Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre in vivo monocolture di astrociti utilizzando un metodo semplice, veloce ed economico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'astroglibiologia, come ad esempio quali sono gli aspetti economici del rilascio fisico o dell'assorbimento degli astrociti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule risultanti assomigliano molto agli astrociti in vivo per morfologia, espressione di mRNA e proteine e fluttuazioni intercellulari del calcio.

Per iniziare questa procedura, preparare l'area di dissezione posizionando due piastre di Petri da 10 cm riempite con mezzo di dissezione su ghiaccio in una cappa di dissezione a flusso laminare. Per ogni area cerebrale da isolare, preparare una provetta da 15 mL riempita con 14 mL di terreno di dissezione e tenere in ghiaccio. Quindi, spruzzare gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% e posizionarli accanto al microscopio di dissezione nella cappa.

Se si lavora con tessuto embrionale, rimuovere prima gli embrioni dall'utero e aprire le sacche embrionali. Immediatamente, taglia le teste con le forbici. Quando tutte le teste sono state tagliate, trasferirle in un mezzo di dissezione pre-raffreddato.

Una volta che le teste sono immerse nel mezzo, apri la pelle e il cranio con una pinza e pizzica il cervelletto. Quindi fai leva con cautela sul resto del cervello verso l'alto e fuori dal cranio. Successivamente, separa la corteccia dalla struttura sottostante del mesencefalo.

Posiziona le pinze all'interno della fessura longitudinale tra gli emisferi e spostale tra la corteccia e le strutture del mesencefalo di un emisfero per pizzicare ogni emisfero libero. Successivamente, rimuovere tutte le meningi da ciascun emisfero e separare gli ippocampi. Se sono necessari gli astrociti dell'ippocampo, trasferire ciascun ippocampo in una provetta da 15 mL riempita con 14 mL di terreno di dissezione su ghiaccio.

Dopodiché, tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per generare astrociti in pezzi non più grandi di un millilitro cubo. Quindi raccogliere tutti i pezzi di tessuto corticale in una provetta separata da 15 ml riempita con terreno di dissezione su ghiaccio. Una volta raccolti tutti i pezzi di tessuto, attendere che si depositino sul fondo del tubo.

Quindi aspirare quanto più terreno possibile. Successivamente, aggiungere 2-3 mL di EDTA allo 0,05% di tripsen e incubare i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per venti minuti. Successivamente, aspirare con cura il tripsen EDTA lasciando pezzi di tessuto in una quantità minima di liquido sul fondo della provetta.

Quindi, aggiungere 5 mL di terreno di dissezione pre-raffreddato per lavare via il tripsen EDTA rimanente e pipettare sul lato della provetta superiore per ottenere la miscelazione dei pezzi di tessuto. Quindi, aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto nel minor liquido possibile. Ripetere questa fase di lavaggio con il terreno di dissezione pre-raffreddato due volte.

Dopo l'ultima fase di lavaggio, aggiungere 1 mL di D-Mem Plus a temperatura ambiente e triturare il tessuto pipettandolo su e giù senza introdurre bolle. Gli astrociti sono abbastanza sensibili al pH, quindi è importante evitare di produrre bolle in quanto ciò potrebbe modificare il pH della soluzione. Quindi, posizionare un filtro cellulare da 100 micron nell'apertura di una provetta da 50 ml e pre-bagnare il filtro con 4,5 ml con D-Mem Plus pre-raffreddato.

Pipettare 1 mL di sospensione di tessuto dissociato sul filtro cellulare e aggiungere altri 4,5 mL di D-Mem Plus pre-raffreddato per lavare le cellule attraverso di esso. Il settimo giorno in vitro dopo la dissezione, posizionare le piastre da 10 cm con le cellule in D-Mem Plus su uno shaker nell'incubatore e agitare le piastre a 110 giri/min per 6 ore. Da 20 a 30 minuti prima della fine delle sei ore di agitazione, preriscaldare 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H e 0,25% tripsen EDTA a 37 gradi nel bagnomaria.

Dopo 6 ore di agitazione, rimuovere le piastre di coltura dall'agitatore e sostituire immediatamente il terreno con 10 ml di 1 XPBS preriscaldato per piastra. Successivamente, rimuovere il PBS e aggiungere 3 ml di tripsen EDTA preriscaldato per piatto. Quindi incubare i campioni per quattro minuti a 37 gradi Celsius.

Se si preparano campioni per il Western Blot o il sequenziamento dell'RNA, non aggiungere Tripsen EDTA. Sostituire invece il PBS con 12 mL di NB+H preriscaldato, dopodiché le colture possono essere rimesse nell'incubatore. Quindi, aggiungere 5 ml di D-Mem Plus preriscaldato a 3 ml di tripsen EDTA in ciascuna piastra.

Pipettare le cellule dalla piastra e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 3220 volte G a 20 gradi Celsius per 4 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il palato cellulare in 1 mL di NB+H preriscaldato.

Queste immagini mostrano che gli astrociti ausam trasdotti dal campo G mostrano eventi spontanei di ioni calcio in tutte le reti di astrociti, compresi i processi sottili. Qui, un'onda di ioni calcio viaggia attraverso diversi astrociti da sinistra a destra nelle immagini di punti temporali distinti, dove il colore chiaro rappresenta aree di alte concentrazioni di ioni calcio e le aree nere rappresentano regioni extra cellulari. In questo grafico, la concentrazione di ioni calcio cambia nel tempo nelle regioni codificate a colori, che sono mostrate come tracce di intensità fluorescente G-camp, illustrando come un'onda di segnalazione di ioni calcio si diffonde su diversi astrociti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e quindici minuti se eseguita correttamente. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging delle cellule vitali in combinazione con esperimenti di trasfezione o trasduzione virale per rispondere a ulteriori domande, come quali eventi si verificano nelle membrane degli astrociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare in vivo colture di motori di astrociti in modo semplice, veloce ed economico.