Name: Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare Drosophila Degenerazione dei motori neuronali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Scopri un metodo economico per indurre lesioni meccaniche ai nervi segmentali di larve di Drosophila. Questa tecnica permette di visualizzare e quantificare la neurodegenerazione a livello della giunzione neuromuscolare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare tutti i membri del Keller e dei Magie Labs presso l&#39;Università Quinnipiac per suggerimenti utili. In particolare, vorremmo ringraziare Barron L. Lincoln II per lo sviluppo di questo test di lesioni all&#39;interno del Keller Lab. Vorremmo inoltre ringraziare l&#39;Università di Quinnipiac College of Arts e Science Grant-In-Aid conferito a LC Keller.

1. Preparazione di reagenti e attrezzature <ol><li> Preparare 1x dissezione buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl 2, 20 mM MgCl 2, 10 mM NaHCO 3, 115 mM di saccarosio, trealosio 5 mM, HEPES 5 mM, pH 7.2). </li><li> Preparare una soluzione salina a base di fosfato (PBS). </li><li> Preparare 1x PBT utilizzando 1x PBS con 0.01% Triton X-100. </li><li> Preparare le piastre di agar succo di frutta. 14 In breve, mescolare 30 g di agar in 700 ml di H 2 O e autoclave. Sciogliere 0,5 g di metil paraben in 10 ml di etanolo e aggiungere la soluzione a 300 ml di concentrato di succo di frutta (uva o mela). Mescolare la concentrazione in soluzione agar autoclavata e versare nei coperchi di piatti da 10 mm x 35 mm Petri. NOTA: La premiera di potenza dell&#39;agrumi può essere acquistata anche da varie aziende (vedere tabelle dei materiali ). </li><li> Ottieni pinze di dimensione 5 che permettono di danneggiare meccanicamente le larve. </li><li> Utilizzare Drosophila standard CO 2 </sUb&gt; base dell&#39;anestesia. </li></ol> 2. Selezionare Drosophila Larvae <ol><li> Prendete un fiale o una bottiglia di Drosophila contenenti larve di terzo istante vagate che sono state coltivate a 25 ° C. </li><li> Selezionare dieci singoli 2 ° o 3 ° larve instar basate sull&#39;apparenza. Le larve di terze instari possono essere identificate dall&#39;aspetto di spirali anch&#39;esse ramificate, mentre le seconde larve di instar sono più piccole e presentano più spiracles anteriori. NOTA: le fasi Larval possono anche essere identificate mediante la temporizzazione. A 25 ° C, le larve secondarie appaiono approssimativamente 48 ore dopo la schiusa, e le larve di terzo istar molt circa 24 ore più tardi. Se interessati ad esaminare la neurodegenerazione presso la NMJ, le seconde larve instar devono essere ferite. </li></ol> 3. Preparazione delle larve Drosophila per lesioni meccaniche <ol><li> Prendete con attenzione le singole larve con le pinze o con un pennello, facendo attenzioneNon per comprimerlo comunque. </li><li> Posizionare direttamente 10 larve in un piatto di vetro contenente un freddo PBS o un tampone di dissezione per rimuovere eventuali detriti alimentari e decelerare la motilità del larvale. </li></ol> 4. lesioni meccaniche e trattamento di larve Drosophila <ol><li> Posizionare ogni singola larva su un apparecchio di anestesia di CO 2 . </li><li> Sotto un microscopio di dissezione, rotolare attentamente ogni larva sul loro lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali attraverso la cuticola. </li><li> La dimensione di posizione 5 pende circa 1/2 a 2/3 lungo la lunghezza della larva partendo dai ganci della bocca. Una volta posizionato, pizzicare circa 1/3 della cuticola ventrale contenente i nervi segmentali con pinze di dimensioni 5. <ol><li> Per garantire che i nervi segmentali larvali siano feriti, applicare forza sufficiente a schiacciare i nervi segmentali ma lasciare intatta la cuticola. Per determinare la giusta quantità di forza, schiacciare 10 larve e assicurarsiIl tasso di mortalità dopo 5 h è inferiore al 50%. </li></ol></li><li> Dopo lesioni, trasferire con cura le larve in una piastra di agar di succo di frutta contenente circa 0,5 g di lievito. Posiziona ogni larva in modo che la sua estremità anteriore sia sulla pasta di lievito, per continuare a nutrirsi nonostante la motilità sconvolta. NOTA: per assicurarsi che i nervi segmentali larvali siano stati feriti, si può osservare la motilità del larvale interrotta dopo il trasferimento sulla piastra agar. Le larve danneggiate sono effettivamente paralizzate posteriormente al sito di lesioni, ma possono ancora muovere i loro ganci e l&#39;alimentazione. Un tasso di mortalità elevato di animali dopo il danno è comune quindi è meglio infettare 20-50% di animali in più di quanto sia necessario per un esperimento. </li><li> Posizionare le piastre di agar contenenti pasta di lievito e 10 larve ferite nel fondo di un piatto vuoto di 100 x 15 mm Petri. Coprire questa piastra di Petri, che ora contiene le larve ferite su una piastra agar con un tovagliolo di carta umido, assicurando che il tovagliolo non tocchi le larve o le piastre agar. Mettere questoPetri in un contenitore più grande dell&#39;aria, a RT. </li><li> Recuperare le larve per la dissezione dopo periodi specifici (6, 12 o 24 ore) dopo lesioni. NOTA: per esaminare gli effetti immediati di lesioni sul citochistone assonale, le larve possono essere disseccate direttamente dopo lesioni. Per esaminare i difetti di trasporto assonale, le larve possono essere disseccate circa 6 ore dopo il danno. Circa 12 h dopo l&#39;infortunio può essere osservato un accumulo di proteine ​​ubiquitinate, e 24 ore dopo l&#39;infortunio può essere osservata la degenerazione dei neuroni motori al NMJ. </li></ol> 5. Analisi della neurodegenerazione presso la NMJ <ol><li> Disseccare Drosophila larval NMJ come descritto in precedenza. 15 , 16 In breve, appoggiate le larve su un piatto di Sylgard, tagliate lungo la superficie dorsale e filettate con i perni in una goccia di tampone di dissezione per esporre la muscolatura della parete del corpo. Fissare le larve in 4% di paraformaldeide (PFA) o nella soluzione di Bouin in base all&#39;antiCorpi utilizzati per visualizzare i neuroni e muscoli. NOTA: la fissazione PFA deve essere utilizzata se i tag proteine ​​fluorescenti, come la Proteina Verde Fluorescente (GFP), devono essere visualizzati come il fissativo di Bouin può essere troppo duro. </li><li> Eseguire l&#39;immunofluorescenza, descritta in precedenza 11 , 13 , 16 , per segnare contemporaneamente i neuroni motori presinaptici e le pieghe muscolari postsinaptiche adiacenti (SSR). Visualizzare le membrane e gli assoni presinaptici con perossidasi di rafano coniugato fluorescently (HR: 1: 300) 17 e le zone attive possono essere macchiate utilizzando un anticorpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultaneamente etichetta i muscoli post-sinaptici con un anticorpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18 </li><li> Eseguire un dosaggio stabilito per quantificare la neurodegenerazione al NMJ come descritto in precedenza. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 In breve, visualizzare contemporaneamente singoli NMJ per entrambi i compartimenti pre e post-sinaptici. Tutti i marcatori etichettati con marcatori postsinaptici ma non marcatori presinaptici indicano siti di neurodegenerazione ( Figura 1 ). Il numero medio di bouton per NMJ e il numero medio di NMJ per animale possono essere quantificati. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilia%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li>
<li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li>
<li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin%2Fankryin%2Fmicrotubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li>
<li>Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.rec065672.short">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19329927">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La lesione meccanica neuronale descritta precedentemente e qui dimostrata può essere utilizzata per indurre lesioni / stress nei nervi segmentali delle larve Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Questa tecnica sperimentale è stata impiegata in precedenza per disseccare la sequenza temporale degli eventi che conducono alla neurodegenerazione, nonché ad esaminare i cambiamenti trascrizionali nei...

La degenerazione neuronale si verifica durante il normale sviluppo e può essere causata dal processo naturale di invecchiamento, lesioni, stress, o stati di malattia. Drosophila melanogaster , la mosca comune di frutta, fornisce un organismo modello semplice e potente per studiare la neurodegenerazione a causa delle notevoli somiglianze nei meccanismi molecolari che guidano la degenerazione dei neuroni. Queste somiglianze sono evidenziate dal fatto che circa il 70% dei geni umani associati alla malattia presenta un omologo Drosophila . 1 Inoltre, numerosi saggi e strumenti tecnologici per lo studio delle malattie neurodegenerative umane sono stati sviluppati e utilizzati in Drosophila. 2 , 3 All&#39;interno di Drosophila , la giunzione neuromuscolare (NMJ) permette di analizzare sia le proprietà cellulari che elettrofisiologiche e si è dimostrato un importante sistema per studiare la malattia neuromuscolare a causa del n visibileConnessioni euron-muscolari. 2 In questo studio, descriviamo un dosaggio in vivo di lesioni neuronali nelle larve Drosophila che consente la lesione riproducibile dei nervi segmentali. Questo infortunio motoneuron provoca una sequenza temporale di eventi cellulari che hanno determinato la neurodegenerazione al NMJ 24 h dopo lesioni. La capacità di lesioni riproducibili che provocano neurodegenerazione ha diverse applicazioni quali identificazione di geni specifici necessari per il processo degenerativo, dissezione delle risposte trascrizionali alla lesione neuronale e analisi delle cascate di segnalazione protettive. 4 , 5 , 6 Questo metodo è stato utilizzato anche in combinazione con microfluidici per studiare la degenerazione e la rigenerazione neuronali in animali vivi. 7 Utilizziamo un dosaggio quantitativo stabilito per esaminare il degenerato dei neuroni motoriIon a Drosophila NMJ dopo lesioni meccaniche. Questo saggio è basato sul fatto che la perdita di membrana e proteine ​​presinaptiche precede lo smontaggio del reticolo subsintattico (SSR) caratterizzato dalle pieghe della membrana muscolare postsinaptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Questo test consente la quantificazione di &quot;orme sinaptiche&quot; in cui il neurone pre-sinaptico ha perso la connessione con il muscolo postinaptico adiacente. Il processo degenerativo è stato dimostrato progressivo durante lo sviluppo della larve 12 e non può essere considerato per lo sviluppo alterato della sinapsia o la germinazione. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L&#39;annuncioIl vantaggio di utilizzare lesioni meccaniche sulle mutazioni preesistenti è che permette la dissezione della sequenza temporale di eventi cellulari che conducono alla neurodegenerazione presso la NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>Forbici per micro-dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Alcune persone preferiscono la taglia 3, mentre altri preferiscono la misura 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Alcune persone preferiscono la taglia 3, mentre altri preferiscono la misura 5</td></tr><tr><td>CO2 Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>È possibile acquistare serbatoi di varie dimensioni</td></tr> CO<tr><td>2 Apparecchio per anestesia</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Perni in acciaio inossidabile, misura 0,1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Elastomero siliconico, base e agente indurente</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Per versare piastre di dissezione</td></tr> Soluzione <tr><td>di Bouin</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Gli anticorpi devono essere testati per la loro efficienza in Bouin e PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td>Gli anticorpi <td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>devono essere testati per la loro efficienza in Bouin e</td></tr><tr><td>PFA Microscopio stereo da dissezione</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo nc82</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-dischi grandi anticorpi</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-rafano perossidasi</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&reg; 488, 594 o 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Utilizzato per creare una camera umida per il recupero larvale</td></tr></tbody></table>

una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare<em&gt; drosophila</em&gt; degenerazione dei motori neuronali

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

La degenerazione dei neuroni avviene durante il normale sviluppo e in risposta a lesioni, stress e malattie. I segni cellulari della degenerazione neuronale sono notevolmente simili negli esseri umani e negli invertebrati, così come i meccanismi molecolari che guidano questi processi. La mosca di frutta, Drosophila melanogaster , fornisce un organismo di modello genetico potente ma semplice per studiare le complessità cellulari delle malattie neurodegenerative. Infatti, circa il 70% dei geni umani associati alla malattia ha un omologo Drosophila e una pletora di strumenti e dosaggi sono stati descritti usando le mosche per studiare le malattie neurodegenerative umane. Più in particolare la giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila si è rivelata un efficace sistema per studiare le malattie neuromuscolari a causa della capacità di analizzare le connessioni strutturali tra il neurone e il muscolo. Qui, riportiamo un test in vivo di lesioni neuronali del motore in Drosophila , cheRiproducibilmente induce la neurodegenerazione a NMJ per 24 h. Utilizzando questa metodologia, abbiamo descritto una sequenza temporale di eventi cellulari che determinano la degenerazione dei motori neuronali. Il metodo del pregiudizio ha diverse applicazioni ed è stato utilizzato anche per identificare geni specifici necessari per la neurodegenerazione e per disseccare le risposte transcrizionali alla lesione neuronale.

Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo dimostrato che lesioni neuronali meccaniche consentono la dissezione temporale di eventi neurodegenerativi. 14 , 18 La sequenza degli eventi è stata precedentemente caratterizzata e inizia con un&#39;interruzione immediata del citoscheletro, seguita da difetti di traffico dell&#39;assone, un accumulo di proteine ​​ubiquitinate e una successiva neurodegenerazione 24 h post-lesione. ...

Qui descriviamo un metodo semplice e ampiamente accessibile per danneggiare i nervi segmentali nelle larve Drosophila per visualizzare e quantificare la neurodegenerazione dei neuroni motori alla giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di terzo istar.

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Degenerazione dei motori neuronali

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un danno meccanico ai neuroni motori nelle larve di Drosophila. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulle malattie neurodegenerative, come la sequenza temporale degli eventi cellulari che portano alla neurodegenerazione. I principali vantaggi di questa tecnica sono il basso costo e l'utilizzo di attrezzature che la maggior parte dei laboratori di Drosophila possiede già.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla comprensione dei meccanismi molecolari che guidano la neurodegenerazione. Per iniziare il protocollo, selezionare 10 larve del secondo o terzo stadio da un'ampolla o bottiglia di Drosophila contenente larve del terzo stadio in movimento, coltivate a 25 gradi Celsius. Utilizzare pinzette per sollevare con attenzione singole larve usando pinzette o un pennello, senza comprimerle.Posizionare direttamente i 10 larvi in una capsula di vetro contenente PBS freddo 1x per rimuovere eventuali residui di cibo e ridurre la motilit&agrave; larvale. Identificare i larvi del terzo stadio in base ai loro spiracoli anteriori ramificati e i larvi del secondo stadio per le dimensioni pi&ugrave; piccole e gli spiracoli anteriori di forma clavata. Posizionare ogni larva su un apparecchio anestetizzante a base di CO2.Sotto un microscopio stereoscopico, arrotolare con attenzione ciascun larva sul proprio lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali attraverso il tegumento. È fondamentale arrotolare con cura ogni larva sul lato dorsale per poter osservare i nervi segmentali attraverso il tegumento prima della lesione. Partendo dagli uncini boccali, posizionare una pinzetta di dimensione 5 all’incirca a metà o a due terzi della lunghezza del corpo della larva.Una volta posizionato, pizzicare circa un terzo della cuticola ventrale contenente i nervi segmentali utilizzando pinzette di dimensione 5. Per assicurarsi che i nervi segmentali delle larve siano lesi, applicare una forza sufficiente da schiacciare i nervi segmentali mantenendo intatta la cuticola. Per determinare la quantità corretta di forza, schiacciare 10 larve e verificare che la percentuale di mortalità dopo cinque ore sia inferiore al 50%. Dopo la lesione, trasferire con attenzione le larve in una piastra in agar al succo di frutta contenente circa 0,5 grammi di pasta di lievito.Posizionare ciascun larva in modo che la sua estremità anteriore si trovi sulla pasta di lievito per consentire l'alimentazione continua. Posizionare le piastre di agar contenenti la pasta di lievito e 10 larve ferite sul fondo di una piastra di Petri vuota di 100 per 15 millimetri. Coprire la piastra di Petri con un tovagliolo di carta umido, assicurandosi che il tovagliolo non tocchi le larve né le piastre di agar.Quindi, posizionare la piastra di Petri in un contenitore ermetico a temperatura ambiente. Infine, recuperare le larve per la dissezione dopo i periodi specificati dal trauma. Prima del trauma, le giunzioni neuromuscolari di tipo selvatico, o NMJ, mostrano il marcatore della zona attiva presinaptica Brp in opposizione al marcatore postsinaptico Dlg in tutta l'estensione della NMJ.Un danno meccanico ai nervi segmentali può indurre una neurodegenerazione da moderata a grave, in cui le terminazioni nervose colorate con Dlg non presentano più la proteina della zona attiva presinaptica Brp. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano il danno neuronale, permettendo di esplorare la sequenza temporale degli eventi cellulari che portano alla neurodegenerazione alla giunzione neuromuscolare in Drosophila.

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

La giunzione neuromuscolare della Drosophila (NMJ) viene utilizzata come modello per studiare la morfologia e la funzione delle sinapsi. Questo video descrive importanti caratteristiche che i ricercatori quantificano per caratterizzare l'NMJ. Il protocollo di esempio mostra un software in grado di eseguire la quantificazione automaticamente.

drosofila Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

Questo video descrive l'ablazione laser a due fotoni degli assoni in una larva di Drosophila melanogaster e un protocollo di esempio per indurre lesioni e visualizzare il sito della lesione.

Lesione neurale indotta da laser a due fotoni: un metodo per osservare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni nelle larve di Drosophila

Il video dimostra l'induzione della neurodegenerazione nei nervi segmentali della larva di Drosophila attraverso una lesione meccanica. La cuticola ventrale delle larve anestetizzate viene pizzicata con una pinza per causare lesioni ai nervi segmentali. Le larve ferite vengono mantenute con il cibo, consentendo alla lesione di causare la degenerazione dei motoneuroni nei nervi, causando l'interruzione delle loro giunzioni neuromuscolari (NMJ).

Danneggiare meccanicamente i nervi segmentali delle larve di Drosophila per indurre la neurodegenerazione

Questo video dimostra un protocollo per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari nei muscoli longitudinali dorsali di Drosophila. La procedura prevede la colorazione di neuroni e muscoli con due anticorpi distinti e il confronto dei modelli di fluorescenza tra mosche mutanti e wild-type. Una riduzione della colorazione neuronale nei moscerini mutanti indica neurodegenerazione, mentre la struttura muscolare rimane intatta.

Valutazione dell'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali in Drosophila

Un paradigma danno usando il cavo larvale nervoso ventrale Drosophila per studiare la rigenerazione del sistema nervoso centrale e la riparazione è descritto. Stabbing seguito da scansione laser microscopia confocale in time-lapse e fissi campioni, combinata con l'analisi quantitativa con software volutamente sviluppato e genetica, sono utilizzati per studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione e riparazione del SNC.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila larve sono un sistema modello attraente per l'imaging dal vivo a causa della loro cuticola trasparente e potenti genetica. Questo protocollo descrive come utilizzare un dispositivo PDMS singolo strato, chiamato il 'chip di larva' per l'imaging dal vivo di processi cellulari all'interno dei neuroni di 3 ° instar larve di Drosophila.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando la drosofila neurone sensoriale - modello di lesione del neurone arborization dentritico (da), che combina in vivo live imaging, due fotoni laser assotomia/dendriotomy e il potente toolbox di volare genetica, come una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione.

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.

Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici

Qui, forniamo protocolli per eseguire tre semplici saggi di degenerazione degli assoni indotta da lesioni (morte assonale) in Drosophila melanogaster per valutare la conservazione morfologica e funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi.

Valutazione morfologica e funzionale degli assoni e delle loro sinapsi durante la morte di Axon in Drosophila melanogaster

L'obiettivo di questa procedura è quello di sezionare il tessuto del muscolo longitudinale dorsale (DLM) per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari DLM (NMJ) nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando Drosophila melanogaster.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Descriviamo una tecnica di dissezione che preserva l'architettura della giunzione neuromuscolare e consente uno studio immunocitochimico dettagliato dei motoneuroni nella gamba adulta di Drosophila .

Dissezione e immunoistochimica della gamba adulta di Drosophila per rilevare i cambiamenti alla giunzione neuromuscolare per un motoneurone identificato

Scopri un metodo economico per indurre lesioni meccaniche ai nervi segmentali di larve di Drosophila. Questa tecnica permette di visualizzare e quantificare la neurodegenerazione a livello della giunzione neuromuscolare.

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare

Esplora altri video