rimasti molto sorpresi che queste due proteine correlate si comportavano in modo molto diverso per quanto riguarda la facilità...

Attività trascrizionali della famiglia di fattori trascrizionali dimerica NF-κB sono necessari per diverse funzioni cellulari, che vanno da infiammazione ed immunità alla sopravvivenza e morte. Queste attività sono rigorosamente controllate nelle cellule e una perdita di regolamento porta a varie circostanze patologiche, compreso i disordini autoimmuni e cancro1,2,3. In assenza di uno stimolo, l'attività di NF-κB sono tenute inibita di IκB (inibitore di-f-κB) proteine4. La fosforilazione di specifici residui di Ser IκB proteine marchia per ubiquitinazione e degradazione proteasomica successive o elaborazione selettiva5. Due altamente omologo Ser/Thr chinasi, IKK2/β e IKK1/α, agiscono come regolatori centrale delle attività di NF-κB effettuando questi eventi di fosforilazione6,7.
Interazioni tra un ligando e un recettore trasduce un segnale attraverso una serie di mediatori che portano all'attivazione di fattori di n-f-κB. Il processo di segnalazione di NF-κB possa essere classificato in due percorsi distinti – canoniche e non canoniche (alternativi)8. L'attività di IKK2/β regola principalmente la segnalazione di n-f-κB del pathway canonico che è essenziale per le risposte immunitarie infiammatorie e innata9. Una caratteristica distintiva di questa via è un'attivazione rapida e di breve durata di IKK2/β10 all'interno di un complesso di IKK finora biochimicamente atipici — presunto per essere composto di IKK1 e IKK2, nonché un componente regolamentazione, NEMO (n-f-κB modulatore essenziale )11,12,13. Tra le due subunità catalitiche IKK del complesso IKK, IKK2 è principalmente responsabile14 per la fosforilazione di specifici residui di prototipo IκBs (α, - β e γ-) associati a NF-κB e anche una proteina IκB atipica, NF-κB1/p105, che è un precursore della subunità p50 NF-κB5. Fosforilazione indotta ubiquitinazione e degradazione proteasomal di IκB (o elaborazione di p105) conduce al rilascio e attivazione di un set specifico di n-f-κB dimeri15. Attività di NF-κB aberrante a causa di cattiva regolazione funzione di IKK2 è stato osservato in molti cancri pure come in disordini autoimmuni2,3,16.
In contrasto con IKK2/β, attività di IKK1/α regola NF-κB segnalazione della via non canonica, che è essenziale per lo sviluppo e l'immunità. IKK1 fosforila residui specifici di NF-κB2/p100 sul relativo segmento C-terminale IκBδ, che conduce alla sua elaborazione e la generazione di p52. La formazione dell'eterodimero p52:RelB trascrizionalmente attiva inizia una risposta lenta e sostenuta a segnali dello sviluppo7,17,18,19,20. Interessante, la generazione del centrale p52 fattore NF-κB di questa via è criticamente dipendente da un altro fattore, n-f-κB inducendo chinasi (NIK)21,,22, ma non sul IKK2 o NEMO. Nelle cellule a riposo, il livello di NIK rimane basso a causa della sua costante degradazione proteasoma-dipendente23,24,25. Stimolazione delle cellule da ligandi 'non canoniche' e in alcune cellule maligne, NIK diventa stabilizzato per reclutare e attivare IKK1 / α. le attività della chinasi di NIK e di IKK1 sono essenziali per un'elaborazione efficiente di p100 in p527. IKK1 e NIK fosforilare tre serine (Ser866, 870 e 872), NF-κB2/P100 sul relativo segmento IκBδ C-terminale che porta l'elaborazione e la generazione di p52. Attivazione aberrante del pathway non canonico è stato implicato in molte malignità compreso il mieloma multiplo26,27,28.
Diversi inibitori altamente efficienti e specifici per IKK2/β sono noti, anche se nessuno finora si sono rivelati essere un farmaco efficace. Al contrario, gli inibitori IKK1/α-specific sono sparsi. Questo può derivare in parte dalla nostra mancanza di informazione strutturale e biochimica su IKK1/α, che limita la nostra comprensione della base meccanicistica dell'attivazione di NF-κB di IKK1 nelle cellule e progettazione razionale dei farmaci. Le strutture dei raggi x di IKK2/β ci ha fornito con intuizioni il meccanismo di attivazione di IKK2/β29; Tuttavia, queste strutture non ha potevano rivelare come i diversi stimoli a Monte innescare l'attivazione di IKK1/α o β/IKK2 regolare insiemi distinti di n-f-κB attività 30,31. Per capire la base meccanicistica sottostante la funzione di segnalazione distinta di IKK1/α e a istituire una piattaforma per la progettazione razionale dei farmaci, ci siamo concentrati sulla determinazione della struttura di IKK1/α.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin è ora fuori produzione, sostituito da Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III Terreno cellulare per insetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>Celle SF9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-IKK1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Precedentemente venduto da Imgenex</td></tr><tr><td>anticorpo anti-PentaHis</td> Membrana in PVDF <td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitrocellulosa può essere utilizzato anche</td></tr><tr><td>Agarosio Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per test Bradford</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superdex 200 Concentratore</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024 UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Composto A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK-inibitore XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporina</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Articolo</td><td></td>regalo</tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>destrano solfato</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>destrano solfato</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Alcuni di essi sono nuovi Cat # sul catalogo SIGMA. Quello che avevamo era originariamente da Fluka che aveva diversi Cat #.</td></tr><tr><td>Schermi</td><td></td><td></td><td></td>di cristallizzazione</tr><tr><td>Crystal Screen I e II (Crystal Screen HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion e PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 e PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 e SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Monta il cristallo</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Sincrotrone</td><td>La sorgente di fotoni avanzata (APS) presso il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti' s Argonne National Laboratory</td><td>Beamline 19 ID</td><td>La sorgente di fotoni avanzata (APS) presso il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti' s Argonne National Laboratory fornisce fasci di raggi X ultra-luminosi e ad alta accumulo di energia generati da anelli per la ricerca in quasi tutte le discipline scientifiche.</td></tr></tbody></table>

una guida per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione della struttura di umana ikk1/α

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Una classe di stimoli extracellulari richiede l'attivazione di IKK1/α per indurre la generazione di una subunità di NF-κB, p52, attraverso l'elaborazione del suo precursore p100. P52 funzioni come un omodimero o un eterodimero con un'altra subunità di NF-κB, RelB. Questi dimeri a loro volta regolano l'espressione di centinaia di geni coinvolti nel ciclo cellulare, la sopravvivenza delle cellule e l'infiammazione. IKK1/α rimane principalmente associato con IKK2/β e NEMO come un complesso ternario. Tuttavia, una piccola piscina di esso inoltre è osservata come un complex(es) di basso peso molecolare. Non è noto se l'attività di elaborazione p100 è attivato dall'attivazione di IKK1/α all'interno il più grande o più piccola piscina complessa. Attività costitutiva di IKK1/α è stato rilevato in diversi tumori e malattie infiammatorie. Per capire il meccanismo di attivazione di IKK1/α e consentirne l'utilizzo come un bersaglio di farmaci, abbiamo espresso IKK1/α ricombinante in sistemi host diversi, quali Escherichia coli, insetto e cellule di mammifero. Siamo riusciti a esprimere solubile IKK1/α in baculovirus infetta cellule di insetto, ottenere quantitativi di mg di proteina altamente pura, si cristallizzano in presenza di inibitori e determinare la sua struttura cristallina ai raggi x. Qui, descriviamo la procedura dettagliata per produrre la proteina ricombinante, sua cristallizzazione e sua determinazione di struttura di cristallo dei raggi x.

Clonazione ed espressione di diversi costrutti di IKK1/α Figura intera che umana IKK1/α è stato clonato nel baculovirus espressione vettoriale pFastBacHTa all'interno dei suoi siti di restrizione EcoRI e NotI per ottenere un N-terminale hexa-istidina etichetta IKK1. Il tag poteva essere rimossi da digestione della proteasi TEV. Poiché integrale IKK1/α contiene regioni flessibile su entrambe le estremità e regioni flessibili rendono solitamente una proteina difficili a ...

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) è una proteina di Ser/Thr chinasi che è coinvolto in una miriade di attività cellulari principalmente attraverso l'attivazione di fattori di trascrizione NF-κB. Qui, descriviamo i principali passaggi necessari per la produzione e la determinazione di struttura di cristallo di questa proteina.

Una guida per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione della struttura di umana IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

L'obiettivo di questa procedura è fornire indicazioni per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione strutturale dell'IKK1-alfa umano al fine di comprendere le basi meccaniche della sua funzione di segnalazione e stabilire piattaforme per la progettazione razionale dei farmaci. Questo metodo dovrebbe aiutare i ricercatori a determinare la struttura di IKK1, che fornirebbe risposte a domande chiave nel campo della segnalazione immunitaria. Questa tecnica descrive un percorso semplificato per ottenere cristalli di proteine IKK, che sono piuttosto refrattarie alla cristallizzazione e per fornire varie informazioni critiche nel superare le strozzature nel determinare le strutture.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché generare quantità di milligrammo di proteine solubili e ben educate, richiede la sua espressione nelle cellule degli insetti e la cristallizzazione può essere eseguita solo in una finestra di condizioni altamente stretta. Anche la procedura di sostituzione molecolare utilizzata per determinare la struttura di IKK1 può essere molto complicata, specialmente a causa della scarsa proprietà di deflessione dei cristalli, non ne

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Structure-based drug design gioca un ruolo importante nello sviluppo di farmaci. Perseguire obiettivi multipli in parallelo aumenta notevolmente la probabilità di successo per la scoperta di lead. L'articolo che segue mette in evidenza come il Seattle Center Genomica strutturale di Malattie Infettive utilizza un approccio multi-obiettivo per la determinazione del gene-per-struttura della influenza PB2 A subunità.

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Struttura cristallina di proteine-DNA può fornire indicazioni in funzione della proteina, meccanismo, così come la natura dell'interazione specifica. Qui, segnaliamo come ottimizzare la lunghezza, la sequenza e le estremità del DNA duplex per la co-cristallizzazione...

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β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

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La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

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Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

Vi presentiamo gli approcci per la caratterizzazione biofisica e strutturale delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina biolayer interferometria, calorimetria isotermica di titolazione e cristallografia a raggi x.

Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

Descriviamo protocolli per la determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO dalla cristallografia a raggi X. I metodi includono l'espressione proteica, la purificazione e la caratterizzazione, nonché strategie per il successo dell'ottimizzazione dei cristalli e la determinazione della struttura della proteina nella sua forma non associata.

Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

Il protocollo descrive metodi sperimentali per ottenere sostituzioni stabili del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) classe Iattraversopotenziali sostituzioni di β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie. Sono stati studiati il confronto strutturale dell'MHC I stabilizzato da β omologo edeterologodi 2 m.

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Questo articolo presenta un metodo per generare cristalli proteici derivati con I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico) utilizzando il microseeding per generare nuove condizioni di cristallizzazione negli schermi a matrice sparsa. I vassoi possono essere impostati utilizzando robot di erogazione di liquidi o a mano.

Derivazione di cristalli proteici con I3C utilizzando lo screening casuale della matrice microseed

Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.

Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

Scopri la produzione, la cristallizzazione e la determinazione strutturale di IKK1/α umano per comprendere le funzioni di segnalazione. Questo metodo facilita la progettazione razionale di farmaci.

Una guida per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione della struttura di umana IKK1/α

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