Un metodo standardizzato per la misurazione della superficie interna polmonare tramite la polmonite e l'impianto di protesi
26 luglio 2017
La superficie interna polmonare (ISA) è un criterio critico per valutare la morfologia polmonare e la fisiologia delle malattie polmonari e della rigenerazione alveolare indotta da lesioni. Qui descriviamo un metodo standardizzato che può ridurre al minimo la polarizzazione di misura per ISA sia nei modelli di polmonite polmonare sia nei modelli di protesi.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare con precisione la superficie interna del polmone di un topo dopo pneumonectomia e impianto di protesi. Questo metodo consente di analizzare le funzioni morfologiche e fisiologiche del polmone nella rigenerazione polmonare adulta indotta da forze meccaniche. Il principale vantaggio di questa tecnica è la quantificazione accurata della superficie interna del polmone, che promette di aumentare l'affidabilità e la riproducibilità dello stato della funzione polmonare.
Preparare il topo per l'intervento chirurgico su una piattaforma di intubazione con il lato ventrale accessibile. Quindi estrarre la lingua e ispezionare le corde vocali con un laringoscopio per piccoli animali compatibile con guide catetere. Successivamente, inserire delicatamente un catetere endovenoso di calibro 20 nella trachea con un angolo interno.
Successivamente, posizionare il topo in posizione laterale destra e collegare la cannula a un ventilatore meccanico. Osservare il torace per valutare l'inserimento della cannula nella trachea. Impostare la pressione inspiratoria a 12 centimetri di acqua e regolare la frequenza respiratoria a 120 atti al minuto.
Ora, pulire la cute esposta con almeno tre passaggi alternati di Betadine ed etanolo al 70%. Quindi iniziare l'intervento chirurgico praticando un'incisione toracotomica posterolaterale lunga da due a tre centimetri nello spazio intercostale quinto. Penetrare la muscolatura utilizzando forbici a molla di Noyes.
Successivamente, effettuare un'incisione di 1,5 centimetri per esporre il polmone sinistro. Se necessario durante l'intervento chirurgico, utilizzare un cauterizzatore ad alta temperatura per arrestare l'emorragia. Poi, sollevare con pinzette a punta ottusa un terzo del lobo polmonare sinistro dal torace ed estrarre l'intero polmone sinistro con un bastoncino di ovatta.
Ora, identificare l'arteria polmonare e i bronchi del lobo polmonare sinistro e legare saldamente i bronchi e i vasi all'ilo con un filo chirurgico imbevuto. Successivamente, asportare il lobo polmonare sinistro a una distanza di tre-quattro millimetri dalla legatura, avendo cura di non recidere il filo, il che potrebbe causare pneumotorace. Quindi, chiudere la parete toracica con un punto di sutura.
Quindi, suturare in sequenza il strato muscolare e il strato cutaneo, utilizzando da cinque a sei punti separati con intervalli di tre a quattro millimetri. Assicurarsi di mantenere l'ago della sutura chirurgica lontano dal cuore. La puntura cardiaca è letale.
Infine, disinfettare l'area chirurgica con iodopovidone. Successivamente, posizionare il topo su un tappetino termico a 38 gradi Celsius. Continuare a utilizzare il ventilatore fino al ritorno della respirazione spontanea.
Eseguire l'operazione precedentemente descritta, ma subito dopo aver rimosso il polmone, prepararsi a inserire la protesi. Utilizzando pinze smussate, afferrare il centro della protesi ellissoidale in silicone. Successivamente, mentre si tiene una costola con le pinze per esporre la cavità toracica, inserire molto delicatamente la protesi.
Entrare con un angolo di 45 gradi tra il piano frontale della protesi e la superficie toracica. Utilizzando pinze ottuse, assicurarsi che la protesi sia completamente all'interno della cavità toracica sinistra vuota. Chiudere ora il torace e monitorare il topo come descritto in precedenza.
Per questa procedura, assemblare un tubo di insufflazione personalizzato composto da un pistone rimosso da una pipetta sierologica da 10 millilitri, un tubo flessibile lungo 40 centimetri con adattatore per ago, una valvola di regolazione della portata e un ago da 18 gauge. Una volta assemblato, fissare la pipetta al banco con del nastro. La distanza tra la sommità della pipetta e il piano di lavoro deve essere di almeno 30 centimetri.
Dopo aver soppresso il topo mediante iniezione anestetica, fissarlo su una tavola sterilizzata e aprire con attenzione il torace per asportare lo sterno ed esporre i lobi polmonari. Successivamente, esporre la trachea. Poi, riempire il tubo di insufflazione con PFA al 4% appena preparato ed eliminare tutte le bolle d'aria dal tubo.
Quindi, inserire l'ago nella trachea. Per evitare perdite, clampare la trachea con clip vascolari. A questo punto, gonfiare il polmone con fissativo a una pressione transpolmonare costante di 25 centimetri di acqua.
Incubare i polmoni a temperatura ambiente per due ore per consentire un'espansione completa. Dopo il gonfiaggio, annotare lo spostamento di volume del fissativo. Ora legare la trachea ed estrarre delicatamente i polmoni intatti dai tessuti connettivi circostanti.
Utilizzare forbici ed essere molto delicati. Successivamente, incubare i polmoni in un tubo conico da 50 millilitri riempito con PFA al 4% per 12 ore a quattro gradi Celsius con agitazione delicata su un agitatore. Procedere quindi con l'elaborazione e la colorazione come descritto nel protocollo testuale.
Per quantificare l'MLI, utilizzare immagini dell'agente impiegato in sezioni raccolte in campo chiaro a un ingrandimento di 20x. Da tre sezioni polmonari diverse, selezionare casualmente un totale di 15 campi non sovrapposti, ciascuno di circa un millimetro quadrato, quindi ventilarli. Utilizzare esclusivamente aree prive di arterie e vene, vie aeree principali o dotti alveolari.
Per l'analisi, disegnare una griglia 10 per 10 su ciascuna area selezionata utilizzando uno strumento righello. Le linee della griglia sono quindi distanti circa 100 micron. Successivamente, determinare un'intercetta lungo la linea come la lunghezza tra due epiteliali alveolari adiacenti.
Ad esempio, le frecce a doppia punta illustrano le lunghezze. Contare tutte queste lunghezze lungo ciascuna linea della griglia e l'MLI è il valore medio delle lunghezze di intercettazione. Utilizzando i protocolli descritti, i topi trattati con PNX sono stati confrontati con i topi con impianto protesico.
I topi utilizzati erano maschi CD-1 di otto settimane, ai quali sono stati resecati i lobi polmonari sinistri. La protesi riproduce le dimensioni e la forma del lobo polmonare sinistro ed è stata inserita nel torace dopo la rimozione del lobo polmonare sinistro. Dopo 14 giorni dall'intervento chirurgico, è stato utilizzato un tubo di gonfiaggio su misura per determinare il volume interno del lobo polmonare destro rimanente.
Il volume medio del polmone destro nei cinque topi trattati con PNX era di circa 1,4 millilitri, valore significativamente maggiore rispetto a quello di 1,05 millilitri osservato nei cinque topi con protesi impiantata. Anche i valori di MLI nei polmoni destri rimanenti erano significativamente più elevati. Utilizzando questi parametri, è stata calcolata l'area superficiale interna del polmone, che si è rivelata significativamente minore nei topi con protesi impiantata.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come calcolare la superficie interna del polmone nel modello murino di rigenerazione alveolare indotta da forze meccaniche.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo standardizzato per la misurazione dell'area superficiale interna del polmone (ISA) nei modelli murini dopo pneumonectomia e impianto di protesi. Una quantificazione accurata dell'ISA è essenziale per comprendere la morfologia e la fisiologia polmonare, in particolare nel contesto delle malattie polmonari e della rigenerazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Fisiologia respiratoria
- Medicina rigenerativa
Sfondo
- L'area superficiale interna del polmone è fondamentale per la valutazione della funzione polmonare.
- Il bias di misurazione può influenzare l'affidabilità degli studi sui polmoni.
- La pneumonectomia e l'implantazione di protesi sono modelli sperimentali comuni.
- La comprensione dell'ISA può contribuire alla valutazione dei processi di rigenerazione polmonare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per misurare l'ISA nei polmoni del topo.
- Migliorare la riproducibilità delle valutazioni della funzione polmonare.
- Facilitare la ricerca sulla rigenerazione polmonare in seguito a lesioni.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del topo su una piattaforma per intubazione.
- Ispezione delle corde vocali mediante laringoscopio per piccoli animali.
- Inserimento di un cannula endovenosa da 20 gauge nella trachea.
- Misurazione dell'ISA dopo l'intervento chirurgico per analizzare la morfologia polmonare.
Risultati principali
- Il metodo fornisce una quantificazione accurata dell'ISA.
- Riduce il bias di misurazione negli studi polmonari.
- Migliora l'affidabilità delle valutazioni fisiologiche.
- Supporta ulteriori ricerche sui meccanismi di rigenerazione polmonare.
Conclusioni
- Il metodo standardizzato migliora la comprensione della morfologia polmonare.
- È applicabile in vari modelli sperimentali di danno polmonare.
- Studi futuri potranno basarsi su questa tecnica per ottenere migliori approfondimenti sulla salute polmonare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Una quantificazione accurata della superficie interna del polmone (ISA) è fondamentale per valutare la funzione respiratoria nei modelli di malattia polmonare e negli studi di rigenerazione. Questo metodo standardizzato riduce il bias dell'osservatore nelle misurazioni morfometriche, migliorando l'affidabilità e la riproducibilità della ricerca preclinica sul polmone. Un aumento della fiducia nelle misurazioni supporta la riduzione dei rischi meccanicistici e il valore predittivo nella validazione degli obiettivi terapeutici respiratori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche nella rigenerazione alveolare fornendo misurazioni ISA prive di bias.
- Valore operativo: Standardizza l'analisi morfometrica del polmone tra i diversi gruppi di studio, riducendo la variabilità nelle valutazioni dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce letture quantitative di ISA che fungono da endpoint funzionali per lo screening di composti in modelli di lesione polmonare.
- Valore operativo: Stabilisce un saggio riproducibile per il volume polmonare interno e l'intercetta lineare media, supportando lo screening morfologico ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le variazioni dell'ISA al rimodellamento polmonare rilevante per le malattie, consentendo un allineamento traslazionale dei biomarcatori negli studi sulla rigenerazione.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, fornendo un parametro funzionale morfometrico costante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta fornendo dati morfometrici quantitativi che informano l'identificazione dei composti promettenti e le decisioni relative all'avanzamento preclinico nella ricerca respiratoria.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di rigenerazione polmonare mediante una quantificazione accurata dell'ISA dopo pneumonectomia o intervento.
- Screening: Permette la preparazione del saggio standardizzando le misurazioni del volume polmonare interno e dell'intervallo lineare medio per la valutazione dell'effetto dei composti.
- Analisi: Genera calcoli dell'ISA a partire dai dati di ILV e MLI, offrendo una metrica quantitativa per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega le variazioni morfometriche alla capacità funzionale del polmone, sostenendo la continuità preclinica nei modelli di rigenerazione alveolare.
- Riutilizzo aziendale: Fornisce una capacità riutilizzabile per l'analisi morfometrica del polmone in diversi modelli di malattie polmonari e studi sulla rigenerazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella valutazione della funzione polmonare, riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi sulla rigenerazione.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle misurazioni dell'area superficiale polmonare tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avvio/cessazione nei processi di validazione del target, efficienza del capitale grazie a dati preclinici affidabili, riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi respiratori.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio dei candidati mirati al polmone, basata su correlazioni morfometrico-funzionali validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche chirurgiche murine, inclusa la pneumonectomia e l'impianto di protesi.
- È dipendente da tubi di gonfiaggio personalizzati e da attrezzature di fissazione per garantire un'espansione e una fissazione polmonare costante.
- Necessita di un processo istologico standardizzato e di acquisizione di immagini in campo chiaro a 20x per l'analisi del MLI.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di chirurgia, istologia e analisi delle immagini per ottenere risultati riproducibili.
- Limitato ai modelli murini; l'adattamento ad altre specie richiederebbe la validazione delle dimensioni della protesi e dei parametri di gonfiaggio.
