Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

L'obiettivo generale di questa combinazione di metodi standard è dimostrare come l'intestino di C. elegans possa essere utilizzato per l'analisi in vivo della biogenesi della membrana polarizzata e della morfogenesi del lume a livello di singola cellula e subcellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della polarità e della biogenesi, come ad esempio il modo in cui i domini di membrana apicali rispetto a quelli basolaterali e altre asimmetrie subcellulari vengono stabilite e mantenute durante e dopo la morfogenesi. Il vantaggio principale di questo sistema modello è che questo singolo strato trasparente di sole 20 cellule può sopravvivere nella camera tissutale in vivo per sezionare la membrana polarizzata a singola cellula e la biogenesi del lume.

Le tecniche possono essere estese all'analisi di altri fenotipi di morfogenesi di C.Elegans: l'attenzione qui è rivolta all'analisi della biogenesi di membrana, in particolare alla biogenesi della membrana apicale e del lume. Le procedure includono tecniche di imaging raffinate in animali fissi e vivi per distinguere i domini di membrana e le componenti subcellulari e per identificare i fenotipi della morfogenesi del lume in un intestino di C. elegans. Questo video sulla tubulogenesi intestinale è accompagnato da un video sui modelli mutuamente informativi della tubulogenesi del canale escretore in cui è stata effettuata l'analisi in vivo della biogenesi della membrana polarizzata.

Per quanto riguarda la marcatura, la generazione di animali transgenici con proteine di fusione marcate in fluorescenza per l'imaging dal vivo è descritta nel video di accompagnamento sull'analisi della tubulogenesi del canale escretore. Tali animali possono essere utilizzati direttamente negli esperimenti RNAi. La terza generazione è in genere il primo passo in questa combinazione di procedure.

Questo video inizia con il metodo di marcatura alternativo: la colorazione degli anticorpi per la quale gli animali devono essere fissati. Le diverse procedure di marcatura possono essere combinate con l'immunoistochimica tipicamente utilizzata per l'analisi finale di imaging. Questo protocollo contiene anche esempi di marcatori di membrana specifici per l'intestino, promotori e altre risorse utili per entrambe le procedure di marcatura.

Dopo aver dimostrato l'immunoistochimica, questo video utilizza un ceppo transgenico che marca la membrana apicale intestinale con ERM-1 GFP per cercare i fenotipi di polarità e morfogenesi del lume utilizzando l'RNAi. Per prima cosa prepara una diapositiva per fissare i vermi. Pipettare 30 microlitri di poli-L-lisina su un vetrino, quindi posizionare un secondo vetrino sull'altro e lasciarli cadere insieme per distribuire uniformemente la soluzione su entrambi.

Ora staccate i due vetrini e lasciateli asciugare all'aria per 30 minuti. Quindi, posiziona un blocco di metallo piatto in un contenitore riempito con azoto liquido. Lavare le piastre con la soluzione M9 e trasferire circa 10 microlitri di M9 contenente i vermi.

In alternativa, raccogli i vermi e aggiungi M9 alla diapositiva. Una volta che i vermi sono stati trasferiti, far cadere delicatamente un vetrino coprioggetti a croce su di essi in modo che il vetrino coprioggetti penda da un bordo. Quindi premere delicatamente il vetrino coprioggetto senza effettuare movimenti laterali.

Ora trasferisci immediatamente il vetrino sul blocco metallico in azoto liquido e lascialo congelare. Dopo cinque minuti, rimuovere il vetrino coprioggetto utilizzando il bordo sporgente. Fallo rapidamente per ottenere la corretta fessura della cuticola.

Quindi immergere il vetrino in un barattolo di vetro Coplin riempito di metanolo a meno 20 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, trasferire il vetrino in un barattolo di vetro Coplin pieno di acetone per altri cinque minuti alla stessa temperatura. I vetrini possono essere colorati direttamente o conservati a meno 20 gradi Celsius.

Rimuovere il vetrino dall'acetone e lasciarlo asciugare all'aria a temperatura ambiente. Successivamente, segna la posizione di un muro circolare di vaselina sul lato inferiore dello scivolo, quindi costruisci il muro di gelatina. Non strofinare via la gelatina durante questa procedura.

Quindi prepara una camera bagnata in un bidone con tovaglioli di carta bagnati e posiziona il vetrino su una griglia all'interno. Non deve esserci contatto tra gli asciugamani e lo scivolo o tra gli scivoli adiacenti. Ora pipetta abbastanza PBS nel cerchio di gelatina per coprire l'area.

Posizionare delicatamente la punta di una pipetta sul bordo del cerchio e lasciare che il fluido si disperda dolcemente sui vermi. Quindi chiudere il coperchio e attendere cinque minuti. Dopo cinque minuti inclinare il vetrino e aspirare lentamente il PBS facendo attenzione a non perdere i vermi dal vetrino.

Quindi riempi accuratamente il cerchio di gelatina con una soluzione bloccante appena preparata. E lasciare incubare il vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti sostituire la soluzione bloccante con una soluzione bloccante contenente l'anticorpo primario.

E incubare il vetrino a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo rimuovere l'anticorpo primario e lavare il vetrino applicando e rimuovendo la soluzione bloccante tre volte. Lasciare incubare ogni applicazione in blocco per 10 minuti.

Successivamente aggiungere l'anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante e incubare il vetrino per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente lavare il vetrino due volte con soluzione bloccante e poi una volta con PBS. Quindi rimuovere la maggior quantità possibile di PBS senza lasciare che il campione si asciughi e rimuovere con cura la gelatina attorno al campione.

Applicare una goccia di terreno di montaggio sul campione, seguita da un vetrino coprioggetti e da un sigillo per smalto per unghie. Quindi conservare i vetrini al buio a quattro gradi Celsius. Trasferisci la piastra della libreria RNAi da meno 80 gradi Celsius al ghiaccio secco.

Rimuovere il nastro sigillante. E trasferisci il clone di interesse su una coclea selettiva. Quindi striare il clone e far crescere i batteri durante la notte.

Prima di rimettere la piastra della libreria nel congelatore a meno 80 gradi Celsius, applicare un nuovo nastro sigillante. Il giorno successivo inoculare le colonie dalla piastra in aliquote da un millilitro di terreno liquido contenente ampicillina. Quindi agitarli per circa 14 ore a 37 gradi Celsius.

Il giorno seguente seminare 200 microlitri per clone su piastre RNAi separate. Lasciare asciugare le piastre e indurre la produzione di RNAi con un'incubazione notturna a temperatura ambiente. Il giorno dopo, trasferire cinque vermi dello stadio L4 su ciascuna piastra RNAi marcata con il gene specifico che è bersaglio.

Quindi trasferire le piastre in un'incubatrice, in genere a 20 gradi Celsius. Per prima cosa esaminare il controllo rispetto agli animali RNAi sotto luce intensa a basso e alto ingrandimento. Successivamente, esaminare gli animali di controllo rispetto agli animali RNAi sotto luce fluorescente sotto i filtri appropriati.

Scansiona sistematicamente una lastra con animali RNAi dall'alto a sinistra al basso a destra dell'intera lastra alla ricerca di fenotipi. Cerca gli animali che ti interessano. Per un esame più approfondito dei fenotipi RNAi selezionati, concentrarsi sull'intestino e utilizzare lo zoom per valutare i fenotipi della tubulogenesi e della morfogenesi del lume.

Per esaminare i vermi di interesse al microscopio confocale, prima montarli e immobilizzarli a mano, fare un sottile cerchio di grasso sottovuoto o vaselina su un vetrino. Lo strato di grasso deve essere sottile, non più spesso di 0,1 millimetri. Quindi aggiungi circa 3,5 microlitri di azoturo di sodio da 10 millimolari al centro del cerchio.

Quindi raccogliere rapidamente i vermi di interesse nella soluzione con un microscopio da dissezione prima che la soluzione si asciughi. Quindi applicare delicatamente un vetrino coprioggetti e fotografare gli animali entro 30 minuti. Esercitare una leggera pressione e verificare al microscopio che i vermi non galleggino in soluzione.

Sotto il microscopio confocale trova i vermi a bassa potenza e messa a fuoco. Quindi utilizzare un obiettivo a immersione in olio 60 o 100X per visualizzare e visualizzare l'intestino. Successivamente, esamina l'animale sotto luce fluorescente con il canale appropriato per selezionare le aree che mostrano il difetto cellulare di interesse.

Muoviti rapidamente per evitare lo sbiancamento delle foto. Quindi passa alla scansione laser e limita l'immagine all'intestino impostando i limiti di scansione sul lato dorsale e ventrale. Acquisire una serie di immagini e successivamente unire le immagini in un'unica immagine di proiezione.

Questo protocollo descrive come analizzare molecolarmente e sezionare visivamente la biogenesi della membrana polarizzata nell'intestino di C. elegans in via di sviluppo, dove la membrana apicale e la morfogenesi del lume coincidono. I domini apicali e basolaterali della membrana, le giunzioni associate alla membrana e il lume intestinale possono essere risolti e la loro relazione reciproca può essere esaminata durante lo sviluppo. Questi componenti subcellulari potrebbero essere marcati con anticorpi marcati in fluorescenza o proteine di fusione fluorescenti per la doppia o tripla marcatura, come descritto nell'articolo di accompagnamento.

I difetti del lume macroscopico possono essere scansionati rapidamente utilizzando un microscopio a fluorescenza da dissezione. Il linker del citoscheletro delle membrane apicali ERM-1 accoppiato alla GFP è un marcatore fortemente espresso utile per uno screening RNAi. Quando si utilizza questo marcatore, sono stati scoperti una serie di nuovi fenotipi di morfogenesi e polarità del lume intestinale, insieme ai loro difetti genetici sottostanti.

Quindi sono state utilizzate immagini con ingrandimento più elevato acquisite da una scansione laser confocale per esaminare più attentamente i fenotipi per comprendere meglio i difetti sottostanti. Alcuni fenotipi potrebbero essere quantificati. La quantificazione è stata utilizzata per confrontare tali difetti e monitorarne la progressione attraverso lo sviluppo.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come etichettare la membrana intestinale e i compartimenti della membrana endodontica mediante immunocolorazione e come analizzare i fenotipi RNAi funzionali della membrana polarizzata e della biogenesi del lume.