Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la funzione genica delle larve di zanzara, utilizzando un densovirus ricombinante della zanzara come vettore genico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei sistemi di somministrazione virale, ad esempio su come superare le barriere extracellulari e intracellulari associate. I principali vantaggi di queste tecniche sono la facilità di manipolazione, l'elevata efficienza di trasduzione, l'espressione a lungo termine e robusta, e la capacità di produrre effetti persistenti in vivo.

Questo lavoro ha dimostrato che specifiche piccole RNA o geni bersaglio possono essere sovraespressi o silenziati nelle larve di zanzara, utilizzando il sistema di somministrazione basato su densovirus qui sviluppato. Le implicazioni di questa tecnica ampliano le applicazioni della strategia di espressione descritta per lo studio della biologia delle zanzare, poiché questo metodo consente transduzioni semplici delle larve. La procedura sarà dimostrata da Pei-Wen Liu, un dottorando del nostro laboratorio.

Iniziare ordinando la sintesi chimica di sequenze di cDNA a lunghezza intera per le miRNA precursori, le spugne per miRNA e l'shRNA, come descritto nel protocollo testuale allegato. Dopo aver ricevuto il DNA ordinato, centrifugare le provette contenenti i blocchi di DNA per assicurarsi che tutto il DNA essiccato si trovi sul fondo della provetta. Successivamente, risospendere il DNA in acqua priva di DNasi per ottenere una concentrazione finale di 10 nanogrammi per microlitro.

Aggiungere sei microlitri di XbaI per digerire il plasmide e le sequenze di cDNA, quindi incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, de-fosforilare le estremità 5' del plasmide linearizzato con fosfatasi alcalina intestinale di vitello, seguendo le istruzioni del produttore. Per un efficiente confezionamento, la dimensione del genoma non deve superare i 4.400 nucleotidi, pari al 110% della lunghezza del genoma del densovirus di zanzara di tipo selvatico, oppure possono essere introdotti nel genoma di Aedes aegypti soltanto costrutti contenenti microRNA intronici di non più di 400 nucleotidi.

Successivamente, inattivare la fosfatasi alcalina a 65 gradi Celsius. Quindi, eseguire il DNA su un gel di agarosio all'1% e tagliare il vettore linearizzato. Estrarre il DNA dal frammento di gel utilizzando un kit di estrazione da gel, seguendo le istruzioni del produttore.

Dopo l'estrazione, legare il frammento di DNA nel vettore utilizzando la DNA ligasi T4. Successivamente, utilizzare il trattamento termico per trasformare i prodotti della reazione di ligazione in cellule competenti di E.coli DH5-alpha. Seminare i batteri trasformati su una piastra di agar LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Il giorno successivo, selezionare una singola colonia dalla piastra e preparare una coltura di preinoculo utilizzando tre millilitri di mezzo arricchito contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Infine, estrarre il DNA plasmidico dalla coltura batterica utilizzando un kit di miniprep, seguendo le istruzioni del produttore. Inviare un campione del DNA a una società di sequenziamento del DNA per la verifica.

Clonare il pre-miRNA o lo shRNA nel sito HpaI della regione codificante NS1 di AaeDV all'interno del vettore plasmidico pUCA, utilizzando i metodi descritti per la cassetta espressiva intronica artificiale di piccoli RNA. Invece di utilizzare cellule DH5-alpha, trasformare il DNA in cellule competenti Stbl3 di E.coli. Successivamente, piastrare le cellule trasformate su una piastra di agar LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina ed avviare una coltura preliminare da un clone positivo. Estratte quindi il plasmide rAaeDV dalle cellule batteriche, utilizzando un kit di maxiprep seguendo le istruzioni del produttore.

Al giorno zero, suddividere da 90 a 95% di confluenza di colture cellulari C6/36 da un flacone a due in 10 flaconi colturali T-25. Incubare i flaconi per 18-20 ore a 28 gradi Celsius fino a quando non raggiungono nuovamente una confluenza del 90-95%.

Al primo giorno, trasfettare le cellule con i plasmidi rAaeDV generati. Per eseguire questa procedura, diluire 10 microgrammi di DNA in 600 microlitri di mezzo RPMI-1640 e mescolare delicatamente la soluzione. Nel frattempo, preparare 600 microlitri di mezzo RPMI-1640 e 25 microlitri di reagente di trasfezione per ogni trasfezione.

Incubare le cellule con il DNA da cinque a dieci minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 625 microlitri della miscela del reagente di trasfezione RPMI-1640 alla miscela di DNA plasmidico e incubare questa miscela da 20 a 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con mezzo RPMI-1640 e quindi aggiungere la miscela di trasfezione a ciascuna delle provette di coltura T-25.

Incubare le cellule nel mix di trasfezione per sei ore a 28 gradi Celsius. Dopo sei ore, rimuovere il mezzo di trasfezione, lavare le cellule due volte con cinque millilitri di mezzo RPMI-1640 e quindi aggiungere mezzo RPMI-1640 fresco contenente il 10% di FBS. Cinque giorni dopo la trasfezione, utilizzare una pipetta di vetro da cinque millilitri per staccare e sospendere le cellule nelle piastre, aspirando e dispensando il mezzo di coltura più volte.

Trasferire le sospensioni cellulari da ogni fiala in un proprio tubo sterile da 50 millilitri. Per raccogliere un virus dipendente da una soglia elevata, è necessario mantenere le cellule per cinque giorni dopo la trasfezione. Congelare i tubi singolarmente a meno 80 gradi Celsius o in un bagno di ghiaccio secco ed etanolo per 30 minuti.

Quindi, scongelare rapidamente a 37 gradi Celsius ed eseguire il vortex della sospensione cellulare per un minuto. Successivamente, raccogliere il soprannatante dal campione centrifugato e scartare il pellet. Quindi, filtrare il soprannatante attraverso un filtro monouso da 0,22 micrometri montato su siringa.

Aliquotare e conservare le scorte finali di virioni purificati a meno 80 gradi Celsius. Lavare 100 larve di primo stadio di A. albopictus tre volte, utilizzando acqua deionizzata. Successivamente, trasferire le larve in un becher contenente 95 millilitri di acqua deionizzata.

Aggiungere cinque millilitri delle colture di rAaeDV e incubare le larve per 24 ore a 28 gradi Celsius. Per il successo dell'infezione larvale, è essenziale che le larve siano esposte alle particelle virali per un periodo di 24-36 ore al fine di garantire elevati tassi di infezione. Dopo l'incubazione, lavare le larve tre volte utilizzando acqua deionizzata, quindi trasferirle nuovamente nelle piastre. Nutrire le larve regolarmente. Monitorare il livello di espressione del gene bersaglio nelle larve mediante PCR quantitativa o western blot, utilizzando tecniche standard.

In questo esempio, 100 larve di primo stadio sono state analizzate per l'espressione endogena di miRNA dopo infezione con il virus ricombinante contenente il cassette di espressione aal-let-7, che mostra un'overespressione.

L'efficienza della costruzione anti-let-7 è mostrata a destra, evidenziandone le capacità di silenziamento. Per monitorare l'efficienza di silenziamento dell'mRNA della V-ATPasi mediata dai vettori rAaeDV, un totale di 100 larve di primo stadio è stato trattato con quantità uguali di rAaeDV di diversi tipi, aggiungendo il virus nell'acqua dell'habitat larvale. I livelli di mRNA della V-ATPasi sono stati notevolmente ridotti da un rAaeDV esprimente miRNA e da un rAaeDV esprimente shRNA intronico.

I nostri risultati confermano una strategia di espressione intronica che offre un nuovo paradigma, in grado di superare i limiti dei densovirus dei zanzare con genoma difettoso, consentendo un efficiente trasferimento di geni estranei nelle zanzare. Nel portare avanti questa procedura, è importante ricordare che un cassettino di espressione di microRNA intronico di non oltre 400 nt può essere inserito nel genoma del densovirus di Aedes aegypti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nella produzione di densovirus ricombinanti non difettosi che possano sovraesprimere o ridurre l'espressione di microRNA e dei geni bersaglio, al fine di esplorare l'analisi funzionale dei geni delle zanzare.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il sistema di somministrazione sviluppato del densovirus della zanzara per analizzare le funzioni geniche nelle larve di zanzara.