Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di indurre la broncopneumopatia cronica ostruttiva o C-O-P-D attraverso l'esposizione all'ozono, O-E nei topi. Questo nuovo modello OE può avvenire nella caratterizzazione del meccanismo alla base della BPCO e può essere utilizzato per lo screening di nuovi farmaci. I principali vantaggi di questo modello OE sono che ricapitola i processi patologici dei pazienti con BPCO.

Può essere generato in sole sei-otto settimane. A dimostrare la procedura con me sarà Weijaian Sang, un ricercatore del nostro gruppo. Per generare ozono, utilizzare un generatore elettrico e un piccolo soffiatore d'aria per soffiare l'aria sigillando la scatola in perspex attraverso un tubo di sfiato dell'aria collegato all'interno e all'esterno della scatola utilizzando una sonda di ozono per monitorare la concentrazione di ozono nella scatola.

Quando la concentrazione di ozono raggiunge 2,5 parti per milione, metti i topi nella scatola per 3 ore. Alla fine della settimana 7, eseguire l'imaging degli animali trattati con ozono mediante tomografia microcomputerizzata secondo i protocolli standard. Per testare i cambiamenti indotti dall'ozono e le capacità funzionali come l'affaticamento polmonare, prima riscalda i topi a una velocità di 10 metri al minuto su un tapis roulant.

Dopo 5 minuti, aumentare la velocità a 15 metri al minuto per un periodo di 10 minuti. Continua ad aumentare la velocità di cinque metri al minuto ogni 30 minuti fino a quando i topi non possono più correre. Registrazione della distanza totale di corsa e del tempo di corsa per ciascun animale rispettivamente come distanza di fatica e tempo di fatica.

Per misurare la funzione polmonare degli animali esposti all'ozono, posizionare un topo anestetizzato in un pletismografo corporeo collegato a un ventilatore controllato da computer. Utilizzare la ventilazione a pressione controllata per imporre una frequenza respiratoria media di 150 respiri al minuto all'animale anestetizzato fino a ottenere un modello di respirazione regolare e un'espirazione completa ad ogni ciclo di respirazione. Quindi registrare il volume espiratorio forzato nei primi 25, 50 e 75 millisecondi di espirazione rifiutando qualsiasi manovra non ottimale.

Dopo l'anestesia terminale, utilizzare un tubo endotracheale di un millimetro di diametro per lavare gli animali due volte con un millilitro di PBS per lavaggio. Raggruppare gli aloquat recuperati da ciascun animale per la centrifugazione e raccogliere i surnatanti sull'azoto liquido. Risospendere i pellet in PPS fresco per il conteggio e dotare due supporti per mouse di un vetrino da microscopio, una scheda filtrante e un imbuto.

Aggiungere circa 100-125 microlitri di cellule risospese a ciascun imbuto. Caricare i supporti su una centrifuga cyto e far girare le celle sui vetrini. Quindi applicare la giusta soluzione colorante sulle cellule secondo le istruzioni del produttore e contare 200 cellule per topo con un ingrandimento di 400 volte.

Per il prelievo di sangue cardiaco, prelevare circa 500 microlitri di sangue dagli animali esposti all'ozono tramite puntura cardiaca. E aggiungi il sangue in provette da 1,5 millilitri con ghiaccio. Dopo 30 minuti con ghiaccio, centrifugare i campioni di sangue e trasferire i surnatanti del siero in nuove provette per la conservazione con azoto liquido.

I campioni possono essere successivamente scongelati per la valutazione dei livelli sierici di espressione delle citochine mediante ELISA secondo i protocolli standard. Per l'analisi morfometrica polmonare, posizionare il primo topo in posizione supina dopo il campionamento cardiaco. Quindi aprire la cavità toracica e sezionare il platisma e i muscoli tracheali anteriori per accedere agli anelli tracheali.

Raccogli i polmoni e la trachea senza separare il cuore dai polmoni. Successivamente, utilizzare un tubo in polietilene PE90 per collegare un catetere endotracheale a una siringa contenente il 4% di formaldeide e gonfiare completamente i polmoni con circa 200 microlitri di paraformaldeide. Quindi mettere i polmoni in una provetta da 15 millilitri contenente 10 millilitri di formaldeide fresca al quattro per cento di potenza per almeno quattro ore.

Come valutato mediante tomografia microcomputerizzata, i topi esposti all'ozono mostrano un volume polmonare totale significativamente maggiore e una percentuale di area a bassa attenuazione rispetto agli animali di controllo esposti all'aria ambiente. Il fenotipo dell'enfisema è evidenziato anche dall'ingrossamento degli alveoli polmonari e dall'aumento delle intercette lineari medie. La valutazione della funzionalità polmonare mediante pletismografo dimostra che tutti i parametri che diminuiscono nei topi esposti all'ozono sono coerenti con i tipici difetti funzionali polmonari osservati nei pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva.

Inoltre, l'esposizione all'ozono riduce significativamente il tempo di fatica e la distanza di fatica in un test di tolleranza all'esercizio. Gli animali trattati con ozono mostrano anche un aumento significativo delle cellule infiammatorie, tra cui macrofagi e neutrofili, nonché una significativa diminuzione di IL-10 e un aumento di IL-1 beta e TNF alfa, dimostrando che il modello di esposizione all'ozono ricapitola i sintomi simili alla broncopneumopatia cronica ostruttiva umana. Seguendo questa procedura su altri ceppi di topi come i topi C57 BR6 può essere utilizzato per generare questo modello OE Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle malattie polmonari per esplorare i meccanismi alla base della BPCO.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere pericoloso e che precauzioni come indossare guanti, occhiali di sicurezza e utilizzare la soluzione all'interno della cappa aspirante devono essere sempre prese mentre si lavora con questo reagente.