Name: Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dallintero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Scopri la vitrificazione ad ago immerso per la crioconservazione di testicoli interi di zebrafish. Questo metodo semplifica l'isolamento delle cellule germinali per la biologia riproduttiva.

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Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d'Ungheria (grant 116912 a MÀY), l'ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati il diritto ungherese del benessere animale.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Soluzioni di riserva<ol>
<li>Preparare 1 M trealosio aggiungendo 0,378 g di trealosio diidrato in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare 1 M saccarosio aggiungendo 0,342 g di saccarosio in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare 1 M HEPES aggiungendo 0,238 g di HEPES a 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.</li>
		<li>Preparare della collagenosi 20 mg/mL (290 U/mg) con l'aggiunta di 100 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare la tripsina 15mg/mL (~ 10000 U/mg) con l'aggiunta di 75 mg per 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare 1 mg/mL dnasi I (~ 3000 U/mg) con l'aggiunta di 5 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparare 0,4% trypan blu aggiungendo 40 mg di trypan blu a 10 mL di PBS. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 1 mL in provette da 1,5 mL.</li>
		<li>Preparare 200 mg/L MS-222 (tricaina solfonato di metano) con l'aggiunta di 200 mg di MS-222 in 1 L di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente. Inoltre, soluzione tampone il MS-222 con bicarbonato di sodio per un pH neutro di 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni per la vitrificazione<ol>
<li>Preparare la soluzione di equilibrazione (ES): preparare 2 mL di ES mescolando 121,5 µ l di metanolo (MeOH; 1,5 M), 220 µ l di glicole propilenico (PG; 1,5 M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di soluzione madre HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l di L-15 in un 2 tubo da mL.</li>
		<li>Preparare la soluzione di vitrificazione (VS): preparare 2 mL di VS mescolando 439 µ l di PG (3 M), 426 µ l di solfossido dimetilico (Me2così; 3M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di HEPES stock soluzione (25 mM) e 685 µ l di L-15 in un provetta da 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzioni per il riscaldamento<ol>
<li>Preparare la soluzione di riscaldamento 1 (WS1): preparare 1,5 mL di WS1 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 450 µ l di soluzione madre di saccarosio (3 M) e 900 µ l di L-15.</li>
		<li>Preparare soluzione scaldavivande 2 (WS2): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 150 µ l di soluzione madre di saccarosio (1 M) e 1200 µ l di L-15.</li>
		<li>Preparare la soluzione di riscaldamento 3 (WS3): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL di miscelazione 150 µ l di FBS (10%) e 1350 µ l di L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di digestione: per ogni campione preparare 500 µ l della soluzione digestione mescolando 50 µ l di soluzione madre di collagenasi (2 mg/mL), 50 µ l di soluzione madre di tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l di dnasi I (20 µ g/mL) e 390 µ l di L-15 in un mL 2 tubo.</li>
	<li>Ottenere strumenti di dissezione: forbici, microforbici, pinzette, Pinzette curve e aghi per agopuntura.</li>
</ol>2. testicoli collezione
<ol><li>Eutanasia il pesce mettendolo in un piatto contenente 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Prima di continuare con la dissezione, assicurarsi che le branchie hanno smesso di muoversi e che almeno 10 minuti sono passati da quel momento per garantire la morte da ipossia.</li>
	<li>Asciugate il pesce da pacche su un tovagliolo di carta e posizionarlo sul lato dorsale su una stuoia di dissezione.<ol>
<li>In primo luogo tagliare le pinne pettorali e pelviche per dissezione più facile.</li>
		<li>Orizzontalmente snip la pelle sul ventre del pesce tra le pinne pettorali e tagliare la pelle e il muscolo di fondo lungo il ventre fino alla pinna anale.</li>
		<li>Aprire la cavità del corpo del pesce e il pin la parete del corpo sinistra e destra al tappeto di dissezione con aghi. Nota: I testicoli si trovano sopra gli organi gastrointestinali su entrambi i lati della vescica natatoria (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per evitare la contaminazione, non estrarre gli organi gastrointestinali, ma delicatamente spingerle verso un lato e rimuovere il testicolo dal lato avversario. Testicoli sono collegati alla parete del corpo quindi rimuoverli con attenzione e tagliare il collegamento peritoneo di microforbici.</li>
	<li>Inoltre, al fine di prevenire la contaminazione, in primo luogo sterilizzare i testicoli da metterli in etanolo al 70% per 2 s e quindi posto loro in L-15 su una piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio. Nota: Se è necessario, testicoli puliti dal tessuto adiposo e grandi vasi precisamente sotto lo stereomicroscopio sanguigni</li>
</ol>3. ultra-rapido raffreddamento del tessuto testicolare
<ol><li>Aghi di Mark con etichette appropriate a seconda del campione digitare e preparano l'equilibrazione (ES) e soluzioni di vitrificazione (VS).</li>
	<li>Trasferire i testicoli in una piastra ben più grande o piatto e perno a due testicoli (o più a seconda delle dimensioni dell'ago) su un ago di agopuntura sterili.<ol>
<li>In primo luogo posizione del testicolo in cima curve pinzette. Mettere la punta dell'ago nel mezzo del testicolo e tirare verso l'alto il testicolo con le pinzette.</li>
		<li>Dopo perforazione del testicolo, tirarlo delicatamente verso l'alto verso la parte superiore dell'ago. Assicurarsi che i testicoli sono separati gli uni dagli altri e che non vengano a cadere o scivolare giù.</li>
		<li>Luogo pieno di aghi con i testicoli appuntati in una provetta da 2 mL con L-15 fino a vetrificazione (a 25 ˚ c; tempo di conservazione non deve superare 1 h). Nota: Pinning i testicoli dell'ago dovrebbe essere fatto velocemente per evitare i testicoli dall'asciugarsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire l'ago con i testicoli in soluzione di equilibrazione e incubare per 5 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Trasferire l'ago nella soluzione di vitrificazione e incubare per 30 s a 25 ˚ c.</li>
	<li>Rimuovere l'ago dalla soluzione di vitrificazione, rapidamente e delicatamente assorbire la soluzione rimanente dal tessuto di un tovagliolo di carta sterile. Usare cautela per evitare i testicoli che attacca per il tovagliolo di carta o cadere.</li>
	<li>Inserire rapidamente l'ago nell'azoto liquido, posizionato in una scatola di polistirolo. Nota: Fare questo passo rapidamente per evitare l'esposizione del tessuto per il vapore di azoto liquido. Utilizzare volumi bassi di azoto liquido per evitare la contaminazione incrociata dei campioni.</li>
	<li>Tenere l'ago in azoto liquido in una scatola di polistirolo chiusa per 5-10 min.</li>
	<li>Preraffreddare un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA aperto 4,5 mL e il tappo nella stessa casella.</li>
	<li>Dopo 5-10 min, trasferire ogni ago in un separato stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sotto la superficie dell'azoto liquido e chiudere lo stoccaggio provette criogenia. Attenzione: Utilizzare sempre abbigliamento protettivo (quali guanti isolanti) quando lavorare con azoto liquido come esposizione può portare a gravi congelamenti.</li>
	<li>Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA su una canna di metallo e posizionarlo nel sebatoio criobanca velocemente come possibile. Conservare i campioni in un deposito di contenitore dewar fino all'ulteriore utilizzo.</li>
</ol>4. procedura di riscaldamento
<ol><li>Riscaldare ogni ago separatamente. Tutte le soluzioni di riscaldamento dovrebbero essere a 25 ° C.</li>
	<li>Staccare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA dalla canna in metallo e immergerlo nell'azoto liquido memorizzato in una scatola di polistirolo.</li>
	<li>Aprire lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nel vapore di azoto liquido (utilizzando forcipe) e rilasciare l'ago nell'azoto liquido.</li>
	<li>Trasferire l'ago molto veloce nella prima soluzione di riscaldamento e incubare per 1 min (a 25 ° C). Assicurarsi di trasferire l'ago rapidamente per evitare il suo riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.</li>
	<li>Trasferire l'ago nella seconda soluzione scaldavivande e incubare per 3 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Trasferire l'ago nella terza soluzione scaldavivande e incubare per 5 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Rilasciare i testicoli dall'ago di facendole scorrere verso il basso con una pinzetta curva. Luogo ogni testicolo riscaldato individualmente in un pozzo separato (piastra a 96 pozzetti) riempito con 250 µ l di L-15 supplementato con 10% FBS. Assicurarsi che i pozzi sono etichettati secondo il campione. Tenere la piastra ben su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono riscaldati e fino ad ulteriore lavoro.</li>
</ol>5. tessuto digestione
<ol><li>Preparare 500 µ l di soluzione di dissociazione per ciascun campione in provette separate da 2 mL. Etichettare le provette secondo il codice del campione. Incubare la soluzione preparata dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere il tessuto riscaldato nella soluzione di digestione e tagliarlo in piccoli pezzi da almeno 30 movimenti di piccole forbici.</li>
	<li>Incubare il tessuto tagliato su una piastra di agitazione per 90 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Interrompere il processo di digestione aggiungendo 400 µ l di L-15 e 100 µ l di FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitare bene la soluzione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtrare la soluzione ottenuta attraverso 50 µm filtri in una provetta da 1,5 mL. Etichettare le provette di conseguenza.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione filtrata a 200 × g per 10 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 20 µ l di L15 supplementato con 10% FBS. Agitare manualmente il tubo fino a che il pellet sia completamente disciolta. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° c fino al successivo utilizzo.</li>
</ol>6. valutazione vitalità e conta cellulare
<ol><li>Mix 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4% in una provetta PCR adeguatamente etichettata 0,2 mL. Se vengono utilizzati diversi volumi, assicurarsi che il rapporto di diluizione di 1:1 rimane.</li>
	<li>Incubare la sospensione per 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Verifica la fattibilità di ogni campione in un emocitometro sotto il microscopio.</li>
	<li>Contare il numero di cellule vive (senza macchia di tripan blu) in 15 campi. Calcolare il numero totale di cellule in 20 µm della sospensione delle cellule. La sospensione è ora pronta per qualsiasi applicazione a valle. Nota: Quando si ottimizza la procedura per le altre specie con corpo più grande, utilizzare frammenti di testicolo di uguale peso. Utilizzare testicoli da un individuo per tutti i gruppi sperimentali al fine di evitare la variabilità individuale nei risultati. Nel caso di zebrafish, abbiamo approfittato del fatto che sinistra e testicolo di destra deve contenere un numero pari (o molto simile) di cellule germinali13 (vedere i risultati di rappresentante). Il testicolo di sinistra è stato mantenuto come controllo mentre il testicolo di destra era vetrificato/riscaldati. Percentuale di redditività è stato calcolato il numero di cellule isolate dal testicolo vetrificato/riscaldato rispetto al numero di cellule isolate dal testicolo fresco.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
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<li>Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells%2C+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li>
<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish...

Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l'archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazione offre molti vantaggi come estensione della stagione riproduttiva, aggira la necessità per la manutenzione continua dei riproduttori, ed è più costo - e Labor-efficiente2.
Protocolli per la crioconservazione di spermatozoi sviluppato durante il passato parecchi anni2,3,4 offrono la possibilità di successo deposito di materiale genetico maschile di zebrafish. Tuttavia, la crioconservazione degli ovuli o embrioni di pesce non è ancora possibile grazie alla loro struttura complessa e di grandi quantità di materiale di tuorlo. Recentemente, la pratica del trapianto di cellule primordiali germinali (PGC) o cellule staminali spermatogoniali (SSCs) offre un bypass per questa barriera di svilupparsi dopo trapianto5in funzionali degli spermatozoi e uova. Crioconservazione delle CSS offre quindi una nuova frontiera nella conservazione delle risorse genetiche rare e preziose.
Anche se crioconservazione offre molti vantaggi, il processo di congelamento lento-tasso genera diverse condizioni che possono portare a cella danno2. Questi includono la formazione di ghiaccio intracellulare ed extracellulare, disidratazione, tossicità crioprotettore e altri. Ghiaccio intracellulare danneggia le cellule, ghiaccio extracellulare può portare a frantumazione meccanica delle cellule, mentre la diffusione dell'acqua dalle cellule durante il congelamento lento-tasso può condurre a disidratazione6. Recentemente, vetrificazione come una tecnica che impedisce gli effetti negativi della formazione di ghiaccio è stata applicata nella crioconservazione di gameti di pesce7,8,9. Esso presenta una tecnica di raffreddamento ultra-rapida attraverso il quale i mezzi di comunicazione interne ed esterne trasformare in uno stato amorfo/vetroso senza cristallizzazione in ghiaccio7,10. Vetrificazione successo del tessuto testicolare e ovarico è stata provata in specie di uccelli e mammiferi10,11,12, aprendo così la possibilità per la sua applicazione in pesce, pure.
In questo studio, presentiamo la procedura di vitrificazione (NIV) ago immerso per la crioconservazione di zebrafish tutta i testicoli. Dimostriamo un metodo affidabile per l'isolamento di cellule germinali di zebrafish fase iniziale senza contaminazione e un processo di crioconservazione che produce quantità elevate relativamente precoce delle cellule di germe con una bassa presenza di altre cellule, soprattutto gli spermatozoi. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio a dimostrare un protocollo dettagliato visualizzato in quel momento per ultra-rapido raffreddamento del tessuto gonadico pesce e cellule germinali zebrafish. Inoltre, è evidenziato la ripetibilità del metodo in cinque differenti zebrafish ceppi: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Integrato con L-glutammina</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metansolfonato (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Metanolo Diidrato</td></tr><tr><td></td><td>Reanale</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Glicole propilenico</td><td>Reanale</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Reanale</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Compresse per la preparazione di 200 ml di soluzione PBS</td></tr></tbody></table>

crioconservazione degli spermatogoni di zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ' immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l'esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.

In media, il numero delle cellule di germe iniziale isolato da un testicolo singolo zebrafish fresco variava tra 40.000 e 200.000 cellule a seconda delle dimensioni del pesce. Quando nei testicoli di zebrafish fresco in tutti i 5 ceppi di digestione, cellule germinali primi non erano sola cellule presenti nelle sospensioni delle cellule (Figura 2). Al lato delle cellule di germe iniziale, numerosi gli spermatozoi sono stati trovati pure. D'altra parte, c'eran...

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

La criopreservazione offre la possibilità di mantenere cellule e tessuti vivi a basse temperature per un periodo di tempo infinito, almeno in termini umani. La vitrificazione è una forma di criopreservazione che prevede un raffreddamento ultra-rapido fino a uno stato vetreo, amorfo, senza la formazione di ghiaccio cristallino e senza i danni ad esso associati. In questo video, presentiamo il protocollo per la vitrificazione di testicoli interi di pesce zebra, che ne consente l'immagazzinamento sicuro in attesa del loro successivo utilizzo come fonte di cellule germinali per il trapianto in riceventi idonei.L'attuale protocollo di vitrificazione presenta un vantaggio significativo rispetto ai protocolli di congelamento lento per quanto riguarda le manipolazioni delle cellule staminali germinali. E cioè che, dopo la vitrificazione e il riscaldamento, gli spermatozoi muoiono e vengono eliminati, pertanto non sono presenti nella sospensione cellulare. Di conseguenza, non è necessaria l'isolazione delle cellule germinali dopo il riscaldamento.E ciò facilita agevolmente le manipolazioni a valle. Eutanasia il pesce ponendolo in una capsula contenente 200 milligrammi per litro di MS-222 a pH 7. Prima di proseguire con la dissezione, accertarsi che le branchie abbiano cessato di muoversi e che siano trascorsi almeno 10 minuti da quel momento per garantire la morte per ipossia.Asciugare il pesce tamponandolo con un tovagliolo di carta e posizionarlo sul lato dorsale su un vassoio per dissezione. Per prima cosa, rimuovere le pinne pelviche e pettorali per facilitare la dissezione. Tagliare orizzontalmente la pelle sul ventre del pesce tra le pinne pettorali e proseguire il taglio attraverso la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre fino alla pinna anale.Aprire la cavità corporea del pesce e fissare con degli aghi la parete laterale sinistra e destra al tappetino da dissezione. I testicoli si trovano al di sopra degli organi gastrointestinali su entrambi i lati della vescica natatoria. Per evitare contaminazioni, non rimuovere gli organi gastrointestinali, ma spostarli delicatamente da un lato ed estrarre i testicoli dal lato opposto.I testicoli sono collegati alla parete corporea, quindi vanno rimossi con attenzione e il peritoneo di collegamento va reciso con forbici microchirurgiche. Inoltre, per prevenire contaminazioni, sterilizzare prima i testicoli immergendoli in etanolo al 70% per due secondi, quindi posizionarli in L-15 su una piastra a 96 pozzetti posta sul ghiaccio. Contrassegnare gli aghi con etichette appropriate, in base al tipo di campione, e preparare le soluzioni di equilibrazione e di vitrificazione.Trasferire i testicoli in una piastra o in una capsula di dimensioni maggiori e fissare tre testicoli o più, a seconda delle dimensioni dell'ago, su un ago sterile per agopuntura. Posizionare innanzitutto i testicoli sopra una pinzetta curva. Inserire la punta dell'ago al centro del testicolo e tirare con attenzione il testicolo verso l'alto utilizzando la pinzetta.Dopo aver forato il testicolo, tirarlo delicatamente verso l'alto, in direzione della punta dell'ago. Assicurarsi che i testicoli siano separati l'uno dall'altro e che non cadano o scivolino verso il basso. Posizionare gli aghi con i testicoli fissati in una provetta Eppendorf Tubulator contenente L-15 fino alla vitrificazione a 25 gradi.Il tempo di conservazione non deve superare un'ora. Trasferire l'ago con i testicoli nella soluzione di equilibrazione e incubare per cinque minuti a 25 gradi. Trasferire l'ago nella soluzione di vitrificazione e incubare per 30 secondi a 25 gradi.Rimuovere l'ago dalla soluzione di vitrificazione. Assorbire rapidamente e delicatamente la soluzione residua dal tessuto utilizzando un tovagliolo di carta sterile. Prestare attenzione per evitare che i testicoli aderiscano al tovagliolo di carta o cadano.Inserire rapidamente l'ago nell'azoto liquido contenuto in una scatola di polistirolo. Mantenere l'ago nell'azoto liquido all'interno di una scatola di polistirolo chiusa per cinque-dieci minuti. Raffreddare preventivamente un cryotubo da 4,5 millilitri aperto e il suo tappo nella stessa scatola.Dopo cinque-dieci minuti, trasferire ogni ago in un cryotubo separato sotto la superficie dell'azoto liquido e chiudere il cryotubo. Posizionare il cryotubo su una bacchetta metallica e inserirlo nel contenitore del criobanca il più rapidamente possibile. Conservare i campioni in un cassetto di stoccaggio del contenitore fino all'uso successivo.Riscaldare ogni ago separatamente. Tutte le soluzioni di riscaldamento devono essere a 25 gradi. Staccare il criotubo dalla canna metallica ed immergerlo nell'azoto liquido conservato in una scatola di polistirolo.Aprire il cryotubo nel vapore di azoto liquido utilizzando pinzette ed immergere l'ago nell'azoto liquido. Trasferire rapidamente l'ago nella prima soluzione di riscaldamento ed incubare per un minuto. Assicurarsi di trasferire l'ago rapidamente per evitare che si riscaldi nell'aria durante il trasferimento.Trasferire l'ago nella seconda soluzione di riscaldamento e incubare per tre minuti. Trasferire l'ago nella terza soluzione di riscaldamento e incubare per cinque minuti. Rilasciare i testicoli dall'ago facendoli scivolare verso il basso con pinzette curve.Posizionare ciascun testicolo riscaldato singolarmente in un pozzetto separato contenente 250 microlitri di L-15, integrato con 10%FPS. Assicurarsi che i pozzetti siano etichettati in base al campione. Mantenere la piastra su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati riscaldati e fino a ulteriori lavorazioni.Preparare 500 microlitri di soluzione di dissociazione per ogni campione in provette separate da due millilitri. Etichettare le provette in base al codice del campione. Incubare la soluzione di dissociazione preparata per cinque minuti a temperatura ambiente.Aggiungere il tessuto riscaldato alla soluzione di digestione e tagliarlo in piccoli pezzi eseguendo almeno 30 movimenti con forbici piccole. Incubare il tessuto su una piastra agitata per 90 minuti a 24 gradi. Arrestare il processo di digestione aggiungendo 400 microlitri di L-15 e 100 microlitri di FCS al 10%.Agitare brevemente la soluzione e incubare per un minuto a temperatura ambiente. Filtrare la soluzione ottenuta attraverso filtri da 50 micron in un tubo da 1,5 millilitro. Etichettare i tubi di conseguenza.Centrifugare la soluzione filtrata a 200 G per 10 minuti a 25 gradi. Rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in 20 microlitri di L-15, integrato con 10% FPS. Agitare manualmente il tubo finché il pellet non si è completamente disciolto.Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio o a quattro gradi fino all'ulteriore utilizzo. Mescolare cinque microlitri di sospensione cellulare e cinque microlitri di soluzione di blu di tripano al 0,4% in un tubo PCR da 0,2 millilitri opportunamente etichettato. Se si utilizzano volumi diversi, assicurarsi che il rapporto di diluizione uno a uno rimanga invariato.Incubare questa sospensione per uno-tre minuti a 25 gradi. Verificare la vitalità di ogni campione mediante emocitometro al microscopio. Contare il numero di cellule vive non colorate dal blu di tripano in 15 campi.Calcolare il numero totale di cellule in 20 microlitri della sospensione cellulare. La sospensione è ora pronta per qualsiasi applicazione successiva. In media, il numero di cellule germinali in stadio iniziale isolate da un singolo testicolo di pesce zebra fresco varia tra 40.000 e 200.000 cellule, a seconda delle dimensioni del pesce.In tutte le linee di zebrafish utilizzate in questo studio, il protocollo di vitrificazione attuale ha prodotto tassi di vitalità medi del 50% e superiori. Ciò indica una buona vitalità e ripetibilità del protocollo presentato. Durante la digestione delle testicole di zebrafish fresche in tutti e cinque i ceppi, oltre alle cellule germinali in stadio precoce, sono stati rinvenuti anche numerosi spermatozoi.Dopo la digestione di testicoli criopreservati, erano presenti molti meno spermatozoi, indicando che questi non sopravvivono a questo protocollo di vitrificazione e che probabilmente vengono eliminati durante il processo di digestione. Il protocollo di vitrificazione con ago immerso presentato in questo studio offre diversi vantaggi nella criopreservazione di frammenti testicolari. In primo luogo, diversi frammenti possono essere fissati a un unico ago, consentendo quindi un'esposizione simultanea agli agenti crioprotettivi e all'azoto liquido.Inoltre, questo metodo consente che quantità molto ridotte di crioprotettanti vengano associate ai frammenti di tessuto. Di conseguenza, le velocità di raffreddamento e riscaldamento possono essere più elevate. Un vantaggio significativo è che gli spermatozoi non sopravvivono a questo protocollo e, pertanto, alla fine le sospensioni cellulari risultano arricchite in spermatogoni, il che faciliterà le applicazioni successive.Ma una cosa che deve essere presa in considerazione è la possibilità di contaminazione incrociata attraverso l'azoto. Pertanto, quando si utilizza questo metodo, l'azoto liquido non deve essere riutilizzato.

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Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Questo è un metodo per la generazione di embrioni di zebrafish gynogenetic diploide (embrioni il cui unico contributo genetico proviene dalla madre), bloccando la seconda divisione meiotica subito dopo la fecondazione con luce ultravioletta-inattivato sperma. Embrioni EP non sono completamente omozigoti per ricombinazione durante la prima divisione meiotica, tuttavia sono omozigoti a tutti i loci che non sono stati separati dalle loro centromero dalla ricombinazione.

Fare Diploide Zebrafish Gynogenetic di Pressure presto

In questo video, descriviamo la procedura per la vitrificazione degli embrioni di coniglio raccolti allo stadio di sviluppo desiderato utilizzando glicole etilenico e dimetilsolfossido come crioprotettori e paglia criogenica come sistema di trasporto. Gli embrioni vitrificati hanno un alto tasso di sopravvivenza e possono essere conservati per un periodo prolungato fino all'uso.

Vitrificazione di embrioni di coniglio con paglia criogenica: una tecnica di raffreddamento ultrarapido per conservare embrioni di coniglio per la conservazione a lungo termine

Il pesce zebra è un potente sistema modello per la biologia dello sviluppo e la ricerca sulle malattie umane grazie alla loro somiglianza genetica con i vertebrati superiori. Questo protocollo descrive una metodologia per creare embrioni aploidi di zebrafish che possono essere utilizzati per strategie di screening in avanti per identificare mutazioni recessive in geni essenziali per l'embriogenesi precoce.

Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

L'uso del pesce zebra per la ricerca cardiovascolare si sta espandendo verso la ricerca sui cuori adulti. Per queste applicazioni, l'isolamento rapido e semplice dei tessuti cardiaci è fondamentale per evitare modifiche post-mortem e per ottenere un numero adeguato di campioni. Qui, descriviamo un metodo rapido e riproducibile per sezionare i cuori di pesce zebra adulto.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Il campionamento ripetuto del sangue è necessario e importante nella ricerca sugli animali. Abbiamo sviluppato un metodo innovativo, non letale e affidabile per la raccolta ripetuta del sangue da pesci zebra adulti e abbiamo applicato questo metodo allo studio della biochimica del sangue, compreso il metabolismo del glucosio.

Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti

Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.

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Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

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Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.

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Qui presentiamo un metodo semplice per separare le cellule follicolari e gli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish, che faciliterà le indagini sullo sviluppo ovarico nel pesce zebra.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Scopri la vitrificazione ad ago immerso per la crioconservazione di testicoli interi di zebrafish. Questo metodo semplifica l'isolamento delle cellule germinali per la biologia riproduttiva.

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

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