Name: Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Impara a realizzare biosensori elettrochimici microfluidici con film fotoresistenti a secco per diagnostica rapida point-of-care. Questa tecnica versatile consente la quantificazione di farmaci e malattie con materiali a basso costo.

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Gli autori vorrei ringraziare la Fondazione di ricerca tedesca (DFG) per finanziare parzialmente questo lavoro sotto Grant numeri UR 70/10-01 e UR 70/12-01.

1. fabbricazione della tecnologia microfluidica biosensore utilizzando DFR <ol><li>cialde di preparazione della PI.
	<ol><li>Taglio una PI substrato nella 6 - in cialde tonde. Mettere la cialda di PI in un forno a 120 ° C per circa 1 h per cuocere una disidratazione.</li>
	</ol></li> <li>Primo passo fotolitografia per il processo di Lift-off.
	<ol><li>Programma spin-spalmatrice a un tempo di 30 s filatura a 3.000 giri/min, con un'accelerazione di 2.000 giri/min/s. posto il wafer di PI su spin-coater e risolvere il problema, applicare il vuoto. Pipettare 2 mL di un resist, consentendo il processo di Lift-off e avviare il programma di spin coater. Rimuovere la cialda da spin-coater e soft-cuocia il wafer di PI su una piastra calda per 2 min a 100 ° C.</li>
		<li>Regolare la maschera desiderata per patterning gli elettrodi sul wafer PI con l'occhio nudo ed esporlo alla luce di 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Posto la cialda in una ciotola riempita con uno sviluppatore di resistere di corrispondenza su agitatore orbitale e lasciarlo agitare leggermente per 1 min.</li>
		<li>Dopo il resist in eccesso viene rimosso, è possibile utilizzare una doccia per sciacquare il wafer di PI con acqua deionizzata (acqua deionizzata) su una panchina umida e asciugarlo in seguito usando aria compressa.</li>
	</ol></li> <li>Deposizione di platino per la formazione degli elettrodi.
	<ol><li>Utilizzare un processo di deposizione di vapore fisico standard al deposito 200 nm di platino sul wafer 19.</li>
		<li>Mettere la cialda in una ciotola. Aggiungere il remover corrispondente nella ciotola e rimuovere il fotoresist sganciabile agitando leggermente la cialda su agitatore orbitale fino tutti platinum in eccesso viene rimosso. Sciacquare e asciugare la cialda di PI come descritto al punto 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Seconda fase Fotolitografia: formando lo strato dell'isolamento.
	<ol><li>Mettere la cialda di PI in forno preriscaldato a 120 ° C per 5 min disidratare it.</li>
		<li>Programma il primo passo di una spin coater per 5 s di filatura tempo a 500 giri/min. Programmare il secondo passo per 30 s a 4.000 giri/min, con un'accelerazione di 700 giri/min/s.</li>
		<li>Posizionare la cialda di PI su spin-coater e risolvere il problema, applicare il vuoto. Dispensare 4 mL di un'appropriata base epossidica photoresist prima di iniziare il programma di spin coater.</li>
		<li>Soft-cuocia il wafer rivestito per 3 min a 95 ° C su una piastra calda.</li>
		<li>Regolare la maschera per il livello di isolamento sul wafer utilizzando gli indicatori di allineamento rispettivi e una lente oculare. Esporre la cialda a 100 mJ/cm 2 UV luce (365 nm).</li>
		<li>Per cuocere un post-esposizione, posizionare la cialda su un piatto caldo preriscaldato per 2 min a 95 ° C.</li>
		<li>Inserire la cialda in una ciotola e sviluppare la resistenza con uno sviluppatore adatto (ad es., 1-metossi-2-propil-acetat per 2 min, nel caso di SU-8) su agitatore orbitale.</li>
		<li>Prima sciacquare la cialda di PI con isopropanolo e poi risciacquare e asciugare come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Rigido-cuocia il photoresist in forno per 3 ore a 150 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Assistita da plasma pulizia degli elettrodi.
	<ol><li>Per rimuovere i residui di photoresist, utilizzare il plasma ad ossigeno con un'unità di plasma standard. Avviare il programma di lavaggio, alimentato a bassa frequenza 200-W con il 100% O 2 flusso, un tasso di sccm 250 e un tempo totale di 3 min.</li>
		<li>Inserire la cialda PI camera plasma, difficoltà la cialda sulla piastra con messa a terra con coperchi in vetro e avviare il processo al plasma.</li>
	</ol></li> <li>Argento e deposizione di cloruro d'argento: creazione dell'elettrodo di riferimento su chip a.
	<ol><li>Passivazione il contatto platino pastiglie del wafer con un nastro adesivo UV sensibili. Tagliare il foglio a strisce lunghe cm 5 mm di larghezza e 11 e allegarli al wafer, proteggendo le parti di non essere depositato con argento.</li>
		<li>Per la deposizione di argento, mettere un bagno ad ultrasuoni (35 kHz) in una cappa e un contenitore di soluzione elettrolitica argento (100 g/L Ag, pH 12,5) inserire la vasca. Impostare il bagno a ultrasuoni a temperatura ambiente e il potere di 10%. 
		Attenzione: Soluzioni di elettroliti d'argento sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura. I fumi non devono mai essere inalati.</li>
		<li>Collegare il contatto di massa degli elettrodi di riferimento a una fonte di corrente costante. Collegare l'elettrodo contatore, un filo d'argento che è immerso nella soluzione dell'elettrolito d'argento, all'origine corrente utilizzando cavi di collegamento standard.</li>
		<li>Impostare la sorgente di corrente a DC e una densità di corrente di -4,5 mA/cm 2, con un tasso di deposizione d'argento di circa 0,3 µm/min iniziare il bagno ad ultrasuoni e lasciate in origine corrente per 10 minuti la cialda di risciacquo con acqua DI</li>
		<li>Per la clorazione dell'elettrodo di riferimento, inserire un vaso di soluzione di cloruro di potassio (KCl) 0,1 M nel bagno ad ultrasuoni. Collegare il contatto di massa di un elettrodo di platino che è immersa nella soluzione KCl con la fonte di corrente costante e il wafer.</li>
		<li>Impostare la sorgente di corrente a DC e una densità di corrente di + 0,6 mA/cm 2, con un tasso di deposizione di circa 0.075 µm/min avviare il bagno ad ultrasuoni e lasciate che la sorgente di corrente per un minimo di 7,5</li>
		<li>Sciacquare e asciugare il PI di wafer, come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Rimuovere il nastro UV sensibili dopo un UV (365 nm) esposizione di 300 mJ/cm 2 e risciacquare ed asciugare la cialda di PI, nuovamente come descritto nel passo 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Terzo passo di fotolitografia: utilizzando DFRs per creare i canali microfluidici.
	<ol><li>Tagliare gli strati DFR necessari a una dimensione simile a quella del wafer (20 x 20 cm 2). Fissare la maschera desiderata sull'unità di esposizione e allineare lo strato DFR sulla maschera utilizzando l'occhio nudo. Illuminare il resistere con 250 mJ/cm 2 UV luce (365 nm).</li>
		<li>Rimuovere la pellicola protettiva del photoresist e sviluppare il resistere per circa 2 min (a seconda delle strutture) in una soluzione di carbonato di sodio (Na 2 CO 3) 1% mediante un bagno ad ultrasuoni standard (35 kHz) preriscaldato a 42 ° C e una potenza sonora del 100%. Per interrompere immediatamente la reazione, agitare il resist per 1 min in un bagno di HCl 1% su agitatore orbitale. Sciacquare e asciugare ogni strato DFR, come descritto al punto 1.2.3. 
		Nota: In totale, quattro strati DFR devono essere elaborati come indicato al punto 1.7: strato di un canale, un rivestimento protettivo e due strati di retro (impedendo il biosensore di piegatura alla fine).</li>
	</ol></li> <li>Strati di laminazione del DFR sul substrato PI.
	<ol><li>Posizionare la cialda di PI su una lamina di overhead di trasparenza e fissarlo con nastro adesivo standard. Regolare il livello del DFR canale sul wafer PI sotto un microscopio, utilizzando le strutture di allineamento rispettivi.</li>
		<li>Per la laminazione, utilizzare una plastificatrice a caldo standard del rotolo e preriscaldare il rullo superiore a 100 ° C e la bobina inferiore a 60 ° C. impostare la pressione a 3 bar, con una velocità di avanzamento di 0,3 m/min posto la cialda con lo strato DFR fisso al centro la plastificatrice e avviarlo; Il DFR viene spinto attraverso la plastificatrice. Ripetere il passaggio dopo aver ruotato la cialda di 180°.</li>
		<li>Per evitare la flessione del biosensore, laminato due strati retro sviluppati su wafer seguendo passaggi 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Impiegando una barriera idrofoba fermarsi e il chip di sigillamento.
	<ol><li>Rimuovi lo strato protettivo dal lato anteriore del canale DFR laicier posizionando il nastro adesivo standard ad una estremità del DFR e tirandolo verso l'alto. Utilizzare un mano dispenser con tubi di 0,004 per versare piccole goccioline di politetrafluoroetilene disciolto nei pozzetti dello strato isolante. Per sigillare il chip microfluidici, laminato lo strato di copertura DFR sul livello di canale, come descritto al punto 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Hard-cottura biosensore microfluidici.
	<ol><li>Rimuovi tutto protettivo sventa sulla copertina e retro strati DFR. I biosensori tagliate a strisce utilizzando un normale paio di forbici. Curare le patatine in forno a 160 ° C per 3 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Procedura di dosaggio immobilizzazione su chip <ol><li>adsorbimento dell'avidina nella zona del canale immobilizzazione.
	<ol><li>Preparare una soluzione di avidina 100 µ g/mL in soluzione tampone fosfato 10 mM (PBS) ad un pH di 7,4.</li>
		<li>Erogare 2 µ l della soluzione avidina sull'ingresso del biosensore. 
		Nota: Il canale è riempito da forze capillari fino a quando il fluido raggiunge la barriera di arresto idrofobo.</li>
		<li>Per garantire che la fluidica continua a fermarsi alla barriera durante il tempo di incubazione intero, dispensare 2 µ l di acqua DI sull'uscita del chip. Incubare il chip a 25 ° C per 1 h in un contenitore chiuso.</li>
		<li>Rimuovere i reagenti in eccesso attraverso l'entrata del chip applicando un vuoto. Lavare il canale con 50 µ l di tampone di lavaggio (PBS con 0.05% Tween 20), erogata in uscita mentre viene applicato il vuoto. Asciugare il canale per 30 s mentre viene applicato il vuoto.</li>
	</ol></li> <li>Blocco nell'area di canale per inibire il grippaggio aspecifiche.
	<ol><li>Preparare una soluzione di albumina di siero bovino (BSA) di 1% in PBS di 10mm a pH 7.4.</li>
		<li>Pipetta 2 µ l della soluzione di BSA 1% su ingresso e 2 µ l di acqua distillata all'uscita del canale. Incubare il chip a 25 ° C per 1 h in un contenitore chiuso. Rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale come descritto al punto 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>I oligos di incubazione di DNA etichettati con biotina e 6-FAM.
	<ol><li>Preparare diverse concentrazioni (0,001-5 µM) della soluzione di DNA in 10mm PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Erogare 2 µ l di una concentrazione della soluzione del DNA in ingresso e 2 µ l di acqua deionizzata sulla presa. Incubare il chip a 25 ° C per 15 min in un contenitore chiuso.</li>
		<li>Ripetere il punto 2.3.2 per le altre concentrazioni di DNA mediante biosensore ulteriori fiches.</li>
		<li>Rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale come descritto al punto 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Immobilizzazione di GOx-etichettato anticorpi 6-FAM.
	<ol><li>Formulare una concentrazione di 5 µ g/mL di anticorpi di 6-FAM in 10mm PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Introdurre 2 µ l della soluzione dell'anticorpo per l'ingresso e 2 µ l di acqua deionizzata per la presa del canale. Incubare gli anticorpi con etichettati a 25 ° C per 15 min in un contenitore chiuso. Rimuovere i reagenti in eccesso, come descritto al punto 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Amperometrico segnale rilevamento utilizzando la tecnica Stop-flow <ol><li>preparazione della soluzione di substrato per rilevazione elettrochimica.
	<ol><li>Formulare una soluzione di glucosio 40mm in PBS 0.1 M a pH 7.4 in acqua ultra-pura.</li>
		<li>Per il trattamento preliminare, preparare una soluzione di PBS 0.1 M a pH 7.4 in acqua ultra-pura.</li>
	</ol></li> <li>Trattamento preliminare degli elettrodi lavoro.
	<ol><li>Usare il supporto di chip su misura per consentire il facile posizionamento delle chip e una connessione elettrica e fluidica.</li>
		<li>Collegare elettricamente il biosensore per il potenziostato. Garantire il contatto fluidico del canale microfluidico per una pompa a siringa e il serbatoio del reagente utilizzando l'adapter su misura e tubi. Avviare il computer portatile che è collegato al potenziostato e avviare il controller di pompe siringa, controllo del flusso fluidic attraverso il chip.</li>
		<li>Avviare la pompa a siringa manualmente, con 0.1 M PBS ad una portata di 20 µ l/min. Presso l'elettrodo di lavoro contro l'elettrodo di riferimento su chip, applicare una tensione alternata di 0,8 e -0,05 V per 5 s ciascuno per 30 cicli. In seguito, si ossidano l'elettrodo di lavoro applicando una tensione di 0,8 V per 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Della lettura di dosaggio usando la tecnica stop-flow.
	<ol><li>Per avviare la lettura del segnale di test, attendere il segnale di corrente misurato si stabilizzi. Arrestare la pompa a siringa e passare il reagente da 0.1 M PBS per la soluzione di glucosio di 40 mM e avviare il software presso il controllore della pompa siringa; fermerà automaticamente il flusso per 1, 2 o 5 min e quindi riavvia nuovamente il flusso. Osservare il picco di corrente risultante. 
		Nota: Per l'analisi dei dati, il picco di corrente o la carica del picco può essere considerata, come descritto nel modello di una lettura del segnale elettrochimico ( Figura 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato qui per la realizzazione di un biosensore elettrochimico di microfluidica consente lo sviluppo di una piattaforma di basso costo, compatta e facile da usare per la rilevazione di biomolecole. A seconda del dosaggio utilizzato in seguito il biosensore, diversi biomarcatori diversi possono essere rilevati. Questo rende la piattaforma molto versatile e offre ampio accesso ai vari campi di applicazioni, dai test diagnostici standard (ad esempio, determinare la presenza di malattie specifiche...

Durante le due decadi scorse, applicazioni diagnostiche sono diventati Elementare per studi approfonditi sullo sviluppo della salute pubblica globale. Tradizionalmente, strumenti di diagnostica di laboratorio sono utilizzati per la rilevazione di malattie. Anche se hanno ancora un ruolo chiave nella diagnosi di malattie, point-of-care testing (POCT) eseguita vicino al paziente o dal paziente stesso è diventato più facile e più comune negli ultimi anni. Soprattutto in questi casi che richiedono un trattamento immediato, come infarto miocardico o monitoraggio del diabete, la conferma veloce di un'individuazione clinica è essenziale. Quindi, c'è un crescente bisogno di dispositivi POCT che può essere azionato da non esperti e che sono contemporaneamente in grado di eseguire precisi in vitro test diagnostici in un breve periodo di tempo1,2,3,4 .
Notevoli miglioramenti sono già stati raggiunti nel campo della POCT. Tuttavia, ci sono ancora molte sfide da superare5,6,7,8. Per una piattaforma POCT per essere lanciato con successo sul mercato ed essere competitivi con diagnostica di laboratorio, il dispositivo deve rigorosamente rispettare i seguenti requisiti: (i) fornire risultati precisi e quantitativa che siano coerenti con laboratorio Risultati; (ii) avere breve esempio di risultato volte, consentendo il trattamento immediato del paziente; (iii) offrono la gestione semplice e facile, anche se operati da inesperte e richiedono l'intervento dell'utente ridotta a icona; e (iv) è composto da un'unità di sensori a basso costo progettata per applicazioni monouso. Inoltre, privo di attrezzatura diagnostica è favorevoli, soprattutto in ambienti poveri di risorse3,4,6.
A causa di questi requisiti severi, solo due sistemi POCT basate sulla rilevazione elettrochimica (ad es., strisce reattive per glicemia) e il test immunologici di flusso laterale (ad es., prove di gravidanza domestiche) sono stati lanciati con successo sul mercato così lontano. Tuttavia, entrambi i sistemi soffrono di svantaggi quali la riduzione delle prestazioni (cioè, monitoraggio della glicemia ha risultati di prova inaccurati e flusso laterale saggi forniscono solo risultati di misurazione qualitativa (positiva o negativa))4, 6. Questi inconvenienti dei sistemi convenzionali di POCT hanno portato ad una crescente domanda di esplorare nuove tecnologie che offrono funzionalità di rilevamento veloce, basso costo e quantitativa nel punto di cura4,5.
Per soddisfare queste sfide dispositivi POCT, tecnologia DFR è stato recentemente impiegata per la fabbricazione di biosensori monouso e basso costo9,10,11,12, 13 , 14. rispetto ai materiali litografici morbidi e liquidi, ad esempio PDMS o SU-8, DFRs presentano molti vantaggi: (i) sono disponibili in una varietà di composizioni e spessori (da pochi micron ad alcuni millimetri); (ii) hanno una superficie molto ruvida, che facilita l'adesione ai vari materiali; (iii) uniformità di spessore eccellente caratteristica; (iv) offrono la fabbricazione a basso costo, facile e ad alta produttività per la produzione di massa; (v) sono facili da tagliare con vari strumenti di basso costo, come un semplice paio di forbici; e (vi) consentono la creazione di strutture tridimensionali, quali canali microfluidici, impilando strati multipli di DFR in cima a vicenda.
D'altra parte, DFRs in generale hanno una risoluzione relativamente povera rispetto i photoresists liquidi, che è principalmente causati dallo spessore del film e l'aumento della distanza tra la maschera e il DFR dovuto la pellicola protettiva, che consente inoltre di luce scattering. Ancora, per la produzione di biosensori di microfluidica integrata, DFRs sono particolarmente adatte per la produzione di massa di basso costo.
Pertanto, vi presentiamo in questo lavoro la fabbricazione e l'applicazione di un biosensore DFR-based microfluidic elettrochimica. Il protocollo dettagliato descrive ogni fase di produzione della piattaforma biosensore, l'immobilizzazione su chip di un saggio del modello basati sul DNA e sua lettura elettrochimica usando la tecnica stop-flow. Questa piattaforma universale consente il rilevamento di numerosi tipi di biomolecole, utilizzando tecnologie diverse analisi (ad es., genomica, cellomics e proteomica) o formati di dosaggio (ad es., competitivo, panino o diretta). Basato su una piattaforma di DFR, il nostro gruppo precedentemente dimostrato con successo la quantificazione rapida e sensibile di analiti vari, tra cui antibiotici13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e gli antibiotici ß-lattamici), troponina I17e18di sostanza P.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Utilizzato come substrato di poliimmide</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Tecnologia Micro Resist</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit per definire la deposizione di platino</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Sviluppatore per MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Materiale dell'elettrodo e del cuscinetto di contatto</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Remover per MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Fotoresist per definire l'area dell'elettrodo e come isolante</td></tr><tr><td>acetato di 1-metossi-2-propanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Sviluppatore per SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Rimozione dello sviluppatore SU-8</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>Nastro adesivo sensibile ai raggi UV per la protezione dei pattini di contatto</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>Per la deposizione dell'argento sull'elettrodo di riferimento</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>Per la clorurazione dell'elettrodo di riferimento in argento</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Fotoresist a film secco</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Sviluppatore per Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>Per completare lo sviluppo del DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>Per l'utilizzo della barriera di arresto</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega</td> <td>Electronics-Bubble</td> <td>etch tank</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Forno</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT-Spin</td><td></td> <td>coater</td></tr><tr><td>Pr&auml; zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Piastra riscaldante</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Unità di esposizione</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener-Plasma</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>unit Univex 500</td><td>Leybold-Unità</td><td></td> <td>di deposizione di vapore fisica</td></tr><tr><td>Agitatore S4</td><td>ELMI-Agitatore</td><td></td> <td>orbitale</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Bagno sonico</td></tr><tr><td>6221 DC e AC</td><td>Keithley-Sorgente</td><td></td> <td>di corrente</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec-Unità</td><td></td> <td>di laminazione</td></tr><tr><td>Penna sottovuoto</td><td>EFD-Penna</td><td></td> <td>a vuoto</td></tr></tbody></table>

film secco basati su photoresist biosensore elettrochimico microfluidic platform: fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Negli ultimi anni, la diagnostica di biomarcatore è diventato uno strumento indispensabile per la diagnosi della malattia umana, soprattutto per la diagnostica point-of-care. Una piattaforma facile da usare e a basso costo sensore altamente è voluta per misurare vari tipi di analiti (ad es., biomarcatori, ormoni e farmaci) quantitativamente e in particolare. Per questo motivo, film secco photoresist tecnologia - abilitazione a buon mercato, fabbricazione di alto-rendimento e facile - utilizzata per fabbricare il biosensore microfluidici presentato qui. A seconda l'analisi biologica utilizzata in seguito, la piattaforma versatile è in grado di rilevare vari tipi di biomolecole. Per la fabbricazione del dispositivo, elettrodi di platino sono strutturati su una lamina flessibile poliimmide (PI) nel passaggio processo solo pulito. La lamina di PI funge da substrato per gli elettrodi, che sono isolati con un photoresist a base epossidica. Il canale di microfluidica viene generato successivamente dallo sviluppo di laminazione di fogli di photoresist (DFR) di film secco sul wafer PI. Utilizzando una barriera idrofoba arresto nel canale, il canale è suddiviso in due aree specifiche: una sezione di immobilizzazione per l'analisi enzima-collegata e una cella di misura elettrochimica per la lettura del segnale amperometrico.
L'immobilizzazione di analisi biologica su chip viene eseguita per l'adsorbimento di biomolecole alla superficie del canale. L'enzima ossidasi di glucosio è usato come un trasduttore per la generazione di segnale elettrochimico. In presenza di substrato, glucosio, perossido di idrogeno è prodotto, che è stata rilevata all'elettrodo di lavoro platino. La tecnica stop-flow è applicata per ottenere amplificazione del segnale con rilevamento rapido. Biomolecole differenti può essere misurata quantitativamente mediante il sistema introdotto microfluidica, dà un'indicazione dei vari tipi di malattie, o, per quanto riguarda farmaci terapeutici monitoraggio, facilitando una terapia personalizzata.

Progettazione e fabbricazione della piattaforma microfluidica biosensore:
La fabbricazione dei chip microfluidici biosensore è realizzata a livello di wafer da tecniche fotolitografiche standard impiegando strati multipli di DFR. Questa strategia di fabbricazione si basa sulla laminazione degli strati sviluppati di DFRs su un substrato di platino-fantasia di PI, formando i canali microfluidici. Un breve riassunto raffiguranti le fa...

Una piattaforma di biosensore microfluidica è stata progettata e fabbricato con tecnologia photoresist film asciutto low-cost per la quantificazione rapida e sensibile di vari analiti. Questo sistema monouso consente la lettura elettrochimica di on-chip-immobilizzata analisi enzima-collegata mediante la tecnica della stop-flow.

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

L'obiettivo generale di questa procedura è presentare una piattaforma versatile di biosensori elettrochimici microfluidici basata su una tecnologia economica a resistenza fotopolimerizzabile in film secco, in grado di misurare diversi tipi di analiti a seconda del saggio enzimatico immobilizzato successivamente utilizzato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei test diagnostici al punto di cura, come la quantificazione di diversi farmaci, ad esempio antibiotici, oppure alla diagnosi di numerose patologie come il cancro. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che il biosensore qui presentato si basa principalmente su materiali a basso costo, è di facile utilizzo ed estremamente versatile in termini di applicazione.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi relativi alle pellicole secche di resist foto sono difficili da padroneggiare, in quanto la manipolazione richiede molta formazione ed esperienza. La dimostrazione dell'immobilizzazione e della misurazione del saggio su chip sarà effettuata da Eva Grether, un'assistente studentessa del mio gruppo. Per iniziare, tagliare un substrato di poliimide, o PI, in wafer rotondi da sei pollici.Quindi, posizionare la wafer di PI in un forno a 120 gradi Celsius per circa un'ora per una cottura di disidratazione. Per eseguire il primo passaggio di fotolitografia per il processo di liftoff, impostare il spin coater su un tempo di rotazione di 30 secondi a 3000 giri al minuto con un'accelerazione di 2000 giri al minuto al secondo. Posizionare la wafer di PI sullo spin coater e fissarla applicando un vuoto.Quindi avviare il programma dello spin coater ed erogare due millilitri di resist, abilitando così il processo di lift-off. Rimuovere la wafer dallo spin coater ed eseguire una pre-cottura della wafer in PI su una piastra riscaldante per due minuti a 100 gradi Celsius. Regolare la maschera desiderata per la definizione degli elettrodi sulla wafer in PI ad occhio nudo ed esporla a 400 millijoule per centimetro quadrato di luce UV.Quindi posizionare la piastrina in un contenitore riempito con un rivelatore adatto, su un agitatore orbitale, e lasciarla agitare leggermente per un minuto. Dopo la rimozione del resist in eccesso, utilizzare un getto d'acqua per risciacquare la piastrina di PI con acqua deionizzata su un banco umido, prima di asciugarla con aria compressa. Successivamente, depositare del platino per la formazione degli elettrodi mediante un processo standard di deposizione fisica da vapore, depositando 200 nanometri di platino sulla piastrina.Dopo aver posizionato la wafer in una bacinella, aggiungere il relativo solvente nella bacinella e rimuovere il resist di sollevamento, agitando leggermente la wafer su uno shaker orbitale fino a quando tutto il platino in eccesso è stato eliminato. Dopo aver risciacquato e asciugato la wafer di PI come in precedenza, eseguire il secondo passaggio di fotolitografia e pulire gli elettrodi come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, passivare i pad di contatto in platino della wafer con un nastro adesivo sensibile ai raggi UV.A tale scopo, tagliare il foglio di alluminio in strisce larghe cinque millimetri e lunghe undici centimetri e fissarle sulla wafer, proteggendo le parti che non devono essere depositate con argento. Per il deposito di argento, posizionare un bagno ad ultrasuoni all'interno di una cappa aspirante e inserire nel bagno un contenitore con soluzione elettrolitica di argento. Impostare il bagno ad ultrasuoni alla temperatura ambiente e ridurre la potenza al 10%. Collegare il contatto di massa degli elettrodi di riferimento a una sorgente di corrente costante.Quindi, collegare l'elettrodo contatore, un filo d'argento immerso nella soluzione elettrolitica di argento, alla sorgente di corrente, utilizzando cavi di collegamento standard. Impostare la sorgente di corrente su corrente continua (DC) e su una densità di corrente di circa 4,5 milliampere per centimetro quadrato, ottenendo una velocità di deposizione dell'argento di circa 0,3 micron al minuto. Avviare il bagno sonico e lasciare funzionare la sorgente di corrente per 10 minuti.Dopo 10 minuti, risciacquare la piastrina con acqua deionizzata. Per eseguire il terzo passaggio di fotolitografia, tagliare innanzitutto gli strati di resist fotochemico in film secco a una dimensione simile a quella della piastrina. Fissare la maschera desiderata sull'unità di esposizione e allineare lo strato di resist (DFR) sulla maschera ad occhio nudo.Successivamente, esporre il resist a 250 millijoule per centimetro quadrato di luce UV. Rimuovere la pellicola protettiva del photoresist e sviluppare il resist per circa due minuti in una soluzione al 1% di carbonato di sodio, utilizzando un bagno ultrasuoni standard preriscaldato a 42 gradi Celsius e con potenza ultrasuoni al 100%. Per arrestare immediatamente la reazione, agitare il resist per un minuto in una soluzione al 1% di acido cloridrico su un agitatore orbitale. Risciacquare ed asciugare ogni strato DFR come in precedenza.Per laminare gli strati DFR sul substrato PI, posizionare la wafer PI su un foglio trasparente per proiettore e fissarla utilizzando nastro adesivo standard. Regolare lo strato DFR del canale sulla wafer PI sotto un microscopio utilizzando le rispettive strutture di allineamento. Per la laminazione, utilizzare un laminatore a rulli riscaldati standard e preriscaldare il rullo superiore a 100 gradi Celsius e il rullo inferiore a 60 gradi Celsius.Impostare la pressione a tre bar con una velocità di avanzamento di 0,3 metri al minuto. Posizionare la wafer con lo strato di DFR fissato al centro del laminatore e avviarlo in modo che il DFR venga spinto attraverso il laminatore. Ripetere il passaggio dopo aver ruotato la wafer di 180 gradi.Successivamente, rimuovere lo strato protettivo dal lato anteriore del livello del canale DFR posizionando un nastro adesivo standard a un'estremità del DFR e tirandolo verso l'alto. Utilizzare un dispenser manuale con tubi da 0,004 pollici per dispensare piccole gocce di politetrafluoroetilene disciolto nei pozzetti del livello di isolamento. Per sigillare il chip microfluidico, laminare il livello superiore DFR sul livello del canale come in precedenza.Quindi, eseguire la cottura finale del biosensore microfluidico rimuovendo innanzitutto tutte le pellicole protettive dagli strati DFR del coperchio e della parte posteriore. Tagliare i biosensori in strisce utilizzando un paio di forbici comuni. Infine, polimerizzare le chip in un forno a 160 gradi Celsius per tre ore.Per assorbire l'avidina nell'area di immobilizzazione del canale, aggiungere due microlitri della soluzione di avidina nell'ingresso del biosensore. Per assicurare che il flusso si arresti al livello della barriera per tutta la durata dell'incubazione, aggiungere due microlitri di acqua deionizzata nell'uscita del chip. Incubare il chip a 25 gradi Celsius per un'ora in un contenitore chiuso.Rimuovere i reagenti in eccesso attraverso l'ingresso del chip applicando un vuoto. Quindi, lavare il canale con 50 microlitri di tampone di lavaggio dispensati sull'uscita mentre viene applicato il vuoto. Asciugare il canale per 30 secondi con il vuoto.Bloccare la superficie del canale per inibire il legame non specifico introducendo due microlitri di soluzione di BSA al 1% sull'ingresso e due microlitri di acqua deionizzata sull'uscita del canale. Incubare il chip a 25 gradi Celsius per un'ora in un contenitore chiuso, quindi rimuovere i reagenti in eccesso ed essiccare il canale come in precedenza. Successivamente, incubare gli oligonucleotidi di DNA marcati con biotina e sei FAM dispensando due microlitri di una concentrazione della soluzione di DNA sull'ingresso e due microlitri di acqua deionizzata sull'uscita.Incubare il chip a 25 gradi Celsius per 15 minuti in un contenitore chiuso prima di rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale. Per immobilizzare gli anticorpi anti-glucosio ossidasi marcati con sei FAM, introdurre due microlitri di soluzione anticorpale nell'ingresso e due microlitri di acqua deionizzata nell'uscita del canale. Incubare nuovamente gli anticorpi marcati a 25 gradi Celsius per 15 minuti in un contenitore chiuso prima di rimuovere i reagenti in eccesso.Applicare lo spaziatore in PMMA fluidico sul biosensore e collegare elettricamente il biosensore al potenziostato. Realizzare il collegamento fluidico della pompa a siringa con il biosensore utilizzando l'adattatore fluidico. Avviare manualmente la pompa a siringa con una soluzione di PPS 0,1 molare a una portata di 20 microlitri al minuto.Applicare all'elettrodo di lavoro rispetto all'elettrodo di riferimento su chip 30 cicli di una tensione alternata di 0,8 e 0,05 volt per cinque secondi ciascuno. Successivamente, ossidare l'elettrodo di lavoro applicando una tensione di 0,8 volt per 60 secondi. Per iniziare la lettura del segnale del saggio, attendere finché il segnale di corrente misurato non si stabilizza.Fermare la pompa a siringa e passare dal reagente di PPS 0,1 molare a una soluzione di glucosio 40 millimolare prima di avviare il software sul controllore della pompa a siringa. Dopo aver arrestato automaticamente il flusso per uno, due o cinque minuti, la pompa a siringa riavvierà nuovamente il flusso. Osservare il picco delle correnti risultanti.Il biosensore elettrochimico contiene un singolo canale microfluidico con due aree distinte separate da una barriera idrofobica di arresto. L'area di immobilizzazione, dove il saggio viene immobilizzato mediante semplice assorbimento delle biomolecole, e la cella elettrochimica dove viene effettuata la lettura amperometrica del saggio. Per la lettura amperometrica del biosensore viene utilizzata la cosiddetta tecnica stop-flow.Prima di tutto, viene applicato un flusso costante del substrato enzimatico glucosio. Dopo che il segnale si stabilizza, il flusso viene interrotto. Durante la fase di arresto, il glucosio viene convertito in perossido di idrogeno e accumulato nel canale.Riavviando il flusso, il perossido di idrogeno viene spinto attraverso la cella elettrochimica dove viene rilevato, generando un picco di corrente. A seconda della quantità di analita legato, e quindi della quantità di glucosio ossidasi legata, l'altezza del segnale varia, producendo una curva di calibrazione esemplificativa, come mostrato qui. Una volta acquisita padronanza, la fabbricazione del biosensore può essere completata in circa 10 ore se eseguita correttamente.Sebbene il tempo di incubazione e di lettura del saggio dipenda dal saggio utilizzato, di solito può essere completato entro tre ore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della fabbricazione, della preparazione del saggio su chip e del funzionamento dei biosensori elettrochimici basati su photoresist secco. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante assicurarsi che tutti i passaggi del protocollo siano rigorosamente seguiti ed eseguiti con grande attenzione.Considerato che le prestazioni del sensore dipendono fortemente dal processo di fabbricazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla medicina personalizzata, comprendendo la diagnosi in loco di diversi tipi di malattie e farmaci, facilitando così una terapia individualizzata. Non dimenticare che lavorare con soluzioni elettrolitiche di argento può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare occhiali di sicurezza e guanti adeguati, durante l'esecuzione di questa procedura.

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