In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la posizione, l'abbondanza e il fenotipo delle cellule T CD8 positive antigene-specifiche all'interno dei tessuti di interesse. Questo metodo aiuta a rispondere a domande rapide sulle cellule T CD8 fornendo un mezzo per localizzare, quantificare e fenotipizzare praticamente qualsiasi cellula T CD8 specifica per l'antigene e qualsiasi tessuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di determinare la distribuzione spaziale delle cellule T CD8 positive antigene specifiche rispetto ad altre cellule e strutture all'interno dei tessuti di interesse.

A dimostrare la procedura con Shengbin Li sarà Gwantwa Mwakalundwa. Il primo giorno della procedura, utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto fresco in pezzi di circa 0,5 x 0,5 centimetri. Qui viene mostrato il tessuto della milza del macaco rhesus.

Incollare separatamente ogni frammento di tessuto al centro della parte superiore di uno stantuffo e incorporare i campioni in tre-cinque millilitri di agarosio caldo al 4% a basso punto di fusione in PBS. Etichettare gli stantuffi con le informazioni pertinenti sul tessuto. Quindi, posizionare i campioni in un supporto refrigerato in un secchiello per il ghiaccio.

Quando l'agar si è solidificato, accendere il microtomo e impostare lo spessore su 200 micrometri. Dopo aver installato una nuova lama di rasoio, inserire gli stantuffi nel bagno del microtomo. Riempi il bagno del microtomo con 100-200 millilitri di PBS-H appena preparato e aggiungi cubetti di ghiaccio PBS-H per mantenere la temperatura tra zero e due gradi Celsius.

Dopo aver ottenuto sezioni da 200 micrometri, utilizzare un pennello per rimuovere l'agar che circonda ciascuna sezione e trasferire i campioni in singole camere tissutali all'interno di singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti contenente un millilitro di PBS-H refrigerato. Quando tutti i campioni sono stati acquisiti, incubare le sezioni di tessuto per una notte in un millilitro di tetrameri MHC di classe uno caricati con peptidi coniugati idonei, diluiti in PBS-H integrati con siero di capra normale al 2% a quattro gradi Celsius con oscillazione. La mattina seguente, trasferire ogni camera tissutale nei singoli pozzetti di una nuova piastra da 24 pozzetti contenente un millilitro di PBS-H fresco refrigerato per 20 minuti.

Dopo il secondo lavaggio, fissare le sezioni in un millilitro di paraformaldeide fresca al 4% per due ore a temperatura ambiente. Seguito da due lavaggi di cinque minuti in PBS-H freddo. Trasferire le sezioni in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente urea molare 0,01 e cuocere le sezioni nel microonde tre volte per circa 10 secondi ogni volta fino a quando l'urea bolle.

Per permeabilizzare e bloccare i campioni, incubare le sezioni in una soluzione bloccante contenente PBS-H integrata con un detergente triton x100 allo 0,3% e siero di capra normale al 2% su un bilanciere per un'ora, a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire le camere tissutali nei pozzetti individuali di una nuova piastra da 24 pozzetti contenente un millilitro di soluzione contenente anticorpi anti-fitc di coniglio, anticorpi CD antiumani di topo e anticorpi CD3 antiumani di ratto. Incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius con oscillazione.

Il terzo giorno, lavare le sezioni tre volte in PBS-H fresco a quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti per lavaggio ed eseguire un'incubazione finale con gli anticorpi secondari coniugati a fluorescenza appropriati per un massimo di tre giorni, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione terziaria degli anticorpi, sciacquare i campioni con tre lavaggi di 20 minuti in PBS-H fresco e utilizzare un pennello per trasferire i campioni da ciascuna camera tissutale su un vetrino da microscopio in vetro. Rivestire ogni sezione con un mezzo di montaggio integrato con un conservante fluoroforo e coprire i campioni con un vetrino coprioggetto.

Quindi, conservare i vetrini in un contenitore per vetrini protetto dalla luce, a 20 gradi Celsius. Il giorno dell'imaging, posizionare il primo vetrino sul tavolino di un microscopio confocale e selezionare i laser e i filtri appropriati per ciascun fluoroforo utilizzato per etichettare il campione di tessuto. Utilizzando l'obiettivo 20x, ottenere in sequenza una serie z a intervalli di tre micron in ciascuno dei canali fluorofori, in campi multipli di 800 x 800 pixel.

Quindi, costruire un montaggio dei campi raccolti e salvare ogni immagine di montaggio con un nome basato sul campione di tessuto corrispondente. In queste immagini rappresentative, una sezione colorata con tetrameri MHC di classe uno caricati con un peptide SIV viene confrontata con una sezione dello stesso tessuto, colorata con tetrameri MHC di classe uno caricati con un peptide irrilevante, dimostrando la specificità della colorazione del tetramero. In queste immagini, le cellule T virus-specifiche colorate con tetramero MHC di classe uno caricato con peptide SIV, co-colorano per CD8, un marcatore del sottogruppo delle cellule T ma non per CD20, una proteina della superficie cellulare espressa sulle cellule B.

Questo montaggio è stato creato per campi multipli della serie z confocale, che sono stati utilizzati per la quantificazione di cellule colorate con tetramero con fenotipi specifici e diversi compartimenti anatomici sul linfonodo. Questa immagine ingrandita evidenzia un'area del linfonodo di montaggio che contiene un follicolo a cellule B delineato dalla colorazione IGM. Le cellule colorate con tetramero MHC di classe uno, alcune delle quali co-esprimevano il marcatore di attivazione e proliferazione delle cellule T, KI67, possono essere rilevate all'interno e all'esterno del follicolo delle cellule B.

Questa combinazione di colorazione consente di determinare gli stati di attivazione e proliferazione delle cellule T CD8 positive SIV specifiche, nonché la loro localizzazione all'interno dei tessuti linfoidi secondari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa cinque giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il tessuto fresco è fondamentale per la corretta colorazione.

Elaborare i campioni entro 24 ore o meno dalla raccolta, mantenendoli in frigorifero fino alla fissazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una colorazione con tetrameri e immunoistochimica per determinare la posizione, l'abbondanza e il fenotipo delle cellule T CD8 positive antigene specifico nei tessuti di interesse. Non dimenticare che lavorare con agenti infettivi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni per prevenire l'esposizione, come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati e limitare l'uso di oggetti taglienti.