Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare Drosophila Degenerazione dei motori neuronali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre lesioni meccaniche dei motoneuroni nelle larve di Drosophila. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca neurodegenerativa, come la sequenza temporale degli eventi cellulari che portano alla neurodegenerazione. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è economica e utilizza attrezzature che la maggior parte dei laboratori di Drosophila già possiede.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione dei meccanismi molecolari che guidano la neurodegenerazione. Per iniziare il protocollo, selezionare 10 larve di secondo o terzo stadio da una fiala o flacone di Drosophila contenente larve di terzo stadio vaganti che sono state coltivate a 25 gradi Celsius. Usa il forcipe per raccogliere con cura le singole larve con un forcipe o un pennello senza comprimerle.

Metti direttamente le 10 larve in un piatto di vetro contenente 1x PBS freddo per rimuovere eventuali residui di cibo e rallentare la motilità larvale. Identifica le larve del terzo stadio dai loro spiracoli dei rami anteriori e le larve del secondo stadio dalle loro dimensioni più piccole e dagli spiracoli anteriori simili a clava. Posizionare ogni larva su un apparecchio di anestesia a CO2.

Sotto un microscopio da dissezione, arrotolare con cura ogni larva sul lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali in tutta la cuticola. È essenziale far rotolare con cura ogni larva sul lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali attraverso la cuticola prima della lesione. Partendo dai ganci della bocca, posizionare una pinza di dimensioni 5 a circa metà o due terzi della lunghezza della larva.

Una volta posizionato, pizzicare circa un terzo della cuticola ventrale contenente i nervi segmentali con precipite di dimensione 5. Per garantire che i nervi segmentali larvali siano danneggiati, applicare una forza sufficiente per schiacciare i nervi segmentali ma lasciare intatta la cuticola. Per determinare la corretta quantità di forza, schiacciare 10 larve e assicurarsi che il tasso di mortalità dopo cinque ore sia inferiore al 50% Dopo la lesione, trasferire con cura le larve su una piastra di agar per succo di frutta contenente circa 0,5 grammi di pasta di lievito.

Posiziona ogni larva in modo che la sua estremità anteriore sia sulla pasta di lievito per continuare l'alimentazione. Posizionare le piastre di agar contenenti pasta di lievito e 10 larve ferite sul fondo di una capsula di Petri vuota di 100 x 15 millimetri. Copri la capsula di Petri con un tovagliolo di carta umido, assicurandoti che il tovagliolo di carta non tocchi le larve o le piastre di agar.

Quindi posizionare la capsula di Petri in un contenitore ermetico a temperatura ambiente. Infine, recuperare le larve per la dissezione dopo periodi specificati dopo l'infortunio. Prima della lesione, le giunzioni neuromuscolari wild-type, o NMJ, mostrano il marcatore della zona attiva presinaptica Brp in apposizione al marcatore postsinaptico Dlg in tutta la NMJ.

La lesione meccanica dei nervi segmentali può indurre neurodegenerazione da moderata a grave in cui i botoni colorati con Dlg ora mancano della proteina della zona attiva presinaptica Brp. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano le lesioni neuronali per esplorare la sequenza temporale degli eventi cellulari che portano alla neurodegenerazione alla giunzione neuromuscolare in Drosophila.