Name: Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara a mantenere zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia per programmi di controllo delle malattie. Questo protocollo fornisce linee essenziali per allevare colonie sane a 26°C e umidità 50-70%.

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Riconosciamo Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson e Clare Doig per il loro contributo allo sviluppo dei nostri metodi di manutenzione di Colonia e tre utenti anonimi per i suggerimenti che ci ha aiutato a migliorare il manoscritto. La nostra ricerca è supportata da un programma grant e la fellowship di AAH dal National Health e il Medical Research Council e una traduzione concedere dal Wellcome Trust. PAR è un destinatario di un australiano governo ricerca formazione programma di borsa di studio.

Alimentazione di sangue di zanzare su soggetti umani è stato approvato dall'Università di Melbourne Comitato etica umana (approvazione n.: 0723847). Tutti i volontari forniti informato consenso scritto.
1. larvale allevamento
Nota: Le zanzare sono tenute presso 26 ± 0,5 ° C e 50-70% di umidità relativa, con un fotoperiodo di 12:12 h (luce: scuro) per questo protocollo di manutenzione di Colonia. Queste condizioni sono simili alle condizioni climatiche media a Cairns, Australia e all'interno della gamma termica ottima per Ae. aegypti sopravvivenza e sviluppo44,45,46. Temperature elevate possono causare la perdita di Wolbachia infezioni da colonie di zanzare e dovrebbero essere evitato47. Manteniamo almeno 500 persone per popolazione per minimizzare la consanguineità; mantenimento di colonie di dimensioni inferiori può avere conseguenze di fitness [Ross et al. inedito]. Sotto queste condizioni e supponendo che una nutrizione adeguata, il tempo di generazione medio è di 28 giorni (Vedi tabella 1).
<ol><li>Immergere le uova sul substrato in vassoi (Figura 1A) contenente 3 L di acqua (acqua di osmosi inversa o acqua di rubinetto invecchiata, generato lasciando l'acqua del rubinetto in vassoi per 24 h prima dell'uso), ~ 300 mg di cibo per pesci (uno schiacciato tablet, Vedi Materiali tavolo) e un alcuni grani di lievito secco attivo per indurre la schiusa48.</li>
	<li>Un giorno dopo la schiusa, usare una pipetta di vetro per trasferire circa 500 larve ai vassoi contenenti 4 L di acqua (Figura 1B), conteggio utilizzando un contatore di clicker. Aggiungere due compresse di cibo di pesce schiacciato ogni vassoio. Se necessario, utilizzare contenitori di diverse dimensioni per l'allevamento di larve (Figura 1A), ma tieni larvale densità inferiori a 0,5 larve/mL per evitare sovraffollamento.</li>
	<li>Verifica i vassoi di ogni giorno per assicurare che le larve hanno cibo a sufficienza; aggiungere circa due compresse di cibo ai vassoi ogni due giorni. Fornire cibo ad libitum , ma garantire che 0,5 mg/larva/giorno è disponibile durante questo periodo per garantire sviluppo è sincrono e dimensione corporea è coerente, altrimenti possono essere confusi i risultati degli esperimenti (Vedi risultati rappresentante).</li>
	<li>Fare attenzione a evitare la sovralimentazione delle larve, particolarmente in contenitori più piccoli allevamento con acqua meno volume e superficie. Se l'acqua sembra nuvoloso o se non esiste una significativa mortalità larvale, sostituirlo con acqua fresca; mortalità deve essere trascurabile se le larve sono alimentate in modo ottimale.</li>
</ol>2. adulti emersione
Nota: Le larve cominceranno a pupate da cinque giorni dopo la schiusa, se ben nutriti e la maggior parte dovrebbe pupate di sette giorni dopo la schiusa. Gli adulti inizierà emergenti circa due giorni dopo l'impupamento, se mantenuta in modo ottimale a 26 ° C (Vedi Risultati rappresentante). Lo sviluppo larvale è tipicamente influenzato da Wolbachia infezioni quando un ampio è previsto il23,39,49.
<ol><li>Sette giorni dopo la schiusa versare l'intero contenuto del vassoio attraverso una maglia fine (poro formato 0,4 mm). Mantenere l'acqua filtrata larvale per un uso successivo in ovicups (Vedi sezione "Sangue alimentazione e deposizione delle uova"). Invertire la mesh e immergerlo in un recipiente di plastica con 200 mL di acqua per trasferire le pupe. Fornire cibo supplementare se qualsiasi larve rimangono.</li>
	<li>Preparare le gabbie di emersione adulto (Figura 1) fornendo due tazze di soluzione di saccarosio al 10% (Figura 1F) e due Coppe di ovatta umida per evitare il disseccamento (Figura 1E).</li>
	<li>Se non è necessario che le pupe essere filtrate per sesso, mettere i contenitori con coperchio di pupe nella gabbia e lasciare il coperchio leggermente aperta per permettere gli adulti ad emergere nella gabbia. In alternativa, posizionare un imbuto rovesciato sopra il contenitore per ridurre al minimo l'annegamento. Assicurarsi che tutti gli adulti sono emerse prima di rimuovere il contenitore dalla gabbia per impedire la selezione contro gli sviluppatori lenti.</li>
</ol>3. pupal sessaggio per esogamici
<ol><li>Se le pupe devono essere ordinati dal sesso (ad es., per esogamici), pipettare le pupe da vassoi larvale e separare i due sessi (Figura 2) in contenitori di plastica (Figura 1A) con 200 mL di acqua ogni 24 ore fino al numero desiderato di ciascun sesso è stato raggiunto. Mettere i coperchi sui contenitori e lasciarli chiusi.</li>
	<li>Gli adulti emergerà nei contenitori; confermare loro sesso prima di rilasciare in gabbie (Figura 2). Rimuovere eventuali adulti sessuati in modo non corretto con un aspiratore entro 24 h dalla emersione prima che raggiungano la maturità sessuale. Una volta che i sessi sono stati confermati, rilasciare gli adulti in gabbie ogni 24 ore.</li>
	<li>
Per ottenere Wolbachia-colonie infettate di un simile background genetico di una popolazione naturale, outcross aggiungendo Wolbachia-infettati femmine da colonie di laboratorio nelle gabbie dei maschi non infetti derivati da uova raccolte da ovitrap in il campo39, mantenendo la densità prescritta di 500 persone per popolazione.
	<ol>
<li>Ripetere l'esogamici per almeno tre generazioni successive per la produzione di colonie che sono almeno 87,5% simili geneticamente per la popolazione di campo39. Critico: Assicurarsi che i sessi siano corretti in questa fase (Vedi punto 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Femmina Ae. aegypti sono solitamente refrattari all'ulteriore inseminazione entro ore di accoppiamento50. Quando esogamici colonie, consentire le femmine e i maschi a maturare in gabbie separate per due giorni e quindi aspirare le femmine nella gabbia maschio di fornire pari opportunità a tutti i maschi.</li>
</ol>4. sangue alimentazione e deposizione delle uova
<ol><li>
Attendere almeno tre giorni dopo l'ultima femmina è emerso prima sangue alimentazione per consentire un ampio tempo per maturare. Sangue di nutrire le femmine entro due settimane dalla nascita per prevenire la mortalità eccessiva, in particolare per le zanzare con le infezioni di Wolbachia che influenzare negativamente la longevità22,24,49. Togliere le tazze di zucchero il giorno prima della poppata per migliorare i tassi di alimentazione.
	<ol>
<li>Chiedere ad un volontario per inserire loro avambraccio nella gabbia per consentire le zanzare femmina da sfamare. La maggior parte delle femmine dovrebbero nutrire di replezione entro 5 min, ma per ridurre la selezione contro lenti mangiatoie, lasciare l'avambraccio nella gabbia per 15 minuti, o fino a quando tutte le femmine sono visibilmente gonfie; un guanto di lattice per proteggere la mano da morsi è facoltativo ma consigliato.</li>
		<li>Due giorni dopo il pasto di sangue, posizionare due tazze di plastica contenente acqua di allevamento larvale e foderato con una striscia di carta vetrata (Figura 1) (o carta da filtro (Figura 1 H)) nella gabbia per le femmine per deporre le uova. Parzialmente e immergere la striscia di carta vetrata in acqua per mantenerla umida. Rimuovere altre fonti di acqua per impedire che le femmine depongono le uova fuori la Coppa di deposizione delle uova. Nota: l'acqua del rubinetto può essere utilizzato nelle coppe, ma acqua di allevamento larvale incoraggia la deposizione delle uova51,52 e femmine deporranno le uova più in modo sincrono.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. uovo raccolta e condizionamento
<ol><li>Le femmine deporranno le uova sulla carta vetrata appena sopra la linea di galleggiamento; raccogliere e sostituire le strisce di carta vetrata al giorno fino a quando non più uova. Nota che tale deposizione delle uova può continuare fino a una settimana.</li>
	<li>Strisce di carta vetrata parzialmente asciugare tamponando delicatamente su un tovagliolo di carta per 30 s, facendo attenzione a non per staccare le uova. Avvolgere le strisce in un foglio di scottex asciutto, quindi metterlo in un sacchetto di plastica sigillabile (Figura 1I).</li>
	<li>Verificare lo stato delle uova sotto un microscopio per dissezione (Figura 3). Se la carta vetrata le strisce sono troppo bagnati, uova possono nascere prima di essere immerso in acqua (Figura 3B), ma se secchi troppo duramente, uova possono sprofondare (Figura 3).</li>
	<li>Le uova possono essere covate in qualsiasi momento di là di post-raccolta tre giorni; si schiudono tutte le uova da ogni Colonia, raccolte attraverso tutti i giorni, nello stesso contenitore di acqua per assicurare che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale degli individui.</li>
	<li>Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere le uova in un contenitore sigillato con un'umidità elevata (> 80%) a circa 20 ° C. In queste condizioni, le uova senza Wolbachia possono essere conservate per diversi mesi mantenendo alta tratteggio tariffe53,54.</li>
	<li>Come alcune infezioni di Wolbachia riducono notevolmente la redditività delle uova con età49,55, si schiudono le uova da Wolbachia-infettato linee entro una settimana dalla raccolta per evitare la mortalità eccessiva per il pertinente ceppi. Sangue nutrire le femmine nuovamente dopo una settimana se sono necessari più uova.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Giorno</td>
			<td colspan="3">Passo</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Uova di tratteggio</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Larve di conteggio nei vassoi</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Trasferire le larve e pupe di gabbie di Colonia</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Sangue di alimentazione femminili adulti</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Iniziare a raccogliere le uova</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Terminare la raccolta delle uova</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Uova di tratteggio</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Panoramica del programma di controllo Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. I tempi di sangue-alimentazione femmina e la schiusa delle uova è flessibili, ma lunghe durate in queste fasi dovrebbero essere evitate, in particolare per le zanzare infettate con Wolbachia, al fine di ridurre al minimo la mortalità. Seguendo questo programma riduce al minimo la selezione contro le zanzare che sono veloce o lento per sviluppare o maturo in tutte le fasi di vita, a condizione che le larve sono alimentate in modo ottimale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Figura 1: Attrezzature utilizzate per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio. Contenitori di plastica (A) utilizzati per uova da cova o di allevamento di larve con volumi di 500, 750 e 5.000 mL (da sinistra a destra). (B) vassoi utilizzati per l'allevamento di larve ad una densità controllata, solitamente 500 larve in 4 L di acqua. (C) (D), 3L gabbie utilizzate per adulti di alloggiamento e 19,7 L. Una densità di 25 adulti o meno al litro dovrebbe essere mantenuto per fornire spazio sufficiente. Coppa di 35 mL (E) con ovatta umida fornita come una fonte di acqua per gli adulti. (F) tazza da 35 mL con soluzione di saccarosio fornita attraverso un cavo o stoppino dentale come una fonte di zucchero. (G–H) Tazze riempite con acqua di allevamento larvale e fiancheggiata da un substrato di deposizione delle uova di carta vetrata o carta da filtro (G e H, rispettivamente). (io) chiusura lampo sacchetto usato per la conservazione di strisce di carta vetrata o carta da filtro. Macchie nere sulla carta vetrata sono uova di zanzara. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Figura 2: Laterale (A) e dorsale (B) viste di pupe e adulti Ae. aegypti (C) dimostrando il dimorfismo sessuale. I maschi sono posizionati a sinistra e le femmine a destra in ogni pannello. Quando alimentato in modo ottimale, pupe maschi e femminile si distinguono per dimensioni; le femmine sono più grandi dei maschi (A) ed hanno un cefalotorace relativamente bulboso rispetto ai maschi che hanno i lati più piatto (B). Maschi adulti sono facilmente distinguibili dalle femmine in tutte le condizioni di allevamento, principalmente di loro antenne piumosa e palpi lunghi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Nella figura 3. Quattro giorno vecchio Ae. aegypti uova in condizioni diverse. (A) intatto uova su strisce di carta vetrata mantenuti ad un'umidità elevata (> 80%) ma senza alcun'umidità visibile. Tassi del portello devono essere superiore al 90% per il selvaggio-tipo Ae. aegypti se mantenuta correttamente. (B) le uova che si schiudono prima di essere immerso in acqua (schiusa precoce) si distinguono per un cappuccio staccato uovo e larva visibile. Questo indica che la striscia di carta vetrata è stata mantenuta troppo umida. (C) le uova che sono asciugate troppo duramente potrebbero collassare e sono chiaramente visibili dalla loro apparenza concava. Se la carta vetrata si irrigidisce ciò indica anche che le uova possono essere troppo asciutte. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Seguendo il protocollo presentato qui per la manutenzione di Wolbachia-infetti Ae. aegypti dovrebbero assicurare che le zanzare sane di una qualità costante sono prodotte per esperimenti e aprire campo releases. A differenza di altri protocolli che privilegiano la produzione di massa quantità di zanzare (Vedi riferimento57), i metodi si concentrano su come massimizzare la loro idoneità, sia all'interno di generazioni implementando rilassate condizioni di allevamento e da altra pa...

Le zanzare Aedes aegypti sono responsabili della trasmissione di alcune dell'arbovirus più importanti del mondo, tra cui la dengue, Zika e chikungunya1. Questi virus stanno diventando una crescente minaccia per la salute globale, come la distribuzione capillare di Ae. aegypti nei tropici continua ad espandersi2,3,4. Femmina Ae. aegypti preferenzialmente si nutrono di sangue umano5 e quindi tendono a vivere in prossimità di esseri umani, soprattutto nelle aree urbane, dove le popolazioni sono più densi. Attraverso questa stretta associazione con gli esseri umani si sono adattati anche per allevare in habitat artificiali, compresi i pneumatici, vasi, grondaie e serbatoi acqua6,7. AE. aegypti anche facilmente adattarsi ad ambienti di laboratorio dove può essere mantenute senza requisiti speciali dopo essere raccolte direttamente dal campo, a differenza di alcune altre specie nel genere Aedes 8, 9,10. La facilità di manutenzione ha visto loro ampiamente studiato in laboratorio in una vasta gamma di campi, in ultima analisi, con l'obiettivo di controllare le malattie zanzare può trasmettere.
Tradizionalmente, controllo arbovirus dipende fortemente l'uso di insetticidi per ridurre le popolazioni di zanzare. Tuttavia, vi è crescente interesse approcci dove le zanzare modificate sono allevate in laboratorio e poi rimesso in popolazioni naturali. Rilasciate le zanzare possono essere modificate geneticamente11,12,13, biologicamente14,15, attraverso irradiazione16, trattamento chimico17,18, o con combinato tecniche19 per sopprimere le popolazioni di zanzare o sostituirli con le zanzare che sono refrattari a arbovirus trasmissione20.
Wolbachia sono batteri che vengono attualmente utilizzati come agente di controllo biologico per gli arbovirus. Diversi ceppi di Wolbachia recentemente sono stati introdotti in Ae. aegypti sperimentalmente mediante microiniezione embrionali21,22,23,24. Questi ceppi riducono la capacità dell'arbovirus di diffondere e replicare nella zanzara, diminuendo la loro trasmissione potenziale23,25,26,27,28 . Wolbachia infezioni vengono trasmessi dalla madre alla prole, tuttavia alcuni ceppi inducono sterilità quando infetti maschi si accoppiano con le femmine non infetti22. Wolbachia-maschi infetti pertanto possono essere rilasciati in grandi quantità per sopprimere popolazioni di zanzara naturale, come recentemente dimostrati in altri15,specie di Aedes 29. Tuttavia, poiché Wolbachia inoltre inibiscono la trasmissione arbovirus in Ae. aegypti, zanzare possono essere rilasciate anche per sostituire le popolazioni native con vettori più poveri. Ae. aegypti infettati sperimentalmente con Wolbachia ora vengono rilasciate nel campo in diversi paesi che utilizzano questo approccio posteriore14,30,31.
Wolbachia-approcci di basati per controllo arbovirus si basano su una solida comprensione delle interazioni tra Wolbachia, la zanzara e l'ambiente. Wolbachia si presentano naturalmente in una vasta gamma di insetti, e le deformazioni introdotte le zanzare sono diverse nei loro effetti32. Come vengono introdotti nuovi tipi di infezione di Wolbachia in Ae. aegypti24, è necessario caratterizzare ogni ceppo per i loro effetti sulla zanzara fitness, riproduzione e arbovirus interferenza in una gamma di condizioni. Rigorosa sperimentazione in laboratorio è pertanto necessaria per valutare il potenziale per i ceppi di Wolbachia avere successo nel campo.
Uscite di campo aperto di Ae. aegypti con Wolbachia infezioni possono spesso richiedono migliaia o decine di migliaia di zanzare per zona di rilascio per essere allevato ogni settimana14,30,31. Il successo delle versioni iniziali può essere migliorato attraverso il rilascio di zanzare di grandi dimensioni per massimizzare la loro fecondità33 e accoppiamento successo34,35. Le zanzare dovrebbero anche essere adattate alle condizioni che essi sperimenteranno nel campo, tuttavia a lungo termine laboratorio allevamento può causare cambiamenti nel comportamento e fisiologia che poteva avere un impatto campo prestazioni36,37, 38.
Descriviamo un semplice protocollo per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio con attrezzature di base. Questo protocollo è adatto per entrambi selvaggio-tipo e Wolbachia-infettato le zanzare, il posteriore di quale può richiedere particolare attenzione come alcuni ceppi di Wolbachia hanno effetti sostanziali sulla zanzara vita-storia tratti39, 40. le condizioni di allevamento evitare sovraffollamento e competizione per il cibo per produrre le zanzare di una dimensione coerente, che è critica per competenza vettoriale ed esperimenti di fitness e garantisce che le zanzare sono sane per il rilascio di campo41 . Inoltre prendiamo precauzioni per minimizzare laboratorio adattamento e consanguineità riducendo le pressioni selettive e garantire che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale. Tuttavia, ambienti di laboratorio sono distintamente differenti da condizioni di campo e manutenzione a lungo termine in condizioni rilassate potrebbe ridurre l'idoneità delle zanzare al momento del rilascio in campo37,42,43 . Attraversiamo quindi le femmine da linee di laboratorio ai maschi di campo-raccolti periodicamente, conseguente colonie che sono geneticamente simili per confronti sperimentali e che sono adattati per la destinazione campo popolazione39. I metodi non richiede attrezzature specializzate e possono essere scalati a posteriore decine di migliaia di individui a settimana per i rilasci di campo. Il protocollo inoltre assegna una priorità l'idoneità delle zanzare all'interno e attraverso le generazioni, una considerazione importante per insetti destinati per l'istituzione nelle popolazioni naturali. Il protocollo è adatto per la maggior parte dei laboratori che richiedono manutenzione di Ae. aegypti, particolarmente per i confronti sperimentali dove una qualità costante di zanzare e relatability al campo sono importanti.

<table><tbody><tr><td>Wild type Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Raccolto da luoghi di campo nel Queensland, Australia, vedi Yeap e altri39 per dettagli</td></tr><tr><td>w Mel-infected Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Fornito dalla Monash University. Fare riferimento a Walker e altri23 per informazioni sul ceppo<</td></tr><tr><td>em>w AlbB-infected Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Fornito dalla Monash University. Fare riferimento a Xi e altri21 per informazioni sul ceppo strain</td></tr><tr><td>w MelPop-infected Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Fornito dalla Monash University. Fare riferimento a McMeniman e altri22 per informazioni sul ceppo</td></tr><tr><td>Lievito secco istantaneo</td><td>Lowan Stimola</td><td></td> la <td>schiusa delle uova. Trovato nei negozi di alimentari generici. Possono essere utilizzate altre marche</td></tr><tr><td>Vasca di plastica da 5 L</td><td>Quadrante</td><td>Q110950</td><td>Utilizzato per la schiusa e l'allevamento delle larve. Altri prodotti possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Cibo per pesci (compresse tropicali di tetramina)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Fornito alle larve come fonte di cibo. Sito web: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Contenitori</td><td></td><td></td> di plastica <td>Utilizzati per l'allevamento delle larve. Qualsiasi contenitore di plastica superiore a 500 ml dovrebbe essere adatto</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td></td><td></td> di vetro <td>Utilizzato per il trasferimento di larve e pupe tra i contenitori. Indirizzo web: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Contatore clicker</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Utilizzato per aiutare nel conteggio di larve, pupe e uova. Sito web: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Vassoi per l'allevamento</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Utilizzato per l'allevamento delle larve. Indirizzo web: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Rete</td><td></td><td></td><td>di nylon Utilizzato per trasferire larve e pupe in contenitori di acqua dolce. Possono essere utilizzate altre marche. Indirizzo web: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Gabbie</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Ospita zanzare adulte. Possono essere utilizzati prodotti alternativi. Indirizzo web: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>Bicchiere di plastica da 35 ml</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Utilizzato per fornire acqua o saccarosio alle zanzare adulte. Altre marche possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Coperchio a tazza di plastica da 35 ml</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Utilizzato per fornire saccarosio alle zanzare adulte. Possono essere utilizzate altre marche</td></tr><tr><td>Cotone idrofilo</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Il cotone idrofilo umido viene fornito come fonte d'acqua agli adulti. Altre marche possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Zucchero</td><td></td><td></td> Bianco <td>Fornito come fonte di zucchero per le zanzare adulte. Trovato nei negozi di alimentari generici</td></tr><tr><td>Corda</td><td>M Recht Accessori</td><td>C323C / W</td><td>Utilizzato per fornire soluzione di saccarosio agli adulti. Possono essere utilizzate altre marche. Indirizzo web: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr> <tr><td>Bicchiere di plastica (grande)</td><td></td><td></td><td>Utilizzato come contenitore per l'ovideposizione. Qualsiasi bicchiere di plastica che contenga 100 ml di acqua deve essere adatto</td></tr><tr><td>Carta vetrata</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Fornito come substrato per l'ovideposizione. Possono essere utilizzati prodotti alternativi, ma usiamo questo marchio perché è relativamente inodore. I colori più chiari vengono utilizzati per il contrasto con le uova. Indirizzo web: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Utilizzato come substrato alternativo per l'ovideposizione. Possono essere utilizzate altre marche</td></tr><tr><td>Guanti in lattice</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Previene le punture di zanzara sulle mani durante l'alimentazione del sangue. Possono essere utilizzate altre marche. Sito web: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

mantenimento di aedes aegypti zanzare infettate con wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Le zanzare Aedes aegypti infettate sperimentalmente con Wolbachia stanno utilizzandi in programmi per controllare la diffusione di arbovirus come dengue, chikungunya e Zika. Wolbachia-zanzare infette possono essere rilasciate nel campo di ridurre dimensioni di popolazione attraverso accoppiamenti incompatibili o trasformare popolazioni con le zanzare che sono refrattari alla trasmissione del virus. Per queste strategie avere successo, le zanzare rilasciate nel campo dal laboratorio devono essere competitive con le zanzare autoctone. Tuttavia, mantenere le zanzare in laboratorio può provocare inbreeding, deriva genetica e adattamento di laboratorio che può ridurre la loro idoneità nel campo e può confondere i risultati degli esperimenti. Per verificare l'idoneità dei diversi Wolbachia infezioni per la distribuzione in campo, è necessario mantenere le zanzare in un ambiente di laboratorio controllato attraverso più generazioni. Descriviamo un protocollo semplice per mantenere le zanzare Ae. aegypti in laboratorio, che è adatto per entrambi Wolbachia-zanzare infette e wild-type. I metodi minimizzare adattamento di laboratorio e implementano esogamici per aumentare la rilevanza degli esperimenti alle zanzare di campo. Inoltre, colonie sono mantenute in condizioni ottimali per massimizzare la loro idoneità per i rilasci di campo aperto.

Figura 4 illustra gli effetti della nutrizione suboptimale sullo sviluppo delle larve di Ae. aegypti . Quando sono disponibili contenitori con 0,25 mg di cibo al larva al giorno o meno, aumenta il tempo di sviluppo per sia i maschi che le femmine, ed è meno sincrona rispetto in contenitori fornita con 0,5 mg di cibo. Se un'alimentazione adeguata non viene fornita per tutta la durata dello sviluppo larvale, questo potrebbe avere un impatto negativo su...

Le zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia vengono rilasciate in popolazioni naturali di sopprimere la trasmissione dell'arbovirus. Descriviamo i metodi retro Ae. aegypti con Wolbachia infezioni in laboratorio per esperimenti e rilascio di campo, prendendo precauzioni per ridurre al minimo la selezione e l'adattamento di laboratorio.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere la manutenzione delle zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia. Queste zanzare vengono rilasciate in tutto il mondo per ridurre la trasmissione della dengue e di altri virus. Il nostro protocollo per l'allevamento delle zanzare Aedes aegypti può essere utilizzato da qualsiasi ricercatore interessato a impiegare le zanzare per esperimenti o programmi di controllo delle malattie.Questo metodo può essere utilizzato anche per l'allevamento di zanzare geneticamente modificate nell'ambito di programmi di controllo delle popolazioni di zanzare, inclusi quelli che prevedono il rilascio di insetti sterili. I principi alla base di questo approccio possono essere applicati anche all'allevamento di altre specie di vettori di malattie. Per questo protocollo, mantenere le zanzare a circa 26 gradi Celsius e a un'umidità relativa compresa tra il 50 e il 70%, con un fotoperiodo equatoriale.Se allevati a temperature più elevate, le infezioni da Wolbachia potrebbero andare perdute, quindi non surriscaldare le colonie. Mantenere circa 500 zanzare per popolazione per ridurre al minimo l'incesto. L'uso di questo protocollo con un'adeguata nutri

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive un metodo per purificare Wolbachia pipientis da una linea di cellule Anopheles gambiae e poi la coltura endosymbiont nella cella senza medium. Un test per la vitalità del batterio è dimostrata.

Il mantenimento di Wolbachia in Cell-free medio

Per ottenere la soppressione della popolazione di Aedes aegypti utilizzando il sistema RIDL® (Rilascio di insetti che trasportano un letale dominante), è necessario rilasciare un gran numero di zanzare maschili. Ciò richiede l'uso di tecniche e tecnologie di allevamento di massa per fornire sistemi affidabili per ottenere il massimo numero di zanzare maschili di alta qualità.

Produzione di massa di Aedes aegypti geneticamente modificati per rilasci sul campo in Brasile

Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Un protocollo per la coltura del parassita microsporidiano Edhazardia aedis. Il parassita viene trasferito da una generazione di zanzare Aedes aegypti all'altra tramite trasferimento orizzontale nella fase larvale seguita da trasmissione verticale nella fase adulta. Gli sporoplasmi vivi sopravvivono a lungo termine nelle uova infette.

Propagazione del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nelle zanzare Aedes aegypti

La tecnica degli insetti sterili (SIT) viene utilizzata per controllare specifiche popolazioni di zanzare importanti dal punto di vista medico che possono essere resistenti ai controlli chimici. Qui, descriviamo un metodo di allevamento di massa e preparazione di zanzare maschi sterili per il rilascio in un programma SIT operativo mirato alla zanzara Aedes aegypti .

Preparazione di zanzare Aedes aegypti maschi irradiate e marcate per il rilascio in un programma operativo di tecnica degli insetti sterili

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la competitività dell'accoppiamento di Aedes aegypti maschi usando il colorante fluorescente come marcatore. Le zanzare femmine sono esposte a maschi sia marcati che non contrassegnati per la copulazione. Dopo l'accoppiamento, le loro spermatece vengono esaminate al microscopio a fluorescenza per determinare il loro partner di accoppiamento.

Utilizzo del colorante fluorescente, Rhodamine B, per studiare la competitività dell'accoppiamento nelle zanzare Aedes aegypti maschili

Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.

Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus

Il presente protocollo descrive come misurare i dati dei parametri di vita comuni nelle zanzare Aedes aegypti , tra cui fecondità, dimensioni delle ali, fertilità, rapporto tra i sessi, vitalità, tempi di sviluppo, contributo maschile e longevità adulta. Queste misurazioni possono essere utilizzate per valutare l'idoneità delle zanzare transgeniche.

Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti

Le linee cellulari sono utili negli studi su organismi intracellulari che non possono essere coltivati al di fuori delle loro cellule ospiti. Sebbene le linee infettate da Wolbachia abbiano permesso molte scoperte, l'eterogeneità all'interno di queste linee può portare a risultati sperimentali variabili. Presentiamo un protocollo per la generazione di cloni di singole cellule e colture continue da cellule JW18 infettate da Wolbachia.

Generazione di colture monoclonali da linea cellulare JW18 di Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia

Impara a mantenere zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia per programmi di controllo delle malattie. Questo protocollo fornisce linee essenziali per allevare colonie sane a 26°C e umidità 50-70%.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

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