Name: Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Scopri come determinare il numero assoluto di copie proteiche in singole cellule utilizzando microarray di goccioline indirizzabili. Questo metodo rivela l'eterogeneità dell'espressione di p53 nelle linee cellulari tumorali.

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ASR progettato esperimenti, sviluppato protocolli e analizzato i dati. SC e PS eseguiti esperimenti di dimensione di cella. ASR e OC ha scritto il manoscritto. Gli autori desiderano riconosciamo con gratitudine il sostegno della Prof. ssa David R. Klug per l'accesso alle attrezzature. Gli autori desiderano ringraziare l'imperiale Hackspace di Advanced ha per l'accesso alle strutture di prototipazione e fabbricazione College.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Indirizzabile gocciolina Microarrays sono un metodo sensibile ed estensibile per determinare quantitativamente il numero assoluto di copia della proteina all'interno di una singola cella.
Limitare il livello di legame aspecifico (NSB) è critico all'interno del protocollo al raggiungimento di un limite di rilevazione possibile come basso. Proteine e altre specie biochimiche non specifico può associare a un numero di interfacce presenti all'interno le goccioline — la superficie del vetrino copri...

L'obiettivo di questo metodo è quello di determinare la variazione in abbondanza di una proteina dell'obiettivo in una popolazione di cellule con risoluzione di singola cellula. Analisi unicellulare fornisce una serie di vantaggi che non sono disponibili con metodi biochimici ensemble tradizionale. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in primo luogo, lavorare a livello di singola cellula può catturare l'eterogeneità ricca di una popolazione di cellule che altrimenti andrebbero persi il calcolando che si verifica con tecniche biochimiche ensemble tradizionale. La maggior parte dei metodi biochimici cavallo di lavoro funziona con la maggior parte, che richiedono, come spesso fanno, milioni di cellule per produrre un risultato. Naturalmente, le conseguenze della valutazione popolazioni a cellula intera dipende da una serie di fattori, ad esempio, l'eterogeneità nell'espressione della proteina dove possono essere perso alcune caratteristiche importanti della distribuzione dell'abbondanza di proteine. Dal punto di vista pratico, la sensibilità necessaria delle tecniche di singola cellula li rendono in grado di lavorare con quantità di materiale biologico che è insufficiente per anche più sensibili tecniche di bulk funzionare. Un esempio chiave è lo studio dei tipi cellulari rari come fare circolare le cellule del tumore (CTCs) dove anche per i pazienti con una prospettiva prognostico difficile meno di 10 CTCs potrebbero essere presenti in un singolo 7,5 mL di sangue disegnare. 6 qui presentiamo la metodologia necessaria per eseguire misurazioni di proteina singola cella usando un volume ridotto dosaggio anticorpo-basato che impiegano le goccioline di olio-capped stampato su un microarray dell'anticorpo.
Microfluidica gocciolina piattaforme sono a resa elevata, in grado di generare migliaia di goccioline al secondo e in grado di isolare e persino la coltura, singole cellule in singole gocce per eseguire una vasta gamma di analisi biochimiche. Tecniche basate su goccia sono adatti per analisi unicellulare,7,8,9 con notevoli esempi recenti tra cui DropSeq10 e inDrop11, che sono state notevolmente favorite dalla potenza di tecniche di amplificazione. La quantità limitata di materiale e senza metodi di amplificazione per proteine rendono unicellulare proteomica particolarmente impegnativi.
Le goccioline possono essere analizzate da un certo numero di metodi e microscopia di fluorescenza è stato ampiamente utilizzata. Tecniche di singola molecola come microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale permette di molecole fluorescenti essere visualizzato con impareggiabile rapporto segnale-rumore. 12 a causa del decadimento esponenziale del campo evanescente, solo fluorofori in alta vicinanza alla superficie (ordine di 100nm) sono eccitati rendendo TIRF una buona strategia nella rilevazione di piccole quantità di una molecola di target in una miscela complessa. La forza intrinseca di sezionamento ottica di TIRF aiuta anche ad per evitare fasi di lavaggio e limiti di analisi tempi e la complessità. Tuttavia, TIRF richiede superfici planari ed esempi di microscopia TIRF applicato a goccioline nel flusso comportano la formazione di una superficie planare di cui all'immagine. 13 a tal fine, tecniche di proteomica di singola cellula spesso progettare chip microfluidici intorno agenti di superficie-immobilizzata cattura in un formato di microarray. 4 , 14
Le goccioline, essi stessi, possono essere formate in matrici su superfici planari, cosiddetto gocciolina microarrays. 15 , 16 , 17 organizzare spazialmente goccioline in matrici permette loro di essere convenientemente indicizzati, facilmente monitorati nel tempo, singolarmente indirizzati e, se necessario, Estratto. Gocciolina microarrays può raggiungere un'alta densità di micro-reattori con migliaia di elementi per ogni chip che sono supportati da strutture microtiter o autoportante. 18 , 19 , 20 può essere costituiti da deposizione sequenziale da robot di manipolazione dei liquidi, spotters a getto d'inchiostro, contattare microarrayers21,22,23,24,25, 26 , o essi possono assemblarsi su superfici come superhydrophillic macchie modellato su una superficie superidrofobiche. 27 , 28 , 29
Con queste considerazioni in mente, indirizzabile gocciolina Microarrays (ADMs) sono stati progettati per combinare la versatilità, spaziale indirizzabilità e volumi ridotti di microarrays di goccia con la sensibilità di microscopia TIRF di singola molecola per quantitativamente misurare l'abbondanza di proteine. 5 ADMs abilitare analisi unicellulare formando un gocciolina microarray contenente cellule singole sopra un microarray dell'anticorpo, che è stato limitato con olio per evitare l'evaporazione. I volumi delle goccioline sono discreti per prevenire la perdita di campione, che altrimenti si otterrebbe con il chip valvole a flusso continuo microfluidica. 30 la quantità assoluta di proteina bersaglio da una singola cellula è estremamente piccola; Tuttavia, il volume ridotto delle goccioline consente relativamente alta concentrazione locale in modo che essi vengono rilevati usando un'analisi di anticorpo panino - anticorpo è immobilizzato in una distinta regione, o spot, su una superficie che cattura la proteina che a sua volta lega per un anticorpo di rilevazione fluorescente etichettati presente nel volume delle gocce. Come un approccio privo di etichetta (cioè proteina gli obiettivi non devono essere etichettati direttamente), sono generalmente applicabili all'analisi di cellule da fonti primarie, come sangue trasformati ADMs, bene bisogno aspira e le biopsie del tumore dissociata, come pure le cellule dalla cultura e loro lisati.
Misura la variazione in abbondanza di proteine attraverso una popolazione delle cellule è importante nel determinare l'eterogeneità nella risposta, ad esempio, ad una droga e contribuirà a fornire approfondimenti funzioni cellulari e percorsi, valutazione sottopopolazioni e loro comportamento così come identificare eventi rari che altrimenti sarebbero mascherati da metodi di massa. Questo protocollo descrive come produrre e utilizzare indirizzabile gocciolina microarrays per determinare quantitativamente l'abbondanza del fattore trascrizione p53 in cellule tumorali umane e può essere usato per studiare il ruolo di p53 nella risposta ai farmaci chemioterapici. La proteina dell'obiettivo è determinata dalla scelta di acquisizione e rilevamento di anticorpi e può essere modificata per includere ulteriori o diverse destinazioni. Vengono fornite istruzioni per costruire un semplice apparato che incorporano un ugello concentrico da consumabili di laboratorio generali a 10 gocce di nL ricoperti con olio di matrice manualmente. Il processo completo sperimentale è descritto per cui ciascuna gocciolina viene quindi caricato con una singola cella, che è poi lisata e l'espressione della proteina determinata con risoluzione di singola molecola usando la microscopia TIRF.

<table><tbody><tr><td><forte>Coltura cellulare</soluzione salina tamponata >con</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto glucosio</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td>Fiasche per colture cellulari <td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Regno Unito</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Dimensioni (mm): 65,0 x 25,0; Spessore (mm) 0,17</td></tr><tr><td>p53 anticorpo di cattura</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 anticorpo di rilevamento, Alexa Fluor 488 marcato</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentrazione di stock 200&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Tampone citrato di sodio-soluzione salina</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio dodecilsolfato</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti (basso volume)</td><td>Bombola di gas di</td> azoto Sigma <td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BOC</td><td>Grado industriale, privo</td><td></td> di ossigeno</tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore manuale</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, Danimarca</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Pompe a siringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Siringa L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>A tenuta di gas, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>A tenuta di gas, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Isolatore in silicone</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>Isolatore in silicone 6x4 pozzetti con taglierina laser adesiva</td></tr><tr><td></td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 Laser CO2 3W</td><td>per il taglio laser di isolatori personalizzati Lastra</td></tr><tr><td>acrilica di 1 mm di spessore</td><td>Weatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>per il taglio laser di isolatori personalizzati</td></tr><tr><td>Foglio adesivo</td><td>3M</td><td></td><td>utilizzato per far aderire isolatori personalizzati a vetrini coprioggetti microarrayed Super</td></tr><tr><td>colla</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m Tubo in silice fusa con diametro esterno</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Tubo OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" ID/0,062 pollici Tubo in PTFE OD</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP tubo</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albume sierico bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Millipore, Germania</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy & Microscopio ottico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF con tavolino XY codificato</td><td>Nikon, Giappone</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irlanda</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di eccitazione laser</td><td>Vortran, USA</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente laser a lisi ottica</td><td>Continuum, USA</td><td>Microscopio Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> cubo filtrante per TIRF</td><td>Chroma, USA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtrante per microscopio laser a lisi ottica</td><td>2000, Regno Unito</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Software di <td>analisi delle immagini</td><td>Open Source</td><td></td> <td>delle Figi</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versione 7.14 o superiore</td> Software <td>di analisi delle immagini</td></tr></tbody></table>

proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile microarrays di conteggio

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comportamento spesso cellulare e risposte cellulari vengono analizzate a livello di popolazione, dove le risposte di molte cellule sono raggruppate insieme come un risultato medio il comportamento ricco singola cella all'interno di una popolazione complessa di mascheramento. Tecnologie di rilevazione e quantificazione della proteina singola cella hanno avuto un impatto notevole negli ultimi anni. Qui descriviamo una piattaforma di analisi unicellulare pratico e flessibile basata su microarrays gocciolina indirizzabile. Questo studio descrive come i numeri di copia assoluta di proteine bersaglio possono essere misurati con risoluzione di singola cellula. L'oncosoppressore p53 è il gene più comunemente mutato nel cancro umano, con oltre il 50% dei casi di cancro totale che esibiscono un modello di espressione di p53 non sani. Il protocollo descrive la procedura per creare 10 gocce nL entro il quale le cellule tumorali umane singolo sono isolate e il numero di copie della proteina p53 è misurato con risoluzione di singola molecola per determinare con precisione la variabilità nell'espressione. Il metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula compreso il materiale primario per determinare il numero di copia assoluta di qualsiasi proteine bersaglio di interesse.

Il numero di copia assoluta basale della proteina di p53 è stato determinato con risoluzione singola cella in una linea cellulare di cancro del colon umano, le cellule BE. Dimostriamo come espressione di p53 può variare nel corso di diversi ordini di grandezza e mostrano una correlazione positiva debolmente tra numero di copia dimensioni e proteina delle cellule all'interno della popolazione di cellule BE riposo.
Indirizzabile g...

Qui presentiamo indirizzabile gocciolina microarrays (ADMs), un metodo di matrice basata gocciolina in grado di determinare l'abbondanza assoluta della proteina in cellule singole. Dimostriamo la capacità di ADMs per caratterizzare l'eterogeneità nell'espressione della proteina oncosoppressore p53 in una linea cellulare di cancro umano.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il numero assoluto di copie di una proteina bersaglio con risoluzione a livello di singola cellula. Le tecniche su singola cellula permetteranno una migliore comprensione del comportamento di una proteina in relazione al dogma centrale e contribuiranno a una quantificazione accurata dell'espressione genica regolata. Lavorare a livello di singola cellula consente di catturare l'ampia eterogeneità della popolazione cellulare, che altrimenti verrebbe persa a causa della mediazione tipica delle tecniche biochimiche tradizionali.Generalmente, le persone nuove a questo metodo potranno incontrare difficoltà a causa della sensibilità dei saggi su singola cellula o della quantità limitata di proteine in ogni cellula. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando desideravamo eseguire un saggio proteico su singola cellula che potesse essere facilmente campionato per ulteriori analisi in fasi successive. Iniziare questa procedura preparando le chip e stampando microarray di anticorpi come descritto nel protocollo testuale.Per preparare l'apparecchiatura, inserire un tratto di 100 millimetri di tubo in silice fusa con d

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Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Questo protocollo descrive la fabbricazione di una grande scala, DNA o anticorpi array bidimensionale multiplato, con potenziali applicazioni in studi di segnalazione cellulare e rilevazione biomarker.

Flow-modello Fabrication guidata della alta densità di codici a barre anticorpo Microarray

Viene descritto un metodo sensibile e accurato per la quantificazione di microRNA privi di cellule utilizzando una chimica basata su coloranti e una tecnologia PCR digitale a goccioline.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

L'obiettivo generale del protocollo è quello di preparare oltre un milione di goccioline di femminiter ordinate, uniformi, stabili e biocompatibili su un substrato di 1 cm2 planari che può essere utilizzato per la sintesi proteica priva di cellule.

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Qui presentiamo un protocollo per misurare il numero assoluto di copie del DNA mitocondriale (mt) e i livelli di eteroplasmia di delezione del mtDNA in singole cellule.

Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

Questo metodo quantifica l'abbondanza microbica utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti per le unità formanti colonie di placca (CFU) e viene applicato al microbioma di Drosophila in campioni di omogenato di mosca interi. I CFU vengono conteggiati con un software di analisi delle immagini automatizzato fornito qui.

Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma Drosophila

Il protocollo descrive una piattaforma microfluidica avanzata per misurare quantitativamente le dinamiche di secrezione di citochine di singole cellule mononucleate del sangue periferico umano. La piattaforma misura fino a tre citochine in parallelo (IL-6, TNFα e IL-1β) per ogni singola cellula stimolata con lipopolisaccaride come esempio.

Approccio microfluidico per risolvere la secrezione simultanea e sequenziale di citochine di singole cellule polifunzionali 

Scopri come determinare il numero assoluto di copie proteiche in singole cellule utilizzando microarray di goccioline indirizzabili. Questo metodo rivela l'eterogeneità dell'espressione di p53 nelle linee cellulari tumorali.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

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