Name: Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Scopri come determinare il numero assoluto di copie proteiche in singole cellule utilizzando microarray di goccioline indirizzabili. Questo metodo rivela l'eterogeneità dell'espressione di p53 nelle linee cellulari tumorali.

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ASR progettato esperimenti, sviluppato protocolli e analizzato i dati. SC e PS eseguiti esperimenti di dimensione di cella. ASR e OC ha scritto il manoscritto. Gli autori desiderano riconosciamo con gratitudine il sostegno della Prof. ssa David R. Klug per l'accesso alle attrezzature. Gli autori desiderano ringraziare l'imperiale Hackspace di Advanced ha per l'accesso alle strutture di prototipazione e fabbricazione College.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Indirizzabile gocciolina Microarrays sono un metodo sensibile ed estensibile per determinare quantitativamente il numero assoluto di copia della proteina all'interno di una singola cella.
Limitare il livello di legame aspecifico (NSB) è critico all'interno del protocollo al raggiungimento di un limite di rilevazione possibile come basso. Proteine e altre specie biochimiche non specifico può associare a un numero di interfacce presenti all'interno le goccioline — la superficie del vetrino copri...

L'obiettivo di questo metodo è quello di determinare la variazione in abbondanza di una proteina dell'obiettivo in una popolazione di cellule con risoluzione di singola cellula. Analisi unicellulare fornisce una serie di vantaggi che non sono disponibili con metodi biochimici ensemble tradizionale. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in primo luogo, lavorare a livello di singola cellula può catturare l'eterogeneità ricca di una popolazione di cellule che altrimenti andrebbero persi il calcolando che si verifica con tecniche biochimiche ensemble tradizionale. La maggior parte dei metodi biochimici cavallo di lavoro funziona con la maggior parte, che richiedono, come spesso fanno, milioni di cellule per produrre un risultato. Naturalmente, le conseguenze della valutazione popolazioni a cellula intera dipende da una serie di fattori, ad esempio, l'eterogeneità nell'espressione della proteina dove possono essere perso alcune caratteristiche importanti della distribuzione dell'abbondanza di proteine. Dal punto di vista pratico, la sensibilità necessaria delle tecniche di singola cellula li rendono in grado di lavorare con quantità di materiale biologico che è insufficiente per anche più sensibili tecniche di bulk funzionare. Un esempio chiave è lo studio dei tipi cellulari rari come fare circolare le cellule del tumore (CTCs) dove anche per i pazienti con una prospettiva prognostico difficile meno di 10 CTCs potrebbero essere presenti in un singolo 7,5 mL di sangue disegnare. 6 qui presentiamo la metodologia necessaria per eseguire misurazioni di proteina singola cella usando un volume ridotto dosaggio anticorpo-basato che impiegano le goccioline di olio-capped stampato su un microarray dell'anticorpo.
Microfluidica gocciolina piattaforme sono a resa elevata, in grado di generare migliaia di goccioline al secondo e in grado di isolare e persino la coltura, singole cellule in singole gocce per eseguire una vasta gamma di analisi biochimiche. Tecniche basate su goccia sono adatti per analisi unicellulare,7,8,9 con notevoli esempi recenti tra cui DropSeq10 e inDrop11, che sono state notevolmente favorite dalla potenza di tecniche di amplificazione. La quantità limitata di materiale e senza metodi di amplificazione per proteine rendono unicellulare proteomica particolarmente impegnativi.
Le goccioline possono essere analizzate da un certo numero di metodi e microscopia di fluorescenza è stato ampiamente utilizzata. Tecniche di singola molecola come microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale permette di molecole fluorescenti essere visualizzato con impareggiabile rapporto segnale-rumore. 12 a causa del decadimento esponenziale del campo evanescente, solo fluorofori in alta vicinanza alla superficie (ordine di 100nm) sono eccitati rendendo TIRF una buona strategia nella rilevazione di piccole quantità di una molecola di target in una miscela complessa. La forza intrinseca di sezionamento ottica di TIRF aiuta anche ad per evitare fasi di lavaggio e limiti di analisi tempi e la complessità. Tuttavia, TIRF richiede superfici planari ed esempi di microscopia TIRF applicato a goccioline nel flusso comportano la formazione di una superficie planare di cui all'immagine. 13 a tal fine, tecniche di proteomica di singola cellula spesso progettare chip microfluidici intorno agenti di superficie-immobilizzata cattura in un formato di microarray. 4 , 14
Le goccioline, essi stessi, possono essere formate in matrici su superfici planari, cosiddetto gocciolina microarrays. 15 , 16 , 17 organizzare spazialmente goccioline in matrici permette loro di essere convenientemente indicizzati, facilmente monitorati nel tempo, singolarmente indirizzati e, se necessario, Estratto. Gocciolina microarrays può raggiungere un'alta densità di micro-reattori con migliaia di elementi per ogni chip che sono supportati da strutture microtiter o autoportante. 18 , 19 , 20 può essere costituiti da deposizione sequenziale da robot di manipolazione dei liquidi, spotters a getto d'inchiostro, contattare microarrayers21,22,23,24,25, 26 , o essi possono assemblarsi su superfici come superhydrophillic macchie modellato su una superficie superidrofobiche. 27 , 28 , 29
Con queste considerazioni in mente, indirizzabile gocciolina Microarrays (ADMs) sono stati progettati per combinare la versatilità, spaziale indirizzabilità e volumi ridotti di microarrays di goccia con la sensibilità di microscopia TIRF di singola molecola per quantitativamente misurare l'abbondanza di proteine. 5 ADMs abilitare analisi unicellulare formando un gocciolina microarray contenente cellule singole sopra un microarray dell'anticorpo, che è stato limitato con olio per evitare l'evaporazione. I volumi delle goccioline sono discreti per prevenire la perdita di campione, che altrimenti si otterrebbe con il chip valvole a flusso continuo microfluidica. 30 la quantità assoluta di proteina bersaglio da una singola cellula è estremamente piccola; Tuttavia, il volume ridotto delle goccioline consente relativamente alta concentrazione locale in modo che essi vengono rilevati usando un'analisi di anticorpo panino - anticorpo è immobilizzato in una distinta regione, o spot, su una superficie che cattura la proteina che a sua volta lega per un anticorpo di rilevazione fluorescente etichettati presente nel volume delle gocce. Come un approccio privo di etichetta (cioè proteina gli obiettivi non devono essere etichettati direttamente), sono generalmente applicabili all'analisi di cellule da fonti primarie, come sangue trasformati ADMs, bene bisogno aspira e le biopsie del tumore dissociata, come pure le cellule dalla cultura e loro lisati.
Misura la variazione in abbondanza di proteine attraverso una popolazione delle cellule è importante nel determinare l'eterogeneità nella risposta, ad esempio, ad una droga e contribuirà a fornire approfondimenti funzioni cellulari e percorsi, valutazione sottopopolazioni e loro comportamento così come identificare eventi rari che altrimenti sarebbero mascherati da metodi di massa. Questo protocollo descrive come produrre e utilizzare indirizzabile gocciolina microarrays per determinare quantitativamente l'abbondanza del fattore trascrizione p53 in cellule tumorali umane e può essere usato per studiare il ruolo di p53 nella risposta ai farmaci chemioterapici. La proteina dell'obiettivo è determinata dalla scelta di acquisizione e rilevamento di anticorpi e può essere modificata per includere ulteriori o diverse destinazioni. Vengono fornite istruzioni per costruire un semplice apparato che incorporano un ugello concentrico da consumabili di laboratorio generali a 10 gocce di nL ricoperti con olio di matrice manualmente. Il processo completo sperimentale è descritto per cui ciascuna gocciolina viene quindi caricato con una singola cella, che è poi lisata e l'espressione della proteina determinata con risoluzione di singola molecola usando la microscopia TIRF.

<table><tbody><tr><td><forte>Coltura cellulare</soluzione salina tamponata >con</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto glucosio</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td>Fiasche per colture cellulari <td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Regno Unito</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Dimensioni (mm): 65,0 x 25,0; Spessore (mm) 0,17</td></tr><tr><td>p53 anticorpo di cattura</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 anticorpo di rilevamento, Alexa Fluor 488 marcato</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentrazione di stock 200&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Tampone citrato di sodio-soluzione salina</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio dodecilsolfato</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti (basso volume)</td><td>Bombola di gas di</td> azoto Sigma <td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BOC</td><td>Grado industriale, privo</td><td></td> di ossigeno</tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore manuale</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, Danimarca</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Pompe a siringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Siringa L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>A tenuta di gas, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>A tenuta di gas, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Isolatore in silicone</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>Isolatore in silicone 6x4 pozzetti con taglierina laser adesiva</td></tr><tr><td></td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 Laser CO2 3W</td><td>per il taglio laser di isolatori personalizzati Lastra</td></tr><tr><td>acrilica di 1 mm di spessore</td><td>Weatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>per il taglio laser di isolatori personalizzati</td></tr><tr><td>Foglio adesivo</td><td>3M</td><td></td><td>utilizzato per far aderire isolatori personalizzati a vetrini coprioggetti microarrayed Super</td></tr><tr><td>colla</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m Tubo in silice fusa con diametro esterno</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Tubo OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" ID/0,062 pollici Tubo in PTFE OD</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP tubo</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albume sierico bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Millipore, Germania</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopy & Microscopio ottico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF con tavolino XY codificato</td><td>Nikon, Giappone</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irlanda</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di eccitazione laser</td><td>Vortran, USA</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente laser a lisi ottica</td><td>Continuum, USA</td><td>Microscopio Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> cubo filtrante per TIRF</td><td>Chroma, USA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtrante per microscopio laser a lisi ottica</td><td>2000, Regno Unito</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Software di <td>analisi delle immagini</td><td>Open Source</td><td></td> <td>delle Figi</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versione 7.14 o superiore</td> Software <td>di analisi delle immagini</td></tr></tbody></table>

proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile microarrays di conteggio

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comportamento spesso cellulare e risposte cellulari vengono analizzate a livello di popolazione, dove le risposte di molte cellule sono raggruppate insieme come un risultato medio il comportamento ricco singola cella all'interno di una popolazione complessa di mascheramento. Tecnologie di rilevazione e quantificazione della proteina singola cella hanno avuto un impatto notevole negli ultimi anni. Qui descriviamo una piattaforma di analisi unicellulare pratico e flessibile basata su microarrays gocciolina indirizzabile. Questo studio descrive come i numeri di copia assoluta di proteine bersaglio possono essere misurati con risoluzione di singola cellula. L'oncosoppressore p53 è il gene più comunemente mutato nel cancro umano, con oltre il 50% dei casi di cancro totale che esibiscono un modello di espressione di p53 non sani. Il protocollo descrive la procedura per creare 10 gocce nL entro il quale le cellule tumorali umane singolo sono isolate e il numero di copie della proteina p53 è misurato con risoluzione di singola molecola per determinare con precisione la variabilità nell'espressione. Il metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula compreso il materiale primario per determinare il numero di copia assoluta di qualsiasi proteine bersaglio di interesse.

Il numero di copia assoluta basale della proteina di p53 è stato determinato con risoluzione singola cella in una linea cellulare di cancro del colon umano, le cellule BE. Dimostriamo come espressione di p53 può variare nel corso di diversi ordini di grandezza e mostrano una correlazione positiva debolmente tra numero di copia dimensioni e proteina delle cellule all'interno della popolazione di cellule BE riposo.
Indirizzabile g...

Qui presentiamo indirizzabile gocciolina microarrays (ADMs), un metodo di matrice basata gocciolina in grado di determinare l'abbondanza assoluta della proteina in cellule singole. Dimostriamo la capacità di ADMs per caratterizzare l'eterogeneità nell'espressione della proteina oncosoppressore p53 in una linea cellulare di cancro umano.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il numero assoluto di copie di una proteina bersaglio con risoluzione a livello di singola cellula. Le tecniche su singola cellula permetteranno una migliore comprensione del comportamento di una proteina in relazione al dogma centrale e contribuiranno a una quantificazione accurata dell'espressione genica regolata. Lavorare a livello di singola cellula consente di catturare l'ampia eterogeneità della popolazione cellulare, che altrimenti verrebbe persa a causa della mediazione tipica delle tecniche biochimiche tradizionali.Generalmente, le persone nuove a questo metodo potranno incontrare difficoltà a causa della sensibilità dei saggi su singola cellula o della quantità limitata di proteine in ogni cellula. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando desideravamo eseguire un saggio proteico su singola cellula che potesse essere facilmente campionato per ulteriori analisi in fasi successive. Iniziare questa procedura preparando le chip e stampando microarray di anticorpi come descritto nel protocollo testuale.Per preparare l'apparecchiatura, inserire un tratto di 100 millimetri di tubo in silice fusa con diametro interno di 150 micron e diametro esterno di 360 micron all'interno di un tratto di 40 millimetri di tubo PFA con diametro interno di 1 millimetro e diametro esterno di 1/16 di pollice, fino a farlo sporgere di due millimetri. Questo formerà l'ugello concentrico. Applicare uno strato sottile di colla cianoacrilica all'estremità di una punta per pipetta da 10 microlitri e inserirla nel tratto di 40 millimetri di tubo PFA.Se necessario, riposizionare il tubo in silice fusa per mantenere una sporgenza di 2 millimetri all'estremità del beccuccio prima che l'adesivo si indurisca. Inserire l'altra estremità del capillare in silice fusa nell'estremità di un tubo in PTFE lungo 200 millimetri con diametro interno di 014 pollici e diametro esterno di 062 pollici. Collegare questo a una siringa Hamilton da 100 microlitri riempita con albumina sierica bovina al quattro percento in soluzione salina tamponata al fosfato.Inserire quindi un tratto di 400 millimetri di tubo FEP con diametro interno di 1 millimetro e diametro esterno di 2 millimetri all'interno di una punta per pipetta da 200 microlitri finché non forma una guarnizione. Applicare uno strato sottile di colla cianoacrilica su un'altra punta per pipetta da 200 microlitri, quindi inserirla nella prima punta per fissare il tubo in posizione. Successivamente, collegare l'estremità libera del tubo FEP a una siringa Hamilton da 1 millilitro riempita con olio minerale.Inserire l'assemblaggio della punta della pipetta da 200 microlitri nella punta della pipetta da 10 microlitri dell'ugello concentrico. Successivamente, riempire la siringa da 100 microlitri con soluzione bloccante PBSA al 4 percento. Riattaccare e risciacquare il tubo acquoso con la soluzione bloccante.Ripetere due volte per un totale di tre risciacqui. Quindi riempire la siringa da 100 microlitri con anticorpo di rilevamento a 0,125 microgrammi per litro in PBSA al 4 percento e riattaccare il tubo. Sostituire la soluzione bloccante nel tubo rilasciando 25 microlitri di soluzione di anticorpo di rilevamento.Svuotare il tubo dell'olio con olio minerale fino a quando tutto il tubo e la punta si riempiono di olio. Quindi ricaricare la siringa da 1 millilitro con olio minerale e ricollegare il tubo. Infine, fissare l'insieme di tubo e punta a un manipolatore XYZ.Per formare gocce indirizzabili, fissare la chip sullo stage del microscopio. Registrare le coordinate dello stage del microscopio di ogni punto nell'array utilizzando il software di controllo automatico del microscopio. Successivamente, impostare il manipolatore XYZ sullo stage del microscopio.Posizionare le siringhe in pompe per siringhe separate poiché dovranno essere gestite in modo indipendente. Posizionare la punta a un angolo compreso tra 50 e 60 gradi. Impostare quindi la pompa per siringa acquosa per erogare 10 nanolitri a 100 microlitri al minuto e impostare la pompa per siringa dell'olio per disperdere 5 microlitri a 100 microlitri al minuto.Dispensare la soluzione acquosa fino a quando una goccia di liquido diventa visibile all'estremità della punta. Rimuovere la goccia tamponando delicatamente con un panno privo di polvere. Utilizzando il software di controllo automatizzato del microscopio, impostare le coordinate della piastra del microscopio su un punto dell'anticorpo presente nell'array e mettere a fuoco la superficie del vetrino coprioggetto.Quando si allinea l'ugello, prestare attenzione a non disturbare il punto di anticorpo. Avere particolare cura e assicurarsi di osservare l'avvicinamento della punta della capillare di vetro attraverso un microscopio. Senza disturbare il punto, utilizzare il manipolatore XYZ per allineare la punta della capillare di vetro dell'ugello concentrico al lato del punto di anticorpo.Dopo l'allineamento, dispensare 10 nanolitri di soluzione acquosa. Senza muovere i piatti, dispensare cinque microlitri di olio per sigillare la soluzione acquosa. Sollevare lentamente l'ugello al di fuori della goccia e passare al pozzetto successivo.Ripetere questo passaggio per tutti i punti di anticorpo nell'array. Dopo 30 minuti, acquisire le immagini di tutti i punti nell'array utilizzando il software di controllo del microscopio automatico per determinare il segnale di fondo di singole molecole legate a ciascun punto di anticorpo prima del caricamento delle cellule. Per caricare le gocce indirizzabili con le cellule, abbiamo sospeso le cellule in una soluzione di anticorpo di rilevamento a 0,125 microgrammi per millilitro in mezzo L-15 contenente il 10 percento di FDS.Filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare con maglia da 40 micron per garantire una sospensione di cellule singole. Caricare le cellule singole nelle gocce indirizzabili dal serbatoio cellulare utilizzando il micromanipolatore e la microcapillare. Osservando attraverso un obiettivo 10x, utilizzare il microiniettore per aspirare una singola cellula nella microcapillare dal serbatoio cellulare.Lavorando manualmente con un joystick, versare automaticamente utilizzando la funzione di espulsione di un supporto di manipolazione elettronico. Rigettare la micropipetta spostandola verso l'alto per superare l'altezza di 1 millimetro del chip. Impostare le coordinate dello stadio su quelle di una goccia indirizzabile utilizzando il software di controllo automatizzato del microscopio.Iniettare la micropipetta riposizionandola sulla posizione Z memorizzata. Eseguire questa operazione manualmente mediante joystick oppure automaticamente se si utilizza una piattaforma di manipolazione elettronica. I processi meccanici dovuti alla lisi indotta dal laser possono generare un'emulsione al bordo della goccia, che energie di impulso più elevate possono interrompere completamente.Assicurarsi che le energie dei pulsanti di lisi siano mantenute al minimo e che le cellule non vengano depositate immediatamente ai bordi delle gocce. Distribuire le cellule nella goccia indirizzabile utilizzando il microinjectore. Acquisire immagini delle cellule all'interno delle gocce mediante microscopia in campo chiaro, inclusa qualsiasi acquisizione in fluorescenza.Acquisire inoltre immagini di tutti i punti nell'array utilizzando la microscopia TIRF a singola molecola. Concentrarsi sulla cellula all'interno di una goccia indirizzabile. Ottenere una lisi ottica completa focalizzando un singolo impulso laser di 6 nanosecondi vicino alla posizione della cellula.Registrare il momento in cui ogni cellula viene lisata. Acquisire immagini a singola molecola mediante microscopia TIRF di tutti i punti ogni dieci minuti per i primi 30 minuti, quindi ogni 20 minuti per ulteriori 60 minuti. Se si è interessati soltanto alla quantità di proteina legata all'equilibrio, acquisire le immagini di tutti i punti dopo aver incubato il chip per 90 minuti a temperatura ambiente.Per eseguire il conteggio di singole molecole per qualsiasi punto di anticorpo non congestionato, caricare l'immagine di sfondo acquisita prima della lisi. In Fiji, selezionare l'immagine di sfondo. Nel menu immagine, selezionare duplica per duplicare lo sfondo.Quindi selezionare l'immagine duplicata e, sotto la scheda filtri di processo, scegliere sfocatura gaussiana e specificare un raggio di 50 pixel. Passare a elaborazione e selezionare calcolatore di immagini. Qui specificare l'operazione divisione, le immagini richieste, quindi selezionare le caselle crea nuova finestra e risultato a 32 bit.Sottrarre uno a ogni pixel dell'immagine. Quindi selezionare un'area di 50 pixel per 50 pixel in uno qualsiasi dei quattro angoli dell'immagine di fondo uniforme. Misurare la deviazione standard dell'intensità dei pixel selezionando analizza e misura.Nella sezione "adjust dell'immagine", selezionare la soglia e impostare il livello di soglia inferiore a tre deviazioni standard. Nell'immagine segmentata, impostare i valori di intensità dei pixel a zero per tutti gli oggetti che non hanno una dimensione compresa tra quattro e nove pixel quadrati e una circolarità compresa tra 0,5 e 1. A tale scopo, selezionare "analyze" seguito da "analyze particles" e specificare dimensione e circolarità.Per gli stessi spot di anticorpo, caricare e ripetere i passaggi di analisi dei dati per tutti i fotogrammi delle immagini acquisiti come serie temporale ottenuta dopo la lisi. Nei risultati rappresentativi di immagini a singola molecola, il segnale presente nelle immagini di fondo mostra un basso livello di legame non specifico dell'anticorpo di rilevamento marcato con fluorocromo alla superficie e allo spot di anticorpo. L'immagine ingrandita in sovraimpressione mostra singole molecole evidenziate con frecce rosse.Viene mostrata anche un'immagine tipica di un pulldown di p53 in cellule di carcinoma del colon umano BE. Questa sequenza di immagini mostra l'accumulo della proteina p53 sul punto dell'anticorpo. Una curva di calibrazione ottenuta utilizzando concentrazioni note della proteina ricombinante viene utilizzata per convertire il conteggio delle singole molecole su ogni punto nel numero di proteine bersaglio nel volume di analisi, suggerendo il numero di copie a livello di singola cellula.La linea rossa tratteggiata orizzontale indica il livello di legame aspecifico. L'espressione proteica basale di p53 nelle cellule tumorali di BE mostra una distribuzione simile a una gamma con coda lunga, in cui l'espressione della proteina p53 in alcune cellule è significativamente più alta rispetto al valore modale. Qui, l'espressione della proteina p53 è rappresentata in funzione del volume cellulare calcolato a partire dal diametro cellulare misurato prima della lisi.I risultati indicano che una concentrazione minima della proteina p53 viene mantenuta in queste cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'abbondanza di una proteina bersaglio con risoluzione a singola cellula. Durante il lavoro con cellule biologiche, è importante ricordare che le proteine possono degradarsi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro quattro ore se eseguita correttamente e può essere integrata in protocolli di analisi di campioni primari da pazienti. Le tecniche a singola cellula possono aiutare a comprendere la funzione e il comportamento cellulare, oltre a identificare eventi rari che altrimenti verrebbero persi con entrambi i metodi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia di p53 e sulle linee cellulari del carcinoma mammario, può essere applicato anche ad altri studi di malattie senza la necessità di marcatura, il che risulta vantaggioso nello studio di cellule primarie provenienti da campioni di pazienti.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la PCR con punti quantici per rispondere a ulteriori domande, ad esempio determinare se l'espressione dell'RNA bersaglio e della proteina è correlata. La misurazione del numero assoluto di copie di una proteina sarà interessante per i biomatematici e gli scienziati computazionali nel supportare i loro modelli biologici.

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Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Questo protocollo descrive la fabbricazione di una grande scala, DNA o anticorpi array bidimensionale multiplato, con potenziali applicazioni in studi di segnalazione cellulare e rilevazione biomarker.

Flow-modello Fabrication guidata della alta densità di codici a barre anticorpo Microarray

Viene descritto un metodo sensibile e accurato per la quantificazione di microRNA privi di cellule utilizzando una chimica basata su coloranti e una tecnologia PCR digitale a goccioline.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free

Questo protocollo descrive le procedure generali e controlli di qualità necessari per la preparazione di cellule singole mammifera adulte sane per le preparazioni di RNA-Seq unicellulare gocciolina-based, alta velocità di trasmissione. Parametri di sequenziazione, leggi l'allineamento e l'analisi bioinformatica di cella singola a valle sono inoltre forniti.

Gocciolina basati su codici a barre singola cella trascrittomica dei tessuti dei mammiferi adulti

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

L'obiettivo generale del protocollo è quello di preparare oltre un milione di goccioline di femminiter ordinate, uniformi, stabili e biocompatibili su un substrato di 1 cm2 planari che può essere utilizzato per la sintesi proteica priva di cellule.

Un array di gocciole del femtolitro per sintesi proteica massicciamente parallela da molecole di DNA singolo

Qui presentiamo un protocollo per misurare il numero assoluto di copie del DNA mitocondriale (mt) e i livelli di eteroplasmia di delezione del mtDNA in singole cellule.

Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

Questo metodo quantifica l'abbondanza microbica utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti per le unità formanti colonie di placca (CFU) e viene applicato al microbioma di Drosophila in campioni di omogenato di mosca interi. I CFU vengono conteggiati con un software di analisi delle immagini automatizzato fornito qui.

Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma Drosophila

Scopri come determinare il numero assoluto di copie proteiche in singole cellule utilizzando microarray di goccioline indirizzabili. Questo metodo rivela l'eterogeneità dell'espressione di p53 nelle linee cellulari tumorali.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

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