Name: In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come rilevare la SUMOilazione della proteina retinoblastoma in cellule umane HEK293 in condizioni endogene ed esogene. Questo metodo facilita lo studio dei processi cellulari regolati dalle modifiche SUMO.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dalla scienza e la tecnologia Commissione di Shanghai (Grant No. 14411961800) e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No. 81300805).

1. rilevamento di SUMOilazione Rb endogeno alla fase G1 precoce <ol><li>Cell sincronizzazione del ciclo cellulare e di cultura.
	<ol><li>Cellule HEK293 mantenere nel terreno di coltura contenente Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) completate con 1% penna-Strep e 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore.</li>
		<li>Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase G0.
		<ol><li>Conteggio le cellule HEK293 utilizzando un emocitometro e seme ~1.5 x 10 7 cellule in un 15cm piatto con 25 ml di terreno di crescita per 24 h prima del trattamento. Dopo aver raggiunto una confluenza di 70-80%, aspirato il mezzo e lavare le cellule due volte con 5 mL Tampone fosfato salino (PBS) preriscaldata.</li>
			<li>Aggiungere 25 mL DMEM contenente 1% penicillina-streptomicina e incubare le cellule a 37 ° C per 72 h. lavare le cellule fuori la piastra con 3 mL di PBS ghiacciata. Trasferire le cellule in una nuova provetta da 5 mL.</li>
			<li>Soggetto una piccola porzione delle cellule per analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria (punto 1.2); raccolta la maggior parte restante delle cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente e quindi memorizzarli in un congelatore di ultra-bassa temperatura fino all'analisi di Rb sumoilazione.</li>
		</ol></li> <li>Ottenere G1-fase cellule, alla fine del processo di sincronizzazione di G0, rimuovere il DMEM e aggiungere mezzo di sviluppo torna fresco, così permettendo che le cellule HEK293 immettere nuovamente il ciclo cellulare. Quindi, raccogliere le cellule nelle diverse fasi G1 (G1 precoce: 30 min; G1: 2h) per ciclo cellulare analisi e SUMO ulteriore saggio.</li>
		<li>Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase di S, utilizzando il metodo di blocco doppio-timidina.
		Cellule <ol><li>cellule HEK293 crescere a una confluenza di 50% e lavaggio con PBS preriscaldata. Quindi aggiungere il medium di crescita completate con timidina 2,5 mM per 18 h (primo blocco).</li>
			<li>Rimuovere il mezzo contenente timidina e poi lavare le cellule due volte con PBS preriscaldata. Aggiungere il terreno di coltura fresco per 14 h a rilasciare le cellule di.</li>
			<li>Eliminare il terreno con una pipetta e aggiungere mezzo di sviluppo completato con timidina 2,5 mM per un altro 18 h (secondo blocco) prima di condurre un'analisi del ciclo cellulare e Rb sumoilazione.</li>
		</ol></li> <li>Sincronizzazione per la G2/M, piastra ~1.5 × 10 7 HEK293 cellule ad un piatto di 15cm con 25 mL di terreno di crescita per 24 h. Quindi aggiungere nocodazole al mezzo fino ad ottenuta una concentrazione finale di 400 ng/mL. Infine, incubare le cellule per 16 h prima di condurre l'analisi del ciclo cellulare e Rb sumoilazione.</li>
	</ol></li> <li>Analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria.
	<ol><li>Risospendere il HEK293 sincronizzato in PBS e quindi correggere la sospensione cellulare utilizzando ghiacciata etanolo al 70% per 2 h a 4 ° C. si noti che per ridurre al minimo il clustering di cella, aggiungere goccia a goccia la sospensione cellulare per l'etanolo 100% ghiacciata per ottenere una concentrazione finale di etanolo al 70% mentre delicatamente nel Vortex.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g, poi accuratamente scartare il surnatante e lavare le cellule due volte con PBS. Ripetere il passaggio della centrifuga.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di PBS contenente 50 µ g/mL dell'acido nucleico macchia ioduro di propidio, 0,1% Triton X-100 e 1 µ g/mL RNasi alle cellule e mescolare bene. Incubare le cellule per 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Conservare i campioni a 4 ° C fino all'analisi di citometria a flusso.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitazione della proteina endogena Rb.
	<ol><li>Preparare il HEK293 lisati cellulari.
		<ol><li>Lyse le cellule HEK293 sincronizzate sospendendo delicatamente ri-li, in 1 mL di tampone di lisi ghiacciata radio-immunoprecipitazione assay (RIPA) (tabella 1), che contiene appena aggiunto 20 mM N-Ethylmaleimide, un inibitore di isopeptidase che potrebbe bloccare le proteasi SUMO e stabilizzare SUMO coniugati.</li>
			<li>Ulteriormente omogeneizzare le cellule su ghiaccio lisata omogeneizzazione, sonicazione o semplicemente passando attraverso 10 volte attraverso un ago 21G attaccato su una siringa da 2 mL. Quindi, incubare le cellule in ghiaccio per 5 min. 
			Nota: L'anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS) nel buffer RIPA è fondamentale per la successiva determinazione del Rb-SUMO, come si poteva eliminare il segnale SUMO aspecifiche che è derivato dall'interazione tra la proteina Rb e altro non-covalente SUMO-specie non-Rb.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugare i lisati cellulari a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C. trasferire i surnatanti in nuove provette di micro-centrifuga da 1,5 mL. 
		Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le proteine possono essere conservate a-80 ° C per almeno 6 mesi.</li>
		<li>Per preparare il controllo di input di ogni campione per il successivo Western blot, salvare una piccola porzione del surnatante sopra un nuovo tubo e conservare a -80 ° C.</li>
		<li>Per i surnatanti sopra, aggiungere 1 µ g di immunoglobulina non specifico del mouse G (IgG) della stessa specie e isotype come l'anticorpo monoclonale di Rb e 20 µ l di impasto un/G-Sepharose della proteina al 50%. Quindi, incubare per 1 h a 4 ° C con rotazione dolce.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C. attentamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferirli in nuove provette di micro-centrifuga da 1,5 mL. A ciascuno dei campioni, aggiungere 5 µ l Rb anticorpo primario e 40 µ l di proteina 50% un/G-Sepharose della liquami. Quindi, incubare per una notte a 4 ° C con rotazione dolce.</li>
		<li>Raccogliere le perle mediante centrifugazione a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere con cautela il surnatante pipettando. Si noti che al fine di evitare la perdita di tallone, non aspirare l'asciutto di perline.</li>
		<li>Lavare le perle quattro volte con 1 mL di tampone RIPA. Ogni volta, mescolare i tubi anche di rotazione li a 4 ° C per 15 min. raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e poi scartare i surnatanti.</li>
		<li>Dopo aver rimosso i surnatanti dal lavaggio finale, risospendere le perline in 30 µ l 1 x buffer di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) carico (tabella 1) e mescolare bene.
		<ol><li>Incubare le provette a 100 ° C in un calore bloccano per 10 min. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 1 minuto agglomerare le perline. Accuratamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferirli in provette da 1,5 mL micro-centrifuga.</li>
		</ol></li> <li>Analizza i campioni da 4-20% pendenza SDS-PAGE gel e Western blot oppure conservarli a-20 ° C per un uso successivo.</li>
	</ol></li></ol> 2. Analisi di 6XHis-etichetta sumoilazione di Rb esogeno in cellule umane <ol><li>cultura e transfezione delle cellule.
	<ol><li>Seme ~ 6 × 10 6 HEK293 cellule in un 10 cm piatto e incubare per 24 h nel mezzo di crescita in condizioni di coltura delle cellule normali di acquisire 75% - 85% di cellule confluenti. Prima di transfezione, rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere 6 mL di terreno preriscaldati riduttori del siero (Vedi Tabella materiali) e quindi posizionare i piatti nuovamente dentro l'incubatrice.</li>
		<li>Saggio di SUMOilazione costitutiva per il Rb, aggiungere 15 µ g di 6XHis-etichetta Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT e plasmidi Ubc9-C93S in mezzo di riduttore del siero 500 µ l in provette da 1,5 mL micro-centrifuga, rispettivamente.
		<ol><li>Per analizzare la coniugazione di SUMO di tipo selvaggio Rb e suo mutante di SUMOilazione-difettoso, mescolare 10 µ g di entrambi plasmide Rb-WT o Rb-K720R 6XHis-tag insieme con GFP-SUMO1 (10 µ g) in 500 µ l ridotto medio del siero in 1,5 mL micro-centrifuga tubi 13.</li>
		</ol></li> <li>Nel frattempo, in un tubo separato, mescolare 50 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) in 500 µ l ridotto medio del siero e incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Completamente combinare i due tubi separati sopra descritti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti Aggiungi la transfezione complessi reagente/plasmide alle cellule e continuano a cultura per 8 h 5% CO 2 e 37 ° C.</li>
		<li>Sostituire medio riduttori del siero con il mezzo di crescita e incubare le cellule in condizioni di normale coltura per 48 ore dopo la trasfezione.</li>
	</ol></li> <li>Nichel affinità pull-down della proteina Rb 6XHis-taggati.
	<ol><li>Lisare le cellule HEK293 transfettate ed estrarre le proteine totali come descritto sezione 1.3.1.</li>
		<li>Centrifuga i lisati cellulari a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C. accuratamente raccogliere i supernatanti e trasferirli tubi puliti. 
		Nota: La proteina può essere congelata a questo punto per più di 6 mesi a -80 ° C.</li>
		<li>Per preparare il controllo di input di ogni campione per il successivo Western blot, salvare una piccola porzione dei surnatanti descritto in precedenza per un nuovo tubo e conservare a -80 ° C.</li>
		<li>Wash 25 µ l di 50% di nichel nitrilotriacetico acidi perle di agarosio (Ni-NTA) con buffer di RIPA due volte in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga per ciascun campione. Raccogliere le perle mediante centrifugazione a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C.</li>
		<li>Add 1 M imidazolo per ciascun campione per ottenere una concentrazione finale di 10 mM. Quindi, aggiungere ciascun campione nella provetta contenente il preparato perline di agarosio Ni-NTA.</li>
		<li>Incubare le perline e i lisati per 2 h a 4 ° C con una leggera rotazione. Ruotate le perline a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere con attenzione i sovranatante pipettando. Per evitare la perdita di tallone, non aspirare l'asciutto di perline.</li>
		<li>Lavare le perline con 1 mL di tampone di lavaggio contenenti imidazolo 20mm (tabella 1). Ogni volta, mescolare i tubi anche di rotazione a 4 ° C per 15 min. raccogliere le perle di filatura a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e scartare i surnatanti.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 µ l di eluizione tampone imidazolo di contenente 250 mM (tabella 1) per ogni campione e flick per mescolare. Quindi, incubare per 20 min a 4 ° C per eluire le proteine.</li>
		<li>Mescolare ogni campione con tampone di caricamento 6 × SDS-PAGE (tabella 1). Quindi, incubare le provette a 100 ° C in un blocco di calore per 10 min.</li>
		<li>Centrifuga a 12.000 x g per 1 minuto agglomerare le perline. Accuratamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferire i campioni per provette da 1,5 ml micro-centrifuga. I campioni possono essere analizzati mediante Western blot o conservati a-20 ° C per un uso successivo.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>caricare l'immunoprecipitazione o tirare giù i campioni ottenuti dai passaggi precedenti sul gradiente gel di SDS-PAGE 4-20%. Condurre l'elettroforesi a 120 V per 90 min separare le proteine.</li>
	<li>Trasferire le proteine dal gel ad una membrana di polivinilidene (PVDF) Il difluoruro di electroblotting a 300 mA per 90 min a 4 ° C, utilizzando il metodo di trasferimento del serbatoio. Bloccare la membrana PVDF in mattoncino buffer contenente 5% di latte scremato (tabella 1) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana con l'anticorpo primario in tampone di diluizione di anticorpo contenente 3% albumina di siero bovino (BSA) (tabella 1) durante la notte a 4 ° C. Per gli anticorpi primari, utilizzare una concentrazione di lavoro 0,5 µ g/ml (anticorpo anti-SUMO1), o una diluizione di 1: 2000 (anticorpi anti-Rb e anti-tubulina), o 1:5,000 (anti-GFP e la anti-sua anticorpo).</li>
	<li>Lavare la membrana 3 x per 10 min ogni volta utilizzando 1 x soluzione fisiologica tamponata con buffer di Tween (TBST) (tabella 1). Incubare la membrana con specie specifici anticorpi secondari coniugati HRP perossidasi di rafano 1:5,000 diluito in tampone di blocco contenente 5% di latte scremato (tabella 1). Lavare la membrana 3 x per 10 min ogni volta utilizzando 1 buffer di x TBST.</li>
	<li>Incubare la membrana con chemiluminescenza (ECL) soluzione di lavoro. Coprire la membrana con involucro di plastica ed esporlo alla pellicola di raggi x a seconda della forza segnale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo per rilevare e analizzare la sumolazione endogeno di Rb in cellule umane. Mentre questo metodo è specificamente incentrato sulla proteina Rb endogena senza qualsiasi alternanza di segnale correlate a SUMO globale, è un importante strumento per lo studio di modificazione di Rb-SUMO in circostanze fisiologiche completamente naturali.
Per raggiungere questo obiettivo, è importante tenere a mente che: 1) anche se SUMO comprende quattro isoforme (SUMO1-4, cias...

L'accurato controllo della progressione del ciclo cellulare nelle cellule eucariotiche si basa su una fitta rete di regolamentazione, che garantisce che determinati eventi si svolgono in un determinato ordine1,2. Uno dei giocatori chiave in questa rete è la proteina del retinoblastoma (Rb), il primo clonato tumore soppressore1,3. La proteina Rb è pensata per essere un regolatore negativo della progressione del ciclo cellulare, soprattutto per il G0/G1 a transizione di fase S e tumore crescita4,5. Fallimento di funzione di Rb sia direttamente comporta la malignità intraoculare più comune nei bambini, retinoblastoma, o contribuisce allo sviluppo di molti altri tipi di cancro5. Rb è inoltre impegnato in molte vie cellulari tra cui la differenziazione delle cellule, di rimodellamento della cromatina e apoptosi mitocondrio-mediata3,6,7.
Modificazioni post-traduzionali giocano un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione RB8,9. La fosforilazione è una tale modifica, e solitamente conduce all'inattivazione di Rb. In cellule quiescenti G0, Rb è attiva con un livello basso di fosforilazione. Come cellule progressi attraverso fase G0/G1, Rb è in sequenza iper-fosforilato da una serie di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) e cicline, ad esempio ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, che inattivano Rb ed eliminare la sua capacità di reprimere il ciclo cellulare correlate a gene espressione4,10. RB potrebbe essere modificata anche da piccole modificatore ubiquitina-correlate (SUMO)11,12,13.
SUMO è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente a una varietà di proteine bersaglio. È fondamentale per diversi processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, trascrizione, localizzazione cellulare della proteina e degrado, trasporto ed il DNA riparazione14,15,16, 17 , 18. via di Coniugazione il SUMO è costituito dall'enzima d'attivazione di SUMO E1 dimerica SAE1/UBA2, l'unico enzima di coniugazione E2 Ubc9, multiple E3 ligasi e proteasi specifiche SUMO. Generalmente, il nascente proteine SUMO devono essere elaborati proteoliticamente per generare la forma matura. Il SUMO maturo è attivato dall'eterodimero E1 e quindi trasferita all'enzima E2 Ubc9. Infine, la glicina del C-terminale di SUMO covalenza è coniugata con la lisina di destinazione di un substrato, e questo processo è solitamente nei paraggi E3 ligasi. La proteina SUMO può essere rimosso dal substrato modificato da proteasi specifiche. Uno studio precedente dagli autori di questa carta ha rivelato che la sumoilazione di Rb aumenta suo legame con CDK2, che conduce alla fosforilazione di iper alla fase G1 precoce, un processo che è necessario per il ciclo cellulare progressione13. Inoltre abbiamo dimostrato che la perdita di Rb SUMOylation provoca una proliferazione delle cellule in diminuzione. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la sumoilazione di Rb protegge la proteina Rb da proteasomal fatturato, aumentando così il livello di proteina Rb in cellule19. Di conseguenza, sumolazione svolge un ruolo importante nella funzione di Rb in vari processi cellulari. Per studiare ulteriormente la conseguenza funzionale e rilevanza fisiologica di SUMOilazione Rb, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare lo stato SUMO di Rb in cellule o tessuti di pazienti umani.
Sumoilazione è un processo reversibile, altamente dinamico. Così, è solitamente difficile da rilevare le proteine SUMO-modificate in condizioni completamente endogene. Questo articolo presenta un metodo per rilevare endogeno Rb sumoilazione. Inoltre, viene illustrato come rilevare esogeno Rb sumoilazione di selvaggio-tipo Rb e sua mutazione di SUMO-carenti11. In particolare, Jacobs et al ha descritto un metodo per aumentare la modifica di SUMO di un substrato dato specificamente di Ubc9 fusion-regia SUMOylation (UFDS)20. Basato su questo metodo, questo protocollo viene descritto come analizzare la sumoilazione forzata di Rb e le sue conseguenze funzionali. Dato che centinaia di substrati SUMO è stati descritti precedentemente e più substrati putativi di SUMO sono stati identificati da molte analisi proteomica-based, questo protocollo può essere applicato per analizzare la SUMO-modifica di queste proteine in cellule umane.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazolo</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>ioduro di propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide</td><td>Sigma</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Sostituto (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Immunoglobulina G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A / G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 11668019 Perle di agarosio <td>dell'acido</td><td></td></tr><tr><td>nitrilotriacetico di nichel (Ni-NTA)</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>Gel SDS-PAGE a gradiente 4%-20%</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF)</td><td>IPVH00010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td>Anticorpo <td>M147</td><td></td></tr><tr><td>della tubulina</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SUMO1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFP</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario della perossidasi di rafano (HRP)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Kit di chemiluminescenza potenziata (ECL)</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo rilevamento e analisi di rb sumoilazione di proteine in cellule umane

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Le modificazioni post-traduzionali delle proteine sono fondamentali per la corretta regolazione della trasduzione del segnale intracellulare. Tra queste modifiche, piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente ai residui di lisina di una varietà di proteine bersaglio per regolare i processi cellulari, come la trascrizione del gene, riparazione del DNA, proteine interazione e degrado, trasporto subcellulare e trasduzione del segnale. L'approccio più comune al rilevamento della proteina sumoilazione si basa sull'espressione e purificazione delle proteine ricombinanti con tag nei batteri, consentendo un in vitro reazione biochimica che è semplice e adatto per l'indirizzamento meccanicistico domande. Tuttavia, a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo, è più difficile rilevare e analizzare la proteina SUMOilazione nelle cellule, soprattutto quando si è in condizioni endogena. Uno studio recente dagli autori di questa carta ha rivelato che la proteina endogena retinoblastoma (Rb), un oncosoppressore che è essenziale per la regolazione negativa della progressione del ciclo cellulare, è specificamente SUMOilate alla fase G1 precoce. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione e l'analisi di SUMOilazione Rb in condizioni sia endogene che esogene in cellule umane. Questo protocollo è appropriato per l'indagine fenotipica e funzionale di SUMO-modificazione del Rb, come pure molte altre proteine SUMO-mirati, in cellule umane.

Per rilevare endogeno Rb sumoilazione durante la progressione del ciclo cellulare, questo studio sincronizzato prima cellule HEK293 in cinque diverse fasi del ciclo cellulare (G0, primi G1, G1, S e G2/M), come descritto nella sezione protocollo di questa carta. La qualità di sincronizzazione è stata confermata usando la macchia di acido nucleico con ioduro di propidio seguito dall'analisi di citometria a flusso (Figura 1). Successivamente, le cellule sono sta...

Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.

In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare la SUMOilazione delle proteine della retinoblastoma in condizioni endogene ed esogene all'interno di cellule umane. Le proteine della famiglia del modificatore ubiquitina-simile, o SUMO, vengono coniugate ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare diversi processi cellulari. Di solito, è più difficile avviare la SUMOilazione di una proteina all'interno delle cellule a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo.Questo esperimento rileva la SUMOilazione delle proteine Rb endogene ed esogene. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla SUMOilazione delle proteine Rb, è anche adatto al rilevamento di molte altre proteine bersaglio della SUMO nelle cellule. Per iniziare, aggiungere 25 millilitri di DMEM contenente l'uno percento di penicillina-streptomicina e incubare le cellule HEK293 a 37 gradi Celsius per 72 ore.Lavare le cellule dalla piastra utilizzando tre millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Successivamente, trasferire le cellule in un nuovo tubo da cinque millilitri. Per ottenere cellule in fase G1 al termine del processo di sincronizzazione in G0, rimuovere il DMEM e aggiungere n

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Questo video dimostra il metodo in vitro per la SUMOilazione delle proteine del substrato utilizzando una cascata enzimatica sequenziale. Inoltre, lo stato SUMOilato della proteina viene identificato utilizzando l'elettroforesi e la tecnica dell'immunoblotting.

Saggio di SUMOilazione: una tecnica in vitro per rilevare lo stato di SUMOilazione delle proteine del substrato mediante immunoblotting

Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Le interazioni proteina-proteina possono verificarsi sia nel nucleo che nel citoplasma di una cellula. Per studiare queste interazioni, vengono applicati la tradizionale co-immunoprecipitazione e il moderno saggio di legatura di prossimità. In questo studio, confrontiamo questi due metodi per visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel nucleo e nel citoplasma.

Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di un sistema inducibile dominante-negativo, in cui tutta la proteina può essere inattivata in modo condizionale reversibilmente overexpressing una versione mutante dominante-negativo di esso.

Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)

Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l'uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire, isolare, identificare e caratterizzare le proteine modificate da SUMO in vivo sia da cellule umano di epatoma e tumori del fegato ottenuti da modelli murini di carcinoma epatocellulare utilizzando entità leganti SUMO (SUBE).

Entità DI legame SUMO (SUBE) come strumenti per l'arricchimento, l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione del proteoma SUMO nel cancro al fegato

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Questi protocolli forniscono la metodologia utilizzata per valutare l'attività enzimatica dei singoli membri della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) nelle cellule. Vengono descritte linee guida dettagliate sulla valutazione dell'attività delle PRMT utilizzando biomarcatori endogeni ed esogeni, anticorpi di riconoscimento metil-arginina e composti degli utensili inibitori.

Metodi quantitativi per studiare l'attività delle proteine arginina metiltransferasi 1-9 nelle cellule

Scopri come rilevare la SUMOilazione della proteina retinoblastoma in cellule umane HEK293 in condizioni endogene ed esogene. Questo metodo facilita lo studio dei processi cellulari regolati dalle modifiche SUMO.

In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

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