Name: Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Impara la stima stereologica dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mouse utilizzando microscopia standard. Questo metodo accessibile supporta la ricerca preclinica sul morbo di Parkinson con conteggi cellulari accurati.

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Gli autori sono grati a Keali Röhm, Louisa Frieß e Heike Menzel per loro assistenza tecnica; a Helga Brünner per la cura degli animali; e a Chistopher S. Ward per la generazione e la distribuzione del disector ottico griglia plugin per il software ImageJ.

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</ol>

C. W. I. ha servito su comitati scientifici per Merz Pharmaceuticals, LLC e TEVA; ha ricevuto finanziamenti per viaggi da Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC e Allergan, Inc.; e ha ricevuto onorari altoparlante da Merz, TEVA e Allergan, Inc. di fuori del lavoro presentato. J. V. ha lavorato come consulente per Boston Scientific, Medtronic e AbbVie e ha ricevuto onorari da Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan e GlobalKinetics di fuori del lavoro presentato.

Stereology inizia con lavorazione del tessuto. Il taglio seriale del tessuto SN deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita delle sezioni durante l'analisi STEREOLOGICHE. Inoltre, un passo essenziale consiste nel contrassegnare un emisfero al fine di distinguere la destra dalla sinistra SN durante l'esecuzione di ansia. Immissione di un piccolo foro nella parte superiore del tronco cerebrale generato i risultati migliori nello studio presentato. Inoltre, dal lavorare con le esigenze di metodo frazionatore ...

La quantificazione del numero di cellulare di un neurone è fondamentale nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson per determinare il livello della neurodegenerazione nel nigra di substantia (SN)1,2. La valutazione imparziale stereologiche del numero delle cellule in una regione di interesse è considerata il gold standard3,4,5.
Prima dell'avvento di stereology imparziale, il numero dei neuroni nelle sezioni è stato valutato mediante la manipolazione delle cellule contate profili per correggere le probabilità variabile che neuroni entrano in vista in una sezione. Uno dei metodi più comunemente usati era la correzione dell'emocromo quantificati descritto da Abercrombie6. Questo metodo ha tentato di prendere in considerazione che le cellule possono essere quantificate in più di una volta se frammenti della stessa cella si trovano nelle sezioni sottili adiacenti. Di conseguenza, Abercrombie e altri autori generato equazioni che ha richiesto le ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate7,8. Tuttavia, questi presupposti erano solitamente non realizzati e quindi portati a errori sistematici e divergenza dal numero effettivo della cella (cioè, polarizzazione). Inoltre, il bias non potrebbe essere ridotto di campionamento supplementare3.
Per la stima stereologiche di numeri di cellulare usando il frazionatore ottico, principi matematici sono applicati per valutare direttamente i numeri di cellulare direttamente in un volume definito, 3-dimensionale. Il vantaggio di questo metodo è che non comporta ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate. Così, i numeri di cellulare stimato sono più vicini ai valori true e avvicinarsi man mano che aumenta la dimensione del campione (cioè, imparziali)3. Perché molte regole devono essere seguite quando usando stereology per mantenere il metodo imparziale, sono stati sviluppati sistemi di ready-to-use commerciale stereology (per la revisione, Vedi Schmitz e Hof, 2005,4). Sistemi specializzati stereology implementano metodi stereologiche basati su progettazione con aprioristicamente definite sonde e sistemi di campionamento per le valutazioni stereologiche che portano all'indipendenza dalla forma, dimensione, distribuzione spaziale e orientamento della cellule per essere analizzati4,9. Tuttavia, i sistemi di stereology commercialmente disponibili sono costosi; Questo potrebbe limitare implementazione nella ricerca di nuove.
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare una tecnica utilizzabile per la stima stereologiche basati su progettazione della conta delle cellule dopaminergiche nel topo SN, impiegando il metodo ottico frazionatore e utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, luce microscopio, microscopio standard software e un motorizzato x, y, z fase). Per questo, è presentata una guida passo passo su come elaborare del tessuto di cervello di topo e come stimare i numeri di cell SN utilizzando stereology imparziali basati su progettazione. Inoltre, sono disponibili modelli per il calcolo dei numeri di cellulare stimato e coefficienti di errore (CE).
Il metodo qui descritto non è limitato all'analisi dello SN, ma può essere adattato per l'uso in altre regioni anatomicamente definite del cervello di topo o ratto. Per esempio, stereology imparziale è stato utilizzato per stimare i numeri di cellulare di un neurone l' ippocampo10 e il locus coeruleus11. Inoltre, tipi cellulari diversi da neuroni, astrociti12 e microglia13, possono essere valutati come bene. Pertanto, questo metodo può essere utile agli scienziati che intendono attuare stereology imparziale nella loro ricerca, ma non sono disposti a spendere un sacco di soldi per l'acquisto di un sistema di ansia.

<table><tbody><tr><td>Paxinos topo atlante</td><td></td><td></td><td>Il cervello del topo George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @ 2001 da Academic Press CD Rom designet & creato da Paul Halasz</td></tr><tr><td>cervello matrice affettatrice mouse</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio / D (+) Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>isopentano</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>fosfato soluzione salina tamponata ingredienti: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>fosfato monobasico</td><td>di potassio Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>fosfato acido dibasico diidrato</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>siero normale di capra</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>detergente</td></tr><tr><td>3,3-Diaminobenzidina-tetraidrocloruro/DAB compresse 10mg pH 7.0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H2O2/ Perossido di idrogeno 30%</td><td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>avidina/biotina reagente</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Kit di colorazione ABC ultra sensibile standard, 1:100</td></tr><tr><td>coniglio anti topo tirosina idrossilasi anticorpo</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>capra-anti-coniglio biotinilato IgG H+L</td><td>laboratori vettoriali</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator versione 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53</td><td>microscopio Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Versione 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr> plugin di sovrapposizione della griglia <tr><td>di ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td>secco</tr><tr><td></td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>contatore di celle plugin</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&nbsp;</td></tr><tr><td>macro disettore ottico</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N topi maschi</td><td>Charles River, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per oggetti rivestiti SuperFrost Plus</td><td>Langenbrinck, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago 25G Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO Pompa di infusione analogica</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>Sistema StereoInvestigator</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator versione 11.07</td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td>BX53</td><td>Microscopio BX53</td></tr><tr>stereologia <td></td><td></td><td>autoassortita</td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel nigra di substantia del mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia standard attrezzature

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson, analisi del tratto nigrostriatal, compresa la quantificazione di perdita di neuroni dopaminergici nel nigra di substantia, è essenziale. Per stimare il numero di neuroni dopaminergici totale, imparziale stereology utilizzando il metodo ottico frazionatore è attualmente considerato il gold standard. Poiché la teoria dietro il metodo ottico frazionatore è complessa e stereology è difficile da raggiungere senza attrezzature specializzate, esistono vari sistemi commercialmente disponibili stereology completi che includono il software necessario, puramente per cella contando i motivi. Dal momento che l'acquisto di un setup stereology specializzato non è sempre fattibile, per molte ragioni, questo rapporto descrive un metodo per la stima stereologiche del cellulare di un neurone dopaminergico conteggi mediante microscopia standard attrezzature, compreso un microscopio ottico, un tavola di oggetto (x, y, z aereo) motorizzata con software di imaging e un computer per l'analisi. È dato una spiegazione dettagliata su come eseguire stereologiche quantificazione mediante il metodo ottico frazionatore, e file di pre-programmati per il calcolo dei conteggi delle cellule stimato vengono forniti. Per valutare la precisione di questo metodo, è stato effettuato un confronto con i dati ottenuti da un apparato di stereology commercialmente disponibili. Numeri paragonabili delle cellule sono stati trovati usando questo protocollo e il dispositivo stereology, dimostrando così la precisione di questo protocollo per stereology imparziali.

Usando il metodo presentato, il numero stimato di TH + neuroni dopaminergici in SN ha variato fra cellule 7.363 e 7.987 a destra e, nella parte sinistra SN, tra le celle di 7.446 e 7.904. Così, il numero medio dei neuroni dopaminergici (± SEM) era 7.647 ± 83 cellule per il diritto SN e 7.675 ± 66 per la sinistra SN. La CE calcolata per ciascun animale è stato inferiore a 0,08 (gamma: 0,073-0,079) (Figura 7). Per accertare la comparabilità di questo metodo con...

Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per la valutazione imparziale stereologiche dei numeri di un neurone delle cellule dopaminergiche nel nigra di substantia del mouse utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, un microscopio ottico, una tabella di oggetto motorizzato (x, y, z aereo) e software di pubblico dominio per analisi digitale delle immagini.

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere la stima stereologica basata sulla progettazione del numero di cellule dopaminergiche nella SN del topo utilizzando un microscopio standard. Questo metodo è utile per stimare il numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra del topo nella ricerca preclinica sul morbo di Parkinson, mediante stereologia imparziale basata sul disegno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere eseguita con un microscopio standard, senza necessità di un sistema completo per stereologia disponibile in commercio.La procedura sarà dimostrata da Louisa Friez, una tecnica del mio laboratorio. Iniziare posizionando un cervello di topo fissato con paraformaldeide in una matrice cerebrale ed effettuare un taglio a +0,74 millimetri da bregma. Trasferire la parte caudale del cervello, inclusa la SN, in PFA al 4% in tampone 0,1 molare e fissare tutta la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, sostituire la PFA con saccarosio al 30% in PBS 0,1 molare e incubare per altri due giorni a quattro gradi Celsius per crioproteggere il campione. Dopo due giorni, quando il cervello sarà affondato nel saccarosio, posizionare il tessuto in uno stampo criogenico riempito con composto ottimale per la temperatura di taglio e congelare lentamente il tessuto nell'isopentano raffreddato con ghiaccio secco. Utilizzare un criostato per tagliare in serie sezioni criogeniche di 30 micron nel piano coronale.Contrassegnare l'emisfero destro praticando un piccolo foro nella regione superiore del tronco encefalico. Raccogliere quattro serie di sezioni partendo da meno 2,46 millimetri dalla bregma e terminando a 4,04 millimetri dalla bregma. Trasferire ciascuna serie di sezioni in un tubo riempito con crioprotettante e conservare a meno 20 gradi Celsius.Acquisire immagini digitali di sezioni del SN colorate immunohistochimicamente per la tirosina idrossilasi utilizzando un software di imaging abbinato a un microscopio. Iniziare determinando l'effettivo montaggio e lo spessore delle sezioni in tre siti di conteggio selezionati casualmente per ogni sezione. Prima fare clic su "view top offset" per definire il margine superiore della sezione.Quindi fare clic su stop visualizzazione superiore. Successivamente, fare clic su offset visualizzazione inferiore e poi su stop visualizzazione inferiore. Riportare lo spessore della sezione.Calcolare la zona di guardia sottraendo tre micron dall'offset superiore e digitare il risultato nel campo dell'offset superiore. Successivamente, sottrarre l'altezza di 13 micron dell'ottico dissecatore dal valore dell'offset superiore e digitare il risultato nel campo dell'offset inferiore. Selezionare i seguenti parametri, passaggi 14, dimensione 1,00.Selezionare la directory in cui salvare il file. Fare clic su sequenza per avviare l'acquisizione. Dopo aver acquisito le immagini, fare clic su elaborazione e selezionare i seguenti parametri: tutti i piani dalla sequenza, montaggio e le opzioni rapido e unione con un sovrapposizione delle immagini del 10%. Avviare l'unione delle immagini facendo clic su avvia.Questo genererà immagini sovrapposte per l'analisi. Per iniziare, aprire l'immagine facendo clic su file e apri. Impostare la scala dell'immagine utilizzando il comando analizza e imposta scala.A partire da questo passaggio, modificare la dimensione definita da pixel a micron. Selezionare i plugin, quindi la griglia, quindi il comando tipo griglia linee per inserire una griglia in modo casuale. Selezionare la casella di controllo offset casuale.Definire la dimensione di un quadrato all'interno della griglia come 130 micron per 130 micron, pari a 16.900 micron quadrati. Cambiare il tipo di immagine da 16 bit a colore RGB facendo clic sull'immagine, quindi su tipo e infine su colore RGB. Individuare la substantia nigra pars compacta.Circonda la regione con lo strumento pennello utilizzando una larghezza del pennello pari a 11. Annulla il comando di impostazione della scala cliccando su analizza, quindi su imposta scala e successivamente su rimuovi scala per effettuare i calcoli in pixel anziché in micron. Acquisisci una schermata, salva il file dell'immagine e apri il nuovo file con ImageJ.Selezionare lo strumento pennello e una larghezza di 25. Contrassegnare ogni quadrato della griglia che tocca la SN per la posizione di un dissecatore ottico. Selezionare un quadrato della griglia che includa parti della SN. Misurare l'angolo superiore sinistro del quadrato utilizzando il cursore in ImageJ per definire le coordinate iniziali x e y.Selezionare il modello di foglio di calcolo intitolato posizione del dissezionatore ottico e calcolare la posizione del dissezionatore ottico. Quindi stimare il numero di cellule utilizzando il foglio di calcolo per il calcolo del conteggio cellulare, come descritto nella parte scritta del protocollo. Questa immagine a basso ingrandimento mostra una sezione di cervello di topo dopo la colorazione per la tirosina idrossilasi (TH) per i neuroni dopaminergici.Un ingrandimento maggiore mostra neuroni dopaminergici positivi per la TH. L'insetto mostra la regione delimitata con un riquadro a maggiore ingrandimento. Questa immagine mostra una serie di sezioni del SN colorate per la TH che coprono l'intero SN del topo dalla parte rostrale a quella caudale.Ogni sezione è separata dalla sezione consecutiva da 120 micron. Il numero di neuroni positivi per la TH nella SN destra e sinistra del topo è stato stimato utilizzando il metodo mostrato in questo video e un sistema di stereologia disponibile in commercio. Come mostrato qui, entrambi i metodi hanno prodotto conteggi cellulari comparabili e non sono state riscontrate differenze significative tra i set di dati.Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, ad esempio guanti protettivi, durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del metodo per effettuare una stima stereologica non distorta del numero di neuroni dopaminergici nella sostanza nera del topo utilizzando il metodo della frazione ottica e un microscopio standard.

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Fonte: Olesen, M. V., et al. La tecnica del frazionamento ottico per stimare il numero di cellule in un modello di ratto di terapia elettroconvulsivante. J. Vis. Exp. (2017).  Il video mostra la tecnica per quantificare i neuroni appena generati nel tessuto cerebrale. Fette di tessuto ippocampale contenenti neuroni marcati con Bromodeossiuridina (BrdU) sono state colorate utilizzando l'immunoistochimica e successivamente quantificate attraverso lo spessore del tessuto utilizzando la tecnica del...

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Questo protocollo descrive due diverse manipolazioni ambientali e un protocollo di infusione cerebrale concomitante per studiare i cambiamenti cerebrali indotti dall'ambiente alla base del comportamento adattivo e della riparazione cerebrale nei topi adulti.

Modulazioni ambientali del numero di Mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Qui presentiamo un metodo stereologico, il frazionatore ottico, usato per quantificare la formazione di nuovi neuroni e la loro sopravvivenza nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione elettro-convulsiva. Quando viene correttamente implementata, la sensibilità e l'efficienza dei metodi stereologici garantiscono accurati stimi con una precisione fissa e predeterminata.

La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva

Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Lunghezza della fibra neuronale all'interno di una struttura tridimensionale di una regione del cervello è un parametro affidabile per quantificare specifica integrità strutturale neuronale o degenerazione. Questo articolo descrive in dettaglio un metodo di quantificazione stereologica per misurare la lunghezza della fibra colinergica all'interno del nucleo basalis di Meynert nei topi come esempio.

Stima stereologica della lunghezza della fibra colinergica nel Nucleus Basalis di Meynert del cervello del topo

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.

Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini

Impara la stima stereologica dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mouse utilizzando microscopia standard. Questo metodo accessibile supporta la ricerca preclinica sul morbo di Parkinson con conteggi cellulari accurati.

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature (Video) | JoVE Journal

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

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