Name: Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Scopri la biogenesi della membrana polarizzata in vivo usando il canale escretore di C. elegans come modello unicellulare. Questo metodo combina tecniche di imaging e screening RNAi per analizzare la tubulogenesi.

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Ringraziamo M. Buechner (Università del Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) e il centro di genetica di Caenorhabditis , finanziato dal National Institutes of Health, ufficio di infrastrutture di ricerca Programmi (P40 OD010440). Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM078653, MGH è 224570 e SAA 223809 a V.G.

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Versatilità genetica c. elegans , trasparenza, piano corpo semplice e stirpe delle cellule invarianti tutti ne fanno un eccellente modello per l'analisi della morfogenesi. Questo protocollo viene descritto come combinare standard manipolazioni genetiche e imaging studi per poter sfruttare il 2 micron sottile c. elegans canali escretori per studiare membrana polarizzata e biogenesi intracellulare lumen in un tubo di singola cellula.
Etichettatura I canali e...

Tutti gli organi interni sono composti da tubi, cruciale per loro molte funzioni diverse, come ad esempio il trasporto e scambio di gas, liquidi e sostanze nutritive e l'escrezione dei rifiuti metabolici. Loro carattere polarizzato, con membrane apicali e lumenal distinte, è adattato a queste specifiche funzioni, e difetti nella biogenesi dei loro sistemi endo - e della membrana plasmatica sono una causa frequente di malattia umana1,2. La maggior parte dei tubi del sistema vascolare e degli organi interni è pluricellulare e forma un lume intercellularmente; Tuttavia, tubi unicellulari, che formano il lume intracellulare, possono, ad esempio, rappresentare tanto quanto 30 – 50% dei letti capillari umano2. Le membrane polarizzate di multi - e tubi unicellulari sono simili nella composizione, anche loro microdomini possono differire in base alla funzione specifica del tubo (ad es., canaliculi canale escretore contro i microvilli intestinali in Caenorhabditis elegans; Vedi che accompagna il libro su c. elegans intestinale tubulogenesis)3. I principi della biogenesi della membrana polarizzata e tubulogenesis sono conservati tra i metazoi, e un simile macchinario molecolare li dirige1,2,4.
Il sistema escretore di c. elegans è costituito da cinque celle: poro escretore delle cellule (CE), delle cellule del condotto (DC), cellulare (PC) e due cellule della ghiandola. Ablazione del CE, DC o PC provoca l'accumulo di liquidi nella cavità del corpo e animali muoiono un precoce stadio larvale di5. Curiosamente, questi tre tubi unicellulari creano loro lumi in tre modi diversi: dalla cella di vuotatura (CE); avvolgimento di cellulare accoppiato con formazione di giunzione di autocellular (PC); e avvolgendo cellulare accoppiato con autofusion (DC); diversi meccanismi della morfogenesi lumen che sono tutti filogeneticamente conservate6,7. La CE, situata sul lato sinistro laterale del bulbo pharyngeal posteriore, manda due estensioni laterali da cui si diramano i quattro canali estendere anteriormente e posteriormente (su entrambi i lati destro e sinistro) per la punta del naso del verme e coda , rispettivamente (Figura 1)5,6,8. La CE si estende da circa 1 µm a 2 x 1.000 µm, rendendo la cellula più grande nell'animale. A livello subcellulare, il canale escretore è un semplice tubo, generato da una membrana basale diretto verso il pseudocoelom e incanalato da una membrana di lumenal (endotube). La membrana di lumenal canal si connette alla membrana lumenal condotto alla sua giunzione solo intercellulare; i canali sono altrimenti junctionless lungo la loro lunghezza (Figura 1). La membrana di lumenal canale escretore e sua submembraneous citoscheletro sono apicali, definito dalla loro composizione molecolare che ricorda la composizione della membrana apicale e citoscheletro submembraneous di tubi pluricellulari, come l'intestino, e di altri epiteli (ad es., piatto). Organelli citoplasmici, tra cui endosomal vescicolare e altri (ad es., Golgi) livello delle endomembrane è distribuiti lungo la lunghezza del canale. Inoltre, più vescicole canalicular - collegato alla membrana lumenal, e/o interconnessi o isolato - sono filettate attraverso il canale citoplasma7,8,9,10 . Questa connessione dinamica del plasma-membrana/canalicular ulteriormente espande il sistema a membrana del canale e contribuisce a entrambi di morfogenesi e osmoregolazione del lume10. Il canale escretore pertanto costituito quasi interamente endo - e membrane plasmatiche, fornendo un eccellente modello per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata e la regolazione della endo-all'interfaccia della membrana plasmatica. La drammatica espansione della membrana apicale durante la morfogenesi di canal - in questo sistema di cella singola coincida con estensione lumen – permette anche di analizzare i problemi architettonici derivanti dalla necessità di stabilizzare e centrare una membrana di lumenal intracellulare . Questo protocollo si concentra sull'analisi della morfogenesi strutturale di canale tubo e di lumen e le dinamiche di membrana intracellulare necessarie per questo processo, piuttosto che sui segnali che indirizzano i movimenti delle cellule che generano la posizione della CE nella sistema escretore e costruire i suoi intricati collegamenti ad altri elementi cellulari (rivisto in6).
Un ulteriore vantaggio del sistema di c. elegans unicellulare canal per l'analisi della membrana polarizzata e biogenesi lumen intracellulare è la sua capacità di separare, nel tempo inerente allo sviluppo, la generazione delle diverse componenti della sue membrane e giunzioni. La CE è nato al momento della chiusura ventrale e si deposita ventro-laterale della faringe durante metà embriogenesi5,6,8, durante il quale si verificano tempo canale laterale estensione e ramificazione. Questo è seguito dall'estensione antero-posteriore canale durante l'embriogenesi tardiva, un processo che continua nella fase L1-larvale (Figura 1). In una larva appena schiusi, la punta posteriore del canale raggiunge circa la metà del worm, completamente estendere a coda alla fine della fase L1, dopo di che il canale si allunga con il verme8. Crescita attiva canale ad una velocità superiore a quella della crescita dell'animale così si conclude la prima fase larvale, tuttavia, ulteriore crescita avviene in parallelo con la crescita dell'intero animale durante gli stadi larvali aggiuntive (L2 – 4). Questa impostazione offre l'opportunità di analizzare diversi passaggi della biogenesi di membrana de novo polarizzata indipendente di divisione delle cellule polarizzata o migrazione. Inoltre, permette la separazione di questo processo dall'assemblaggio di raccordi (che si verificano nell'embrione prima dell'inizio di lumen); loro esigenza esatta nella polarizzazione di membrana è ancora una questione aperta nel campo di polarità. Infine, si separa in modo univoco apicale dall'espansione di membrana basale, il processo di quest'ultimo precede l'ex nei canali escretori10. Il modello di canale escretore elegans del c. è quindi un complemento particolarmente istruttivo al modello intestinale che condivide un certo numero di questi vantaggi per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata, ma viene eseguito in un ambiente multicellulare (Vedi il libro d'accompagnamento sul tubulogenesis intestinale3).
Anche se selvaggio-tipo canali sono tubuli ultrasottili in questo minuscolo verme, loro lumi possono essere visualized direttamente dall'ottica di Nomarski in questo animale trasparente. Infatti, morfologie mutante canale cistico possono essere caratterizzate in animali senza etichetta usando l'ingrandimento basso microscopia, che è stato utilizzato con grande efficacia in avanti schermi genetici per identificare i geni coinvolti nella tubulogenesis11di dissezione. Visualizzazione migliore della morfologia dei canali e distinzione delle loro membrane polarizzate, componenti citoscheletriche, diversi organelli intracellulari e altre strutture subcellulari, tuttavia, richiede etichettatura e maggiore potenza fluorescenti microscopia confocale e dissezione. Anche se la struttura fine dei canali pone una serie di difficoltà per l'etichettatura e la microscopia, membrane e componenti sottocellulari possono essere distinto tramite le molecole specifiche univoche per ogni vano, e gli animali possono essere montati in modo sicuro per microscopia se alcune precauzioni per evitare di introdurre artefatti (Vedi protocollo e discussione). Etichettatura può essere fatto mediante immunoistochimica nei campioni fissati, o generando vermi transgenici che esprimono le proteine di fusione fluorescenti sotto il controllo dei loro propri o escretori canal specifici promotori per l'imaging in vivo . Questo protocollo descrive la seconda tecnica di etichettatura (Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale per anticorpo che macchia3).
La capacità di combinare in vivo studi perdita o guadagno di funzione con in vivo imaging analisi a singola cella di livello in tutto lo sviluppo rende il canale escretore di c. elegans un modello particolarmente forte per il molecolare e analisi cellulare del tubulogenesis unicellulari. Marcia avanti o retromarcia schermi genetici possono essere eseguiti a partire con un animale transgenico wild-type o con etichettato per identificare il canale morfogenesi fenotipi (per esempio, cisti) e loro difetti del gene sottostante. In alternativa, tali schermi possono iniziare con un fenotipo mutante (ad esempio, un canale cistico) e identificare soppressori o esaltatori di questo fenotipo per identificare i geni che interagiscono funzionalmente con il gene che causa il fenotipo mutante. Il difetto genetico che causa il fenotipo mutante può indurre una perdita (ad es., tramite omissione del gene) o un aumento (ad es., tramite una mutazione d'attivazione o tramite l'introduzione di copie del gene in eccesso) della funzione oggetto dell'inchiesta. Trasmettere la mutagenesi o RNAi sistematica schermi senza preconcetti sulla funzione del gene e permettano l'identificazione imparziale di geni coinvolti nella funzione di interesse. Data la disponibilità di RNAi genoma librerie di alimentazione, quasi ogni gene può essere facilmente abbattuto da RNAi in c. elegans, tale che ogni singolo gene di interesse o qualsiasi gruppo di geni (ad es., nelle schermate mirati) anche può essere rapidamente sondato per il loro effetto in un approccio di genetica inversa. Per dimostrare una possibile combinazione di approcci, descriviamo qui una schermata di interazione RNAi mirata, a partire con un mutante di guadagno di funzione cistica canale escretore, etichettati con la proteina fluorescente citoplasmico canale verde (GFP). Il fenotipo mutante è stato generato da una sovraespressione di erm-1, un altamente conservata di c. elegans ortholog della famiglia del linker membrana-actina ezrina-radixina-moesina (ERM), che è stato implicato nella morfogenesi del lume e della membrana organizzazione in molte specie12. C. elegans ERM-1 si localizza lumenal membrane degli organi interni, come ad esempio il canale escretore e intestino ed è necessario per la formazione di lumen in sia13. Sovraespressione di ERM-1 recluta actina in eccesso e vescicole alla membrana lumenal del canale, aumentando il flusso nel lumen e generando un breve canale cistico e una membrana di lumenal aggraffata con actina ispessita sottopelo9. Il protocollo descrive come generare ceppi transgenici con escretivo-canal-espresso etichettato proteine di fusione (o altre proteine); come eseguire mirati schermi RNAi a partire con tali ceppi, per identificare i modificatori di un fenotipo di canale; e come analizzare visivamente i risultati di tali schermi di dissezione e confocale microscopia a fluorescenza tra cui semplici modi per quantificare tubulogenesis informativo fenotipi. Alternativa i dettagli del RNAi, regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale e tecniche di etichettatura si trovano nel libro d'accompagnamento sulla tubulogenesis intestinale3. Tutti i metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per l'indagine sulle altre domande sul canale tubulogenesis.

<table><tbody><tr><td>Cloning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pPD95.75</td><td>Addgene</td><td>Cat. No. 37464</td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>Cat. No. 27106</td><td></td></tr><tr><td>Kit di legatura</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. No. E2611L</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. No. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio grado DNA Fisher</td><td>Scientific</td><td>Cat. No. BP164-100</td><td></td></tr><tr><td>Cellule competenti</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. No. C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Cat. No. ED-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine&nbsp;</td><td>MJ Research</td><td>Cat. No. PTG-200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>gatto. No. 5415C</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>di precisione scientifica&nbsp;</td><td>gatto. n. 666A3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strumento da corsa in gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. 09-528-165</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore per la corsa in gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. 45-000-465</td><td></td></tr><tr><td>Imager molecolare Gel Doc XR Sistema</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. No. 1708195EDU</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. No. ND1000</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans related1</td><td>1vedi riferimento19 per le procedure standard di coltura e manutenzione di C. elegans.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Medium e piastre2</td><td></td><td></td><td>2vedi riferimento19 per i protocolli.</td></tr><tr><td>Triptone&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>N. cat. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Biosciences</td><td>N. cat. 212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>N. cat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>N. cat. 214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>n. cat. A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>N. cat. BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium2</td><td></td><td></td><td>2vedere riferimento19 per i protocolli.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>N. cat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM placche 2</td><td></td><td></td><td>2vedi riferimento19 per i protocolli.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>N. cat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>N. cat. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Triptone&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>N. cat. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>N. cat. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>N. cat. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N. cat. C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N. cat. P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi plates3</td><td></td><td></td><td>3vedi riferimento21 per i protocolli.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>N. cat. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>N. cat. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Triptone&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>N. cat. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>N. cat. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>N. cat. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N. cat. C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N. cat. P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>N. cat. P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>Cat. n. I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. n. BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>N. cat. SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. n. 50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 batteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 batteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Librerie di RNAi a livello di genoma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Libreria di alimentazione RNAi a livello di genoma Ahringer (ref21,58,59)Fonte:</td> <td>BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans, libreria di alimentazione ORF-RNAi (ref60)Fonte:</td> <td>BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>MP Biomedicals,LLG,</td><td>n. cat. 193917</td><td></td></tr><tr><td> Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasso sottovuoto Silicone</td><td>Beckman</td><td>N. cat. 335148</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. n. 4448</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale, 6 pozzetti</td><td>Corning Inc.</td><td>Codice cat. 08-772-33</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione SMZ-U (Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione SZX12 (Olympus), dotato di un attacco a fluorescenza stereo ad alta potenza (Kramer Scientific), fotocamera CCD con software di acquisizione Q e lampada fluorescente X-Cite (Photonic Solutions).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SL Microscopio confocale a scansione laser (Leica Microsystem)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale a scansione laser C2 montato su un microscopio invertito ECLIPSE Ti-E (Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

il canale di excretory c. elegans come un modello per intracellulare lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata in vivo in una singola cella: etichettatura di gfp-fusioni, schermata di interazione di rnai e imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

I quattro canali escretori c. elegans sono tubi stretti estese attraverso la lunghezza dell'animale da una singola cellula, con quasi altrettanto lontano estesa endotubes intracellulare che costruiscono e stabilizzare il lume con una membrana e submembraneous citoscheletro di carattere apicale. La cella escretore si espande la sua lunghezza circa 2.000 volte per generare questi canali, rendendo questo modello unico per la valutazione in vivo della biogenesi di membrana de novo polarizzato, morfogenesi lumen intracellulare e unicellulari tubulogenesis. Il protocollo presentato qui illustra come combinare standard di etichettatura, guadagno e perdita di-funzione genetica o interferenza del RNA (RNAi)-e approcci al microscopio per utilizzare questo modello per sezionare visivamente e funzionalmente analizzare questi processi a livello molecolare. Come esempio di un approccio d'etichettatura, il protocollo delinea la generazione di animali transgenici con proteine di fusione fluorescenti per analisi live di tubulogenesis. Come esempio di un approccio genetico, accentua i punti chiave di un visual schermo di interazione basato su RNAi progettato per modificare un fenotipo di guadagno di funzione canale cistico. I metodi specifici descritti sono come: etichetta e visualizzare i canali di esprimere proteine fluorescenti; costruire una libreria di RNAi mirata e strategize RNAi di screening per l'analisi molecolare della morfogenesi canal; valutare visivamente le modifiche di fenotipi di canale; Punteggio loro dissecando microscopia di fluorescenza; caratterizzare le componenti sottocellulari canal a risoluzione superiore mediante microscopia confocale; e quantificare i parametri visual. L'approccio è utile per l'investigatore che è interessato a sfruttare il canale escretore di c. elegans per identificare e caratterizzare geni coinvolti nei processi filogeneticamente conservati del lumen intracellulare e unicellulari morfogenesi del tubo.

Questo protocollo viene descritto come utilizzare i canali escretori di c. elegans analizzare visivamente e molecolarmente tubulogenesis unicellulari e morfogenesi intracellulare lume in una singola cella. Durante la loro estensione dal momento dell'embriogenesi metà fino all'età adulta, i quattro canali escretori continuano a espandere la loro basolaterale e membrane apicali/lumenal insieme al loro sistema di endomembrane canalicular ed endosomal, fornendo un modello unico per l...

Il canale escretore di c. elegans è un modello unico di singola cellula per l'analisi visiva in vivo della biogenesi della membrana de novo polarizzato. Questo protocollo descrive una combinazione di standard genetico/RNAi e approcci, adattabili per l'identificazione e la caratterizzazione di molecole dirigere tubulogenesis unicellulari e biogenesi lumen e membrana apicale di imaging.

Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

L'obiettivo generale di questa combinazione di procedure standard è dimostrare come il canale escretore di C.elegans possa essere utilizzato per l'analisi in vivo di un tubo unicellulare, di una lumina intracellulare e della biogenesi di membrane polarizzate de novo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della tubulogenesi e della polarità, ad esempio come venga stabilita una lumina intracellulare estesa o quali molecole siano necessarie per espandere una membrana apicale. Il principale vantaggio di questo sistema modello è che un'enorme espansione di 2000 volte della membrana apicale rispetto a quella basolaterale può essere verificata visivamente in vivo all'interno di una singola cellula.Generalmente, le persone alle prime armi con questo modello incontreranno difficoltà perché il canale escretore di C.elegans è molto sottile e sensibile allo stress osmotico e a qualsiasi manipolazione necessaria per l'acquisizione di immagini. Questo video sulla tubulogenesi del canale escretore è accompagnato da un video sulla tubulogenesi intestinale, modelli reciprocamente informativi per l'analisi in vivo della biogenesi della membrana polarizzata. Per quanto riguarda l'etichettatura, il video accompagnatorio sulla tubulogenesi intestinale descrive la procedura alternativa di marcatura, che prevede la colorazione di componenti cellulari con anticorpi marcati fluorescentemente.Questa tecnica è applicabile anche al canale escretore. Questo video descrive l'analisi di imaging in vivo utilizzando animali con proteine di fusione marcate con fluorescenza. Nel testo sono descritte la costruzione di un plasmide contenente un gene di interesse collegato a GFP e la generazione di animali transgenici che esprimono una proteina di fusione.Il protocollo presenta anche esempi di marcatori specifici della membrana del canale escretore, marcatori di organelli e promotori. Sono inoltre fornite altre risorse per entrambe le procedure di marcatura. In questo video, una linea transgenica che marca il citoplasma del canale con GFP e presenta un fenotipo di canale cistico viene analizzata per identificare modificatori mediante RNAi.Il fenotipo è causato dalla sovraespressione di ERM-1, un gene coinvolto nella morfogenesi della luce. Da una coltura notturna di batteri esprimenti RNAi su piastre con ampicillina e tetraciclina, selezionare le colonie e inocularle in 600 microlitri di terreno LB liquido contenente ampicillina. Incubare questi tubi a 37 gradi Celsius in agitazione per sei ore.Da colture liquide, seminare aliquote di 70 microlitri nelle pozzette di piastre RNAi a sei pozzette, in duplicato o triplicato. Successivamente, incubare le piastre RNAi durante la notte a 20-22 gradi Celsius. La mattina seguente, selezionare tre vermi allo stadio L4 e trasferirli in ciascuna pozzetta delle piastre RNAi.Ognuno dovrebbe apparire sano, ben nutrito e dovrebbe esprimere il marcatore appropriato nel canale escretore. Successivamente, incubare le piastre a 20-22 gradi Celsius per tre giorni. Dopo tre giorni di consumo di batteri RNAi, esaminare i fenotipi del canale nei progeni F1 mediante microscopio fluorescente stereoscopico.Per valutare l'estensione del canale, esaminare i vermi allo stadio larvale L3 L4. Per questa procedura, utilizzare un foglio di valutazione per lo screening che includa tutti i fenotipi possibili. Nel protocollo testuale vengono descritti diversi fenotipi del canale.Scansionare sistematicamente i pozzetti, iniziando da un controllo, ad esempio vermi alimentati con batteri RNAi con vettore vuoto. Utilizzare prima una luce intensa a basso ingrandimento e poi ad alto ingrandimento per individuare fenotipi generali come letalità embrionale, sterilità, aspetto trasparente e aspetto tozzo. Scheda di valutazione, riportare queste osservazioni.In secondo luogo, sotto luce fluorescente, esaminare i fenotipi del canale escretore, prima a basso ingrandimento e poi ad alto ingrandimento. Ingrandire e valutare fenotipi quantificabili come la lunghezza del canale, la larghezza della luz, o le dimensioni dei cisti. Plasmidi marcatori come role possono risultare utili per l'analisi, poiché mantengono gli animali sul posto invece di farli muovere in avanti.Può inoltre fornire una visione migliorata del fenotipo con l'animale che ruota su se stesso. Valutare almeno 100 animali per piastra per un'analisi quantitativa che tenga conto di fenotipi con penetranza più bassa. Eseguire questi esperimenti in triplicato.Durante questo processo, acquisire immagini dei fenotipi predominanti da almeno tre animali diversi utilizzando una telecamera CCD e un software di acquisizione delle immagini. Successivamente, acquisire immagini sia a ingrandimenti inferiori che superiori. Per analizzare i vermi di interesse mediante microscopia confocale, montarli e immobilizzarli prima di tutto.Manualmente, applicare un sottile cerchio di grasso da vuoto o vaselina su un vetrino. Lo strato di grasso non deve essere più spesso di 0,1 millimetri. Successivamente, aggiungere circa sei microlitri di soluzione di lidocaina al cinque percento al centro del cerchio.Quindi, prelevare rapidamente i vermi di interesse nella soluzione utilizzando un microscopio stereoscopico, prima che la soluzione si asciughi. Successivamente, posizionare delicatamente un coprioggetto sul cerchio di grasso e lasciarlo adagiare sotto il proprio peso. Verificare l'immobilità utilizzando un microscopio stereoscopico.I vermi devono essere integri e aderire al vetrino, non galleggiare nella soluzione. Ora, posizionare una goccia di olio sul coprioggetto e mettere a fuoco i vermi alla luce brillante utilizzando un obiettivo 10x su un microscopio confocale. Successivamente, passare con attenzione a un obiettivo a immersione in olio e passare all'illuminazione in fluorescenza per osservare i canali escretori marcati.Ora, esaminare i fenotipi cellulari e subcellulari dei canali escretori per individuare un campione adatto all'immagine. Lavorare rapidamente per evitare il fotobiancamento. Osservare la forma della luz, il diametro della luz e le dimensioni e la forma delle cisti.Esaminare inoltre i componenti subcellulari marcati per l'analisi, come la membrana apicale, la membrana basale, il citoplasma, le vescicole o gli organelli. Utilizzando i controlli del software, regolare l'intensità del laser e acquisire le immagini. Per la migliore risoluzione, utilizzare un guadagno basso, non aprire eccessivamente il diaframma e impiegare circa quattro medie per immagine.Inoltre, non saturare eccessivamente l'intensità del colore. Acquisire prima un'immagine di una singola sezione, quindi acquisire un'immagine di più sezioni lungo l'asse z. Generalmente sono sufficienti da 15 a 20 sezioni.Creando una parentesi su una regione specifica del canale escretore nell'area di scansione nel pannello di controllo, è possibile ingrandire un'area del canale. Per canali marcati con doppia o multipla etichettatura, è fondamentale utilizzare la scansione sequenziale per evitare il passaggio incrociato tra i canali. In caso contrario, gli studi di co-localizzazione dei segnali non saranno accurati.Contemporaneamente, acquisire le corrispondenti immagini DIC Nomarski per quantificare la lunghezza del canale o i diametri della luce in relazione alla lunghezza e al diametro del corpo del verme. Successivamente, sovrapporre le immagini a fluorescenza e quelle Nomarski per evidenziare i punti di riferimento. Questo protocollo descrive come utilizzare i canali escretori di C. elegans per analizzare visivamente e a livello molecolare la tubulogenesi unicellulare e la morfogenesi della luce intracellulare in una singola cellula.Componenti subcellulari come membrane apicali, citoplasma e vescicole endosomiali rispetto a vescicole canalicolari possono essere visualizzati e distinti nella stessa cellula, utilizzando proteine di fusione fluorescenti specifiche per ciascun componente. Un verme che sovraesprime una molecola associata alla membrana apicale chiamata ERM-1 è stato nutrito con batteri RNAi per eseguire uno screening di modifiche del suo fenotipo unico del canale escretore. Suppressor e potenziatori sono stati identificati mediante un microscopio dissettore fluorescente.Molti aspetti subcellulari dei fenotipi modificati possono essere esaminati in dettaglio a ingrandimento maggiore mediante microscopia confocale. Tra questi vi sono membrane anomale, cisti luminali anziché vacuoli citoplasmatici, localizzazione di canalicoli intracellulari, lume discontinuo con morfologia anomala delle estremità dei canali, difetti di estensione tra lume e canale e reclutamento di componenti subcellulari verso il lume. Molti degli effetti indotti da soppressori e potenziatori del fenotipo causato da ERM-1 possono essere quantificati, come ad esempio la dimensione delle cisti, la lunghezza dei canali e i componenti subcellulari marcati con fluorescenza.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare le procedure standard di RNAi e di ERM per caratterizzare i fenotipi dei canali escretori di C. elegans mediante microscopi fluorescenti stereoscopici e confocali. Utilizzando queste tecniche, si dovrebbe essere in grado di studiare la biogenesi de novo delle membrane polarizzate e la tubulogenesi in una singola cellula in animali vivi.

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Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.

Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

Qui, presentiamo un approccio combinatorio utilizzando microscopia ad alta risoluzione, strumenti computazionali, e l'etichettatura a cella singola in vivente embrioni C. elegans per comprendere le singole dinamiche delle cellule durante il neurosviluppo.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l'imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive l'imaging time-lapse basato su microfluidica di C. elegans durante l'intero sviluppo post-embrionale.

Imaging ad alta risoluzione di C. elegans in tutti gli stadi larvali

Scopri la biogenesi della membrana polarizzata in vivo usando il canale escretore di C. elegans come modello unicellulare. Questo metodo combina tecniche di imaging e screening RNAi per analizzare la tubulogenesi.

Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging (Video) | JoVE Journal

Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

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