In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare la SUMOilazione delle proteine della retinoblastoma in condizioni endogene ed esogene all'interno di cellule umane. Le proteine della famiglia del modificatore ubiquitina-simile, o SUMO, vengono coniugate ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare diversi processi cellulari. Di solito, è più difficile avviare la SUMOilazione di una proteina all'interno delle cellule a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo.

Questo esperimento rileva la SUMOilazione delle proteine Rb endogene ed esogene. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla SUMOilazione delle proteine Rb, è anche adatto al rilevamento di molte altre proteine bersaglio della SUMO nelle cellule. Per iniziare, aggiungere 25 millilitri di DMEM contenente l'uno percento di penicillina-streptomicina e incubare le cellule HEK293 a 37 gradi Celsius per 72 ore.

Lavare le cellule dalla piastra utilizzando tre millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Successivamente, trasferire le cellule in un nuovo tubo da cinque millilitri. Per ottenere cellule in fase G1 al termine del processo di sincronizzazione in G0, rimuovere il DMEM e aggiungere nuovamente mezzo di crescita fresco, consentendo così alle cellule HEK293 di reingressare nel ciclo cellulare.

Quindi raccogliere le cellule in diverse fasi G1 per l'analisi del ciclo cellulare e ulteriori saggi SUMO. Per sincronizzare le cellule HEK293 nella fase S, utilizzare il metodo di blocco doppio con timidina. Inizialmente, coltivare le cellule HEK293 fino a una confluenza del 50%. Successivamente, lavare le cellule con PBS preriscaldato.

Aggiungere mezzo di crescita supplementato con timidina 2,5 millimolare per 18 ore come primo blocco. Rimuovere il mezzo contenente la timidina e lavare le cellule due volte con PBS preriscaldato. Aggiungere mezzo di crescita fresco per 14 ore per rilasciare le cellule dal blocco.

Dopo aver rilasciato le cellule dal primo blocco, scartare il mezzo con una pipetta. Quindi aggiungere mezzo di crescita integrato con 2,5 millimoli di timidina per ulteriori 18 ore come secondo blocco, prima di effettuare un'analisi del ciclo cellulare e della SUMOilazione di Rb. Per la sincronizzazione nella fase G2 o M, seminare circa 15 milioni di cellule HEK293 in una piastra da 15 centimetri con 25 millilitri di mezzo di crescita e coltivare per 24 ore.

Quindi aggiungere nicotisol al mezzo fino a ottenere una concentrazione finale di 400 nanogrammi per millilitro. Infine, incubare le cellule per 16 ore prima di eseguire l'analisi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, come descritto nel protocollo testuale. Lisare le cellule HEK293 sincronizzate risospendendole delicatamente in un millilitro di buffer di lisi freddo per saggio di radioimmunoprecipitazione, o RIPA, contenente inibitore delle isopeptidasii aggiunto al momento per bloccare le proteasi SUMO e stabilizzare i coniugati SUMO.

Omogeneizzare ulteriormente le cellule sul ghiaccio passandole attraverso un ago da 21 gauge collegato a una siringa da due millilitri per 10 volte. Incubare quindi le cellule sul ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, centrifugare i lisati cellulari a 18000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, trasferire i soprannatanti in nuove provette microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ai soprannatanti, aggiungere un microgrammo di immunoglobulina G murina non specifica della stessa specie e isotipo dell'anticorpo monoclonale Rb. Aggiungere inoltre 20 microlitri di sospensione al 50 percento di proteina AG sepharos, quindi incubare la miscela per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione delicata.

Centrifugare i campioni a tremila volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere con attenzione i soprannatanti senza disturbare le perle e trasferirli in nuove provette microcentrifuga da uno virgola cinque millilitri. Aggiungere a ciascun campione cinque microlitri di anticorpo primario rb e quaranta microlitri di sospensione al cinquanta percento di proteina A G sepharose, quindi incubare i campioni tutta la notte a quattro gradi Celsius con rotazione delicata.

Dopo la centrifugazione, lavare le perle con un millilitro di tampone rifa. Mescolare bene i tubi mediante rotazione a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità come in precedenza e scartare i soprannatanti.

Dopo aver eseguito il lavaggio quattro volte, risospendere le perle in 30 microlitri di buffer di caricamento per elettroforesi su gel di poliacrilammide in dodecilsolfato di sodio 1x e mescolare accuratamente. Incubare i tubi a 100 gradi Celsius in un blocco termico per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 ×g per un minuto per formare il pellet delle perle.

Infine, raccogliere con attenzione i soprannatanti senza disturbare le perle e trasferirli in provette microcentrifuga da un virgola cinque millilitri. Eseguire la trasfezione delle colture cellulari e la lisi delle cellule HEK293 come descritto nel protocollo testuale. Quindi lavare 25 microlitri di perle di agarosio al 50 percento di acido nichel nitrilotriacetico con tampone RIPA in una provetta microcentrifuga da un virgola cinque millilitri per ogni campione.

Raccogliere le perle mediante centrifugazione a tremila volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un molar di emytozol a ogni campione per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolare. Quindi aggiungere ogni campione al tubo contenente le perle di agarosio preparate.

Incubare le perle e i lisati per due ore a quattro gradi Celsius con rotazione delicata. Successivamente, centrifugare le perle a tremila volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i soprannatanti mediante pipettaggio.

Per evitare la perdita delle perle, non aspirare fino a essiccare le perle. Successivamente, lavare le perle con un millilitro di soluzione di lavaggio contenente 20 millimolari di emytozol. Mescolare bene i tubi mediante rotazione a quattro gradi Celsius per 15 minuti prima di raccogliere le perle mediante centrifugazione.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 30 microlitri del buffer Eleusian contenente 250 millimolar di emitozolo a ciascun campione e agitare leggermente per mescolare. Incubare quindi i campioni per 20 minuti a quattro gradi Celsius per eluire le proteine. Mescolare ogni campione con un volume sei volte superiore di buffer di caricamento per SDS-PAGE.

Quindi incubare i tubi a 100 gradi Celsius in un blocco termico per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, caricare i campioni di immunoprecipitazione o di pull-down su gel SDS-PAGE a gradiente dal 4% al 20%. Eseguire l'elettroforesi a 120 volt per 90 minuti al fine di separare le proteine.

Dopo la sincronizzazione del ciclo cellulare e l'immunoprecipitazione delle specie endogene di rb, la presenza del segnale SUMO è stata specificamente rilevata mediante un anticorpo anti-SUMO1 nella fase iniziale della G1. I risultati rappresentativi mostrano la SUMOilazione forzata della proteina rb attraverso la fusione diretta dell'enzima SUMO E2 UBC9 al suo estremo C-terminale. Si noti la proteina rb SUMOilata con migrazione più lenta.

Utilizzando il mutante privo di SUMO della proteina rb, K720R, si conferma ulteriormente la presenza della SUMOilazione di rb nelle cellule. Pertanto, in questa procedura, molte altre proteine bersaglio della SUMOilazione possono essere analizzate in cellule in coltura. Nella maggior parte dei casi, solo una piccola frazione di un substrato è SUMOilata; pertanto, nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ottimizzare l'efficienza dell'immunoprecipitazione.