Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il numero assoluto di copie proteiche di una proteina bersaglio con risoluzione a singola cellula. Le tecniche a singola cellula consentiranno una migliore comprensione del comportamento di una proteina in relazione a un dogma centrale e contribuiranno a una quantificazione accurata dell'espressione genica controllata. Lavorare a livello di singola cellula può catturare la ricca eterogeneità della popolazione cellulare che altrimenti andrebbe persa con la media che si verifica con le tecniche biochimiche tradizionali.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della sensibilità dei saggi su singola cellula o di una quantità limitata di proteine in ciascuna cellula. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo eseguire un saggio proteico su una singola cellula che potesse essere facilmente campionato per ulteriori analisi lungo il flusso. Inizia questa procedura creando chip e stampando microarray di anticorpi come descritto nel protocollo di testo.

Per preparare l'apparato, alimentare una lunghezza di 100 millimetri di tubi in silice fusa con diametro interno di 150 micron e diametro esterno di 360 micron a una lunghezza di 40 millimetri di tubo in PFA con diametro interno di 1 millimetro e diametro esterno di 1/16 di pollice fino a quando non sporge di due millimetri. Questo formerà l'ugello concentrico. Applicare uno strato sottile di colla cianoacrilica all'estremità di un puntale per pipette da 10 microlitri e inserirlo nel pezzo di tubo PFA da 40 millimetri.

Se necessario, riposizionare il tubo di silice fusa in modo da mantenere una sporgenza di 2 millimetri sull'ugello prima che l'adesivo si solidifichi. Inserire l'altra estremità del capillare di silice fusa nell'estremità di una lunghezza di 200 millimetri di tubo in PTFE di diametro interno di 014 pollici e diametro esterno di 062 pollici. Collegalo a una siringa Hamilton da 100 microlitri riempita con il quattro percento di albume sierico bovino in soluzione salina tamponata con fosfato.

Successivamente, inserire un tubo FEP di 400 millimetri di lunghezza di 1 millimetro di diametro interno e 2 millimetri di diametro esterno in un puntale per pipetta da 200 microlitri fino a formare una guarnizione. Applicare un sottile strato di colla cianoacrilica su un altro puntale per pipette da 200 microlitri, quindi spingerlo nel primo puntale per fissare il tubo in posizione. Quindi collegare l'estremità aperta del tubo FEP a una siringa Hamilton da 1 millilitro riempita di olio minerale.

Inserire il gruppo del puntale della pipetta da 200 microlitri nel puntale della pipetta da 10 microlitri dell'ugello concentrico. Quindi, riempire la siringa da 100 microlitri con una soluzione bloccante PBSA al 4%. Ricollegare e lavare il tubo acquoso con la soluzione bloccante.

Ripeti due volte per un totale di tre vampate. Quindi riempire la siringa da 100 microlitri con un anticorpo di rilevamento da 0,125 microgrammi per litro in PBSA al 4% e ricollegare il tubo. Sostituire la soluzione bloccante nel tubo erogando 25 microlitri di soluzione di anticorpi di rilevamento.

Sciacquare il tubo dell'olio con olio minerale fino a quando tutti i tubi e l'ugello non si riempiono di olio. Quindi riempire la siringa da 1 millilitro con olio minerale e ricollegare il tubo. Infine, fissare il tubo e il gruppo ugello a un manipolatore XYZ.

Per formare goccioline indirizzabili, fissare il chip sul tavolino del microscopio. Registra le coordinate del tavolino del microscopio di ogni punto dell'array utilizzando il software di controllo automatico del microscopio. Quindi, posizionare il manipolatore XYZ sul tavolino del microscopio.

Posizionare le siringhe in pompe a siringa separate poiché dovranno essere azionate in modo indipendente. Posizionare l'ugello con un angolo compreso tra 50 e 60 gradi. Quindi impostare la pompa a siringa acquosa per erogare 10 nanolitri di 100 microlitri al minuto e impostare la pompa a siringa dell'olio per disperdere 5 microlitri a 100 microlitri al minuto.

Erogare la soluzione acquosa fino a quando non è visibile una goccia di fluido sulla testa dell'ugello. Tamponare la perlina con un panno senza polvere per rimuoverla. Utilizzando il software di controllo automatizzato del microscopio, impostare le coordinate del tavolino del microscopio su un punto dell'anticorpo nell'array e mettere a fuoco la superficie del vetrino coprioggetti.

Quando si allinea l'ugello, fare attenzione a non disturbare il punto dell'anticorpo. Prestare particolare attenzione e assicurarsi di osservare l'avvicinamento della punta capillare in vetro attraverso un microscopio. Facendo attenzione a non disturbare il punto, utilizzare il manipolatore XYZ per allineare la punta capillare in vetro dell'ugello concentrico al lato del punto dell'anticorpo.

Una volta allineato, erogare 10 nanolitri di soluzione acquosa. Senza spostare gli stadi, erogare cinque microlitri di olio per tappare la soluzione acquosa. Sollevare lentamente l'ugello dalla gocciolina e passare al pozzetto successivo.

Ripetere questo passaggio per tutti i punti di anticorpi nell'array. Dopo 30 minuti, eseguire l'imaging di tutti i punti nell'array utilizzando il software di controllo automatizzato del microscopio per determinare lo sfondo delle singole molecole legate a ciascun punto dell'anticorpo prima di caricare le cellule. Per caricare le goccioline indirizzabili con le cellule, abbiamo sospeso le cellule in una soluzione di anticorpo di rilevamento da 0,125 microgrammi per millilitro in terreno L-15 con FDS al 10%.

Filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare con passo di 40 micron per garantire una sospensione a cella singola. Caricare le singole cellule nelle goccioline indirizzabili dal serbatoio cellulare utilizzando il micromanipolatore e il microcapillare. Osservando attraverso un obiettivo 10x, utilizzare il microiniettore per aspirare una singola cellula nel microcapillare dal serbatoio cellulare.

Lavorando manualmente con un joystick, versare automaticamente utilizzando la funzione di espulsione di uno stadio manipolatore elettronico. Scartare la micropipetta traslandola verso l'alto per liberare l'altezza di 1 millimetro del chip. Imposta le coordinate del tavolino su quelle di una gocciolina indirizzabile utilizzando il software di controllo automatico del microscopio.

Iniettare la micropipetta riportandola nella posizione Z memorizzata. Eseguire questa operazione manualmente con il joystick o automaticamente se si utilizza uno stadio manipolatore elettronico. I processi meccanici dovuti alla lisi indotta dal laser possono creare un'emulsione sul bordo della gocciolina che le energie dell'impulso più elevate possono distruggere completamente le goccioline.

Assicurarsi che le energie degli impulsi di lisi siano ridotte al minimo e che le cellule non si depositino sul bordo immediato delle goccioline. Erogare le cellule nella gocciolina indirizzabile utilizzando il microiniettore. Visualizzare le cellule in goccioline utilizzando la microscopia a campo chiaro, inclusa l'imaging a fluorescenza.

Inoltre, visualizza tutti i punti nell'array utilizzando la microscopia TIRF a singola molecola. Concentrati sulla cella in una gocciolina indirizzabile. Ottieni una lisi ottica completa concentrando un singolo impulso laser di 6 nanosecondi vicino alla posizione della cellula.

Notare il momento in cui ogni cellula viene lisata. Acquisire immagini di singole molecole utilizzando la microscopia TIRF di tutti i punti ogni dieci minuti per i primi 30 minuti, quindi ogni 20 minuti per altri 60 minuti. Se sei interessato solo alla quantità di proteina legata all'equilibrio, immagina tutte le macchie dopo aver incubato il chip per 90 minuti a temperatura ambiente.

Per eseguire il conteggio a singolo molcolo per qualsiasi spot di anticorpi non congestionato, caricare l'immagine di sfondo acquisita prima della lisi. Nelle Figi, seleziona l'immagine di sfondo. Nel menu immagine, seleziona duplica per duplicare lo sfondo.

Quindi seleziona l'immagine duplicata e nella scheda dei filtri di processo seleziona Sfocatura gaussiana e specifica un raggio di 50 pixel. Passare al processo e selezionare il calcolatore di immagini. Lì specificare l'operazione di divisione, le immagini richieste, quindi selezionare le caselle crea nuova finestra e il risultato a 32 bit.

Sottrai ogni pixel dell'immagine di uno. Quindi selezionate un'area di 50 x 50 pixel in uno dei quattro angoli dell'immagine piatta di sfondo. Misurare la deviazione standard dell'intensità dei pixel selezionando analizza e misura.

In Regolazione immagine, selezionare la soglia e impostare il livello di soglia inferiore su tre deviazioni standard. Nella maschera SM dell'immagine segmentata, impostate i valori di intensità dei pixel su zero per tutti gli oggetti che non hanno una dimensione da quattro a nove pixel quadrati e una circolarità da 0,5 a 1. A tale scopo, selezionare Analizza seguito da Analizza particelle e specificare le dimensioni e la circolarità.

Per gli stessi spot di anticorpi, caricare e ripetere i passaggi di analisi dei dati per tutti i fotogrammi di immagini acquisiti come serie di risultati temporali acquisiti dopo la lisi. Nei risultati rappresentativi delle immagini di singole molecole, il segnale nelle immagini di sfondo mostra il livello inferiore di legame aspecifico dell'anticorpo di rilevamento marcato in fluorescenza alla superficie e allo spot dell'anticorpo. L'immagine ingrandita mostra le singole molecole evidenziate con frecce rosse.

Viene mostrata anche un'immagine tipica di un pulldown di p53 nelle cellule di carcinoma del colon umano BE. Questa sequenza di immagini mostra l'accumulo della proteina p53 sullo spot dell'anticorpo. Una curva di calibrazione ottenuta utilizzando concentrazioni note della proteina combinante viene utilizzata per convertire la conta di singole molecole su ciascun punto nel numero di proteine bersaglio nel volume di analisi e suggerisce il numero di copie di una singola cellula.

La linea tratteggiata rossa orizzontale indica il livello di associazione non specifica. L'espressione basale della proteina p53 nelle cellule tumorali BE mostra una distribuzione gamma-like a coda lunga in cui l'espressione della proteina p53 in alcune cellule è significativamente superiore al valore modale. Qui, l'espressione della proteina p53 è tracciata in funzione del volume cellulare calcolato dal diametro cellulare misurato prima della lisi.

I risultati indicano che in queste cellule viene mantenuta una concentrazione minima della proteina p53. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'abbondanza di una proteina bersaglio con risoluzione a singola cellula. Quando si lavora con le cellule biologiche, è importante ricordare che le proteine possono degradarsi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro quattro ore se eseguita correttamente e può essere incorporata nei protocolli di analisi dei campioni primari dei pazienti. Le tecniche a singola cellula possono aiutare a fornire informazioni sulla funzione e sul comportamento cellulare, nonché a identificare eventi rari che altrimenti verrebbero persi da entrambi i metodi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia di p53 e delle linee cellulari di cancro al seno, può anche essere applicato ad altri studi sulle malattie senza la necessità di etichettatura, il che è utile nello studio delle cellule primarie da campioni di pazienti.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la PCR a punti quantici per rispondere a ulteriori domande, come determinare se l'RNA bersaglio e l'espressione proteica sono correlati. La misurazione del numero assoluto di copie di una proteina sarà interessante per i biomatematici e gli scienziati computazionali a supporto dei loro modelli biologici.