Un metodo standardizzato per la misurazione della superficie interna polmonare tramite la polmonite e l'impianto di protesi

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare con precisione la superficie interna di un polmone di topo dopo la pneumectomia e l'impianto di protesi. Questo metodo aiuta ad analizzare le funzioni morfologiche e fisiologiche del polmone nella rigenerazione polmonare adulta indotta dalla forza meccanica. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di quantificare con precisione la superficie polmonare interna, il che promette di aumentare l'affidabilità e la riproducibilità dello stato di funzionalità polmonare.

Preparare il topo per l'intervento chirurgico su una piattaforma di intubazione con il lato ventrale accessibile. Quindi estrarre la lingua e ispezionare le corde vocali con un laringoscopio per piccoli animali compatibile con i cateteri guida. Quindi inserire delicatamente una cannula per intubazione endovenosa calibro 20 nella trachea con un angolo interno.

Quindi, metti il mouse in posizione sdraiata laterale destra e collega la cannula a un ventilatore meccanico. Osservare il torace per giudicare l'inserimento della cannula nella trachea. Impostare la pressione inspiratoria a 12 centimetri di acqua e impostare la frequenza respiratoria a 120 respiri al minuto.

Ora, pulisci la pelle esposta con almeno tre scrub alternati di Betadine ed etanolo al 70%. Quindi iniziare l'intervento con un'incisione toracotomica posterolaterale di due o tre centimetri nel quinto spazio intercostale. Penetrare la muscolatura utilizzando le forbici a molla Noyes.

Successivamente, praticare un'incisione di 1,5 centimetri per esporre il polmone sinistro. Se necessario durante l'intervento chirurgico, utilizzare un cauterizzatore ad alta temperatura per fermare l'emorragia. Quindi, sollevare 1/3 del lobo polmonare sinistro dal torace con una pinza a punta smussata e utilizzare un batuffolo di cotone per estrarre l'intero polmone sinistro.

Ora, identifica l'arteria polmonare e i bronchi del lobo polmonare sinistro e lega strettamente i bronchi e i vasi all'ilo con una sutura chirurgica imbevuta. Successivamente, tagliare il lobo polmonare sinistro a tre o quattro millimetri dalla legatura, facendo attenzione a non tagliare la sutura, che potrebbe provocare lo pneumotorace. Quindi, chiudere la parete toracica con una sutura.

Quindi, cucire lo strato muscolare e lo strato cutaneo in sequenza, utilizzando da cinque a sei suture interrotte con spazi di tre o quattro millimetri. Assicurati di tenere l'ago da sutura chirurgico lontano dal cuore. La puntura cardiaca è letale.

Infine, disinfettare l'area chirurgica con iodio povidone. Quindi, posiziona il mouse su un pad termico a 38 gradi Celsius. Continuare a utilizzare il ventilatore fino a quando non ritorna la respirazione spontanea.

Eseguire l'operazione precedentemente descritta, ma subito dopo aver rimosso il polmone, prepararsi a inserire la protesi. Usando una pinza smussata, afferrare il centro della protesi in silicone ellissoide. Successivamente, tenendo la costola con una pinza per esporre la cavità toracica, inserire molto delicatamente la protesi.

Entrare con un angolo di 45 gradi tra il piano frontale della protesi e la superficie toracica. Utilizzando una pinza smussata, assicurarsi che la protesi sia completamente all'interno della cavità toracica vuota sinistra. Ora chiudi il torace e monitora il mouse come descritto in precedenza.

Per questa procedura, assemblare un tubo di gonfiaggio personalizzato costituito da uno stantuffo rimosso da una pipetta sierologica da 10 millilitri, un tubo flessibile lungo 40 centimetri con un adattatore per ago, una valvola di controllo della portata e un ago da 18 gauge. Una volta assemblata, fissare la pipetta a una credenza con del nastro adesivo. La distanza tra la parte superiore della pipetta e il banco deve essere di almeno 30 centimetri.

Dopo aver soppresso il topo con iniezione di anestetico, fissarlo a una tavola sterilizzata e aprire con cura il torace per tagliare lo sterno ed esporre i lobi polmonari. Quindi, esporre la trachea. Quindi, riempi il tubo di gonfiaggio con PFA al 4% appena fatto e rimuovi tutte le bolle dal tubo.

Quindi, inserire l'ago nella trachea. Per evitare perdite, tagliare la trachea con clip per vasi. Ora, gonfiare il polmone con il fissativo a una pressione transpolmonare costante di 25 centimetri di acqua.

Incubare i polmoni a temperatura ambiente per due ore per una completa espansione. Dopo il gonfiaggio, prendere nota dello spostamento di volume del fissativo. Ora, legare la trachea e sezionare delicatamente i polmoni intatti dai tessuti connettivi circostanti.

Usa le forbici e sii molto gentile. Successivamente, incubare i polmoni in una provetta conica da 50 millilitri riempita con il 4% di PFA per 12 ore a quattro gradi Celsius agitando delicatamente su uno shaker. Procedere quindi con la lavorazione e la colorazione come descritto nel protocollo di testo.

Per quantificare l'MLI, utilizzare le immagini dell'agente utilizzato nelle sezioni raccolte in campo chiaro con ingrandimento 20x. Da tre diverse sezioni polmonari, selezionare casualmente un totale di 15 viste non sovrapposte, ciascuna di circa un millimetro quadrato, e quindi ventilarle. Utilizzare solo aree prive di arterie e vene, vie aeree principali o dotti alveolari.

Per l'analisi, disegna una griglia 10 per 10 su ogni area selezionata utilizzando uno strumento righello. Le linee della griglia sono quindi distanti circa 100 micron l'una dall'altra. Quindi, per trovare un'intercetta lungo la linea come la lunghezza tra due epiteli alveolari adiacenti.

Ad esempio, le frecce a due punte illustrano le lunghezze. Contando tutte queste lunghezze lungo ogni linea della griglia, l'MLI è il valore medio delle lunghezze di intercettazione. Utilizzando i protocolli descritti, i topi trattati con PNX sono stati confrontati con topi impiantati con protesi.

I topi utilizzati erano maschi CD-1 di otto settimane e i loro lobi polmonari sinistri sono stati resecati. La protesi imita le dimensioni e la forma del lobo polmonare sinistro ed è stata inserita nel torace dopo la rimozione del lobo polmonare sinistro. 14 giorni dopo l'intervento, è stato utilizzato un tubo di gonfiaggio su misura per determinare il volume interno del polmone destro rimanente.

Il volume medio del polmone destro nei cinque topi trattati con PNX era di circa 1,4 millilitri, che era significativamente maggiore, 1,05 millilitri per i cinque topi impiantati con protesi. Anche i valori di MLI nei restanti polmoni destri erano significativamente maggiori. Utilizzando questi parametri, è stata calcolata la superficie polmonare interna ed è risultata significativamente più piccola nei topi impiantati con protesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come calcolare l'area della superficie polmonare interna per il modello murino di rigenerazione alveolare indotta dalla forza meccanica.