Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

Una piattaforma di biosensore microfluidica è stata progettata e fabbricato con tecnologia photoresist film asciutto low-cost per la quantificazione rapida e sensibile di vari analiti. Questo sistema monouso consente la lettura elettrochimica di on-chip-immobilizzata analisi enzima-collegata mediante la tecnica della stop-flow.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre una piattaforma di biosensori microfluidici elettrochimici versatile basata sulla tecnologia di fotoresist a film secco a basso costo, in grado di misurare vari tipi di analiti a seconda del saggio enzimatico immobilizzato utilizzato successivamente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei test point of care, come la quantificazione di diversi farmaci, come gli antibiotici, o la diagnosi di varie malattie come il cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il biosensore qui presentato si basa principalmente su materiali a basso costo, facili da usare e altamente versatili in termini di applicazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi relativi ai fotoresist a film secco sono difficili da padroneggiare perché la manipolazione richiede molta formazione e pratica. A dimostrare l'immobilizzazione e la misurazione del saggio su chip sarà Eva Grether, un'assistente studentesca del mio gruppo. Per iniziare, taglia un substrato di poliimmide o PI in wafer rotondi da sei pollici.

Quindi, metti il wafer PI in forno a 120 gradi Celsius, per circa un'ora per una cottura disidratante. Per eseguire la prima fase di fotolitografia per il processo di decollo, programmare lo spin coder su un tempo di rotazione di 30 secondi a 3000 giri/min con un'accelerazione di 2000 giri/min al secondo. Posizionare il wafer PI sullo spin coder e fissarlo applicando il vuoto.

Quindi avviare il programma di codifica a rotazione ed erogare due millilitri di resist, consentendo il processo di decollo. Rimuovere il wafer dallo spin coder e cuocere delicatamente il wafer PI su una piastra calda per due minuti a 100 gradi Celsius. Regolare la maschera desiderata per modellare gli elettrodi sul wafer PI ad occhio nudo ed esporla a 400 millijoule per centesimo quadrato di luci UV.

Quindi posizionare il wafer in una ciotola riempita con uno sviluppatore resistente corrispondente su uno shaker orbitale e lasciarlo agitare leggermente per un minuto. Dopo aver rimosso l'access resist, utilizzare una doccia per sciacquare il wafer PI con acqua deionizzata su un banco bagnato, prima di asciugarlo con aria compressa. Successivamente, depositare il platino per la formazione degli elettrodi utilizzando un processo di deposizione fisica da vapore standard per depositare 200 nanometri di platino sul wafer.

Dopo aver posizionato il wafer in una ciotola, aggiungere il dispositivo di rimozione corrispondente alla ciotola e rimuovere il resist di sollevamento, agitando leggermente il wafer su uno shaker orbitale fino a rimuovere tutto il platino di accesso. Dopo il risciacquo e l'asciugatura del wafer PI come prima, eseguire la seconda fase di fotolitografia e pulire gli elettrodi come descritto nel protocollo di testo. Quindi, passivare i cuscinetti di contatto in platino del wafer con un nastro adesivo sensibile ai raggi UV.

Per fare ciò, taglia la pellicola in strisce larghe cinque millimetri e lunghe 11 centimetri e attaccale alla cialda, proteggendo le parti da non depositare con l'argento. Per la deposizione dell'argento, mettere un bagno sonico in una cappa chimica e inserire un contenitore di soluzione elettrolitica d'argento nel bagno. Impostare il bagno sonico a temperatura ambiente e depower al 10%Collegare il contatto di massa degli elettrodi di riferimento a una sorgente di corrente costante.

Quindi, collegare il controelettrodo, un filo d'argento immerso nella soluzione dell'elettrolita d'argento, alla sorgente di corrente, utilizzando cavi di collegamento standard. Impostare la sorgente di corrente su CC e su una densità di corrente di circa 4,5 milliampere per centimetro quadrato, ottenendo una velocità di deposizione dell'argento di circa 0,3 micron al minuto. Avvia il bagno sonico e lascia in funzione la sorgente di corrente per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, sciacquare il wafer con acqua deionizzata. Per eseguire la terza fase di fotolitografia, tagliare prima gli strati di fotoresist a film secco a una dimensione simile a quella del wafer. Fissare la maschera desiderata sull'unità di esposizione e allineare il livello DFR sulla maschera ad occhio nudo.

Quindi, illuminare il resist con 250 millijoule per centimetro quadrato di luce UV. Rimuovere la pellicola protettiva del fotoresist e sviluppare il resist per circa due minuti in una soluzione di carbonato di sodio all'1%, utilizzando un bagno sonico standard, preriscaldato a 42 gradi Celsius e alla potenza sonica del 100%Per interrompere immediatamente la reazione, agitare il resist per un minuto in un bagno di acido cloridrico all'1% su un agitatore orbitale. Risciacquare e asciugare ogni strato DFR come prima.

Per laminare gli strati DFR sul substrato PI, posizionare il wafer PI su una pellicola trasparente e fissarlo utilizzando un nastro adesivo standard. Regolare lo strato DFR del canale sul wafer PI al microscopio utilizzando le rispettive strutture di allineamento. Per la laminazione, utilizzare una laminatrice a caldo standard e preriscaldare il rullo superiore a 100 gradi Celsius e il rullo inferiore a 60 gradi Celsius.

Impostare la pressione a tre bar con una velocità di avanzamento di 0,3 metri al minuto. Posizionare il wafer con lo strato DFR fisso al centro del laminatore e avviarlo in modo che il DFR venga spinto attraverso il laminatore. Ripetere il passaggio dopo aver ruotato il wafer di 180 gradi.

Quindi, rimuovere lo strato protettivo dal lato anteriore dello strato del canale DFR posizionando del nastro adesivo standard a un'estremità del DFR e tirandolo verso l'alto. Utilizzare un dispenser manuale con tubi da 0,004 pollici per erogare piccole goccioline di politetrafluoroetilene disciolto nei pozzetti dello strato isolante. Per sigillare il chip microfluidico, laminare lo strato DFR di copertura sullo strato del canale come prima.

Quindi, indurire il biosensore microfluidico rimuovendo prima tutte le pellicole protettive sul coperchio e sugli strati DFR posteriori. Tagliare i biosensori a strisce utilizzando un normale paio di forbici. Infine, polimerizzare le patatine in forno a 160 gradi Celsius per tre ore.

Per assorbire l'avidina nell'area di immobilizzazione del canale, erogare due microlitri della soluzione di avidina nell'ingresso del biosensore. Per garantire che il fluido continui a fermarsi alla barriera durante l'intero tempo di incubazione, erogare due microlitri di acqua deionizzata all'uscita del chip. Incubare il chip a 25 gradi Celsius per un'ora in un contenitore chiuso.

Rimuovere i reagenti in eccesso attraverso l'ingresso del truciolo applicando il vuoto. Quindi, lavare il canale con 50 microlitri di tampone di lavaggio erogato sull'uscita durante l'applicazione del vuoto. Asciugare il canale per 30 secondi con il vuoto.

Bloccare la superficie del canale per inibire il legame non specifico con l'intestazione del tubo: due microlitri di soluzione all'1% di BSA sull'ingresso e due microlitri di acqua deionizzata sull'uscita del canale. Incubare il chip a 25 gradi Celsius per un'ora in un contenitore chiuso prima di rimuovere i reagenti di accesso e asciugare il canale come prima. Quindi, incubare gli oligo di DNA marcati con biotina e sei FAM erogando due microlitri di una concentrazione della soluzione di DNA all'ingresso e due microlitri di acqua deionizzata all'uscita.

Incubare il chip a 25 gradi Celsius per 15 minuti in un contenitore chiuso prima di rimuovere i reagenti di accesso e asciugare il canale. Per immobilizzare la glucosio ossidasi marcata con sei anticorpi FAM, introdurre due microlitri della soluzione anticorpale all'ingresso e due microlitri di acqua deionizzata all'uscita del canale. Ancora una volta, incubare gli anticorpi marcati a 25 gradi Celsius per 15 minuti in un contenitore chiuso prima di rimuovere i reagenti in eccesso.

Applicare il distanziatore fluidico in PMMA sul biosensore e collegare elettricamente il biosensore al potenziostato. Realizzare il collegamento fluidico della pompa a siringa con il biosensore utilizzando l'adattatore fluidico. Avviare manualmente la pompa a siringa con un PPS molare da 0,1 a una portata di 20 microlitri al minuto.

All'elettrodo di lavoro rispetto all'elettrodo di riferimento su chip, applicare 30 cicli di tensione alternata di 0,8 e 0,05 volt per cinque secondi ciascuno. Successivamente, ossidare l'elettrodo di lavoro applicando una tensione di 0,8 volt per 60 secondi. Per avviare la lettura del segnale del saggio, attendere che il segnale della corrente misurata si stabilizzi.

Arrestare la pompa a siringa e commutare il reagente da PPS 0,1 molare a una soluzione di glucosio da 40 millimolari prima di avviare il software sul controller della pompa a siringa. Dopo aver interrotto automaticamente il flusso per uno, due o cinque minuti, la pompa a siringa riavvierà nuovamente il flusso. Osservare il picco delle correnti risultanti.

Il biosensore elettrochimico contiene un singolo canale microfluidico con due aree distinte separate dalla barriera di arresto idrofobica. L'area di immobilizzazione, dove il saggio viene immobilizzato per semplice assorbimento delle biomolecole e la cella elettrochimica dove viene eseguita la lettura amperometrica del saggio. Per la lettura amperometrica del biosensore, viene utilizzata la cosiddetta tecnica di arresto del flusso.

Innanzitutto, viene applicato un flusso costante del substrato enzimatico glucosio. Dopo che il segnale si è stabilizzato, il flusso viene interrotto. Durante la fase di arresto, il glucosio viene convertito in perossido di idrogeno e si accumula nel canale.

Riavviando il flusso, il perossido di idrogeno viene scaricato attraverso la cella elettrochimica dove viene rilevato, determinando un picco di corrente. A seconda della quantità di analita legato, e quindi della quantità di glucosio ossidasi legata, l'altezza del segnale varia, il che si traduce in una curva di calibrazione di esempio, come mostrato qui. Una volta padroneggiato, la fabbricazione del biosensore può essere eseguita in circa 10 ore se eseguita correttamente.

Mentre il tempo di incubazione e lettura del saggio dipende dal test utilizzato, di solito può essere realizzato entro tre ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della fabbricazione su chip, della preparazione del saggio e del funzionamento dei biosensori elettrochimici basati su fotoresist a film secco. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che tutti i passaggi del protocollo siano seguiti rigorosamente ed eseguiti con grande cautela.

Poiché le prestazioni del sensore dipendono fortemente dal processo di fabbricazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una medicina personalizzata che copre la diagnosi in loco di diversi tipi di malattie e farmaci, e quindi facilita la terapia individualizzata. Non dimenticare che lavorare con soluzioni elettrolitiche d'argento può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare occhiali di sicurezza e guanti adeguati.