Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica
11 settembre 2017
Descriviamo l'uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l'analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.
L'obiettivo generale di questo protocollo di microdissezione a cattura laser è quello di raccogliere cellule da specifiche regioni cerebrali colpite da lesioni cerebrali traumatiche per l'analisi molecolare. Sono la dottoressa Helen Hellmich. Il mio assistente laureato, Harris Weisz, che è uno studente del programma di fisiopatologia umana e medicina traslazionale qui presso il ramo medico dell'Università del Texas, dimostrerà come utilizziamo i metodi di microdissezione a cattura laser nei nostri studi sulle lesioni cerebrali.
Questo metodo potrebbe aiutare a chiarire i meccanismi e le conseguenze dei cambiamenti indotti dal trauma cranico in regioni discrete del cervello, come la corteccia frontale, che controlla le funzioni esecutive. E l'ippocampo, che è importante per i processi dipendenti dalla memoria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo studiare l'effetto di un processo patologico su più regioni cerebrali discrete o su singoli tipi di cellule dello stesso cervello.
Prima di qualsiasi procedura LCM che includa l'analisi trascrizionale, pulire tutte le superfici con RNace eliminando il detergente per mitigare il rischio di contaminazione e degradazione dell'RNA. Recupera il tessuto cerebrale dal deposito. E mettere in un cirostato raffreddato a meno 20 gradi Celsius.
Lasciare che il cervello si equilibri alla temperatura della camera del criostato per circa dieci minuti. Posiziona il cervello, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, su un foglio di garza sopra il tavolino del criostato. Con una lama di rasoio a RNA pulita, tagliare la porzione posteriore appena rostrale al cervelletto e la porzione appena anteriore al chiasma ottico.
Mettere una piccola quantità di mezzo di taglio ottimale in due stampi criogenici separati. Posizionare il cervello contenente la corteccia di associazione frontale e il nucleo accumbens in uno stampo criogenico con il lato interno rivolto verso il basso. Aggiungere una quantità sufficiente di terreno OCT per coprire il tessuto.
Ripetere questo passaggio con il pezzo di tessuto cerebrale contenente l'ippocampo e il nucleo soprachiasmatico. Lasciare congelare completamente il terreno OCT per circa 20 minuti nel criostato. Una volta che il tessuto e il terreno OCT sono completamente congelati, spremere una piccola quantità di OTC su una testa di montaggio.
Premere un criopoldo congelato sulla testa di montaggio e lasciare che l'OCT si congeli completamente in modo che lo stampo contenente il tessuto sia saldamente attaccato alla testa. Fissare l'attacco della testa al supporto di sezionamento e serrare la vite. Regolare l'angolo di taglio rispetto alla lama del criostato con le leve di regolazione per garantire che le sezioni vengano tagliate in modo uniforme.
Impostare lo spessore della sezione a 30 micron. Quando si seziona il blocco di tessuto contenente l'ippocampo e il SEN, sezionare fino a quando il chiasma ottico non si appiattisce a bregma 0,48 millimetri Quando il terzo ventricolo diventa evidente. Quindi raccogliere le sezioni per il SEM da questo punto posizionando delicatamente i vetrini della membrana di polietilene naftalato a temperatura ambiente sopra sopra il tessuto sezionato.
Garantire visivamente l'aderenza al vetrino confermando che il tessuto e l'OTC siano completamente fusi sul vetrino. Conservare tutti i vetrini con sezioni di tessuto nel criostato fino alla colorazione. Arrestare le sezioni di raccolta a bregma 0,72 millimetri quando inizia la decussazione sopraottica.
Per la raccolta dell'ippocampo, la sezione fino a quando le corna dello strato di cellule granulari del giro dentato sono visibili a bregma 3,00 millimetri. Raccogliere le sezioni fino a quando i sottocampi CA dell'ippocampo non sono fusi nelle sezioni coronali a una temperatura di 4,78 millimetri. Ciò consente la raccolta completa dell'ippocampo sotto la craniotomia e il sito della lesione.
Prima della colorazione, lavare tutte le stoviglie e l'area macchiata in una cappa chimica con detergente per l'eliminazione della RNasi. Prendere la rastrelliera di lati dal criostato e posizionarla nella cappa aspirante. Lasciare scaldare i vetrini per 30 secondi.
Colorare le sezioni con violetta cresillica e schiarirle con soluzione fisiologica. Lasciare asciugare all'aria il rack di vetrini macchiati per non più di dieci minuti a temperatura ambiente nella cappa aspirante. Una volta essiccato, procedere immediatamente a LCM.
Prima di iniziare qualsiasi procedura LCM per l'analisi dell'RNA, pulire l'area di raccolta e l'area intorno al dispositivo con RNAsi che elimina il detergente ed etanolo al 100%. Capovolgere l'interruttore di alimentazione sull'unità di generazione laser a infrarossi prima di accendere la base del microscopio e consentire l'inizializzazione del sistema prima di avviare il software dal desktop. Una volta che il software è stato avviato ed eseguito, attraverso i passaggi di inizializzazione, aprire il pannello di configurazione del software e premere il pulsante della fase attuale.
Lo stadio modulare si sposterà in posizione in cui i macro tappi e le diapositive LCM possono essere caricati e scaricati. Posizionare fino a tre diapositive della membrana della penna nei supporti con il bordo smerigliato rivolto verso destra. Selezionare il tappo e l'area di gestione dei vetrini accanto al vetrino e fare clic sulla casella di controllo MEM per indicare al software che i vetrini in vetro a membrana sono stati caricati.
Quindi fare clic sulla diapositiva desiderata da acquisire per prima. Per acquisire un'immagine affiancata per la posizione del tessuto e l'orientamento per il posizionamento dei cappucci, selezionare immagine sulla barra degli strumenti e selezionare acquisisci panoramica. Posizionare il cursore sull'area dell'immagine affiancata, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il tappo di posizione al centro della regione.
Il software posizionerà automaticamente un cappuccio sulla posizione selezionata. Dopo aver individuato i laser a infrarossi e UV, scegli l'opzione di disegno a mano libera nel riquadro di selezione degli strumenti. Utilizzando lo stilo del touch screen, disegna attorno al perimetro della regione di interesse facendo attenzione a non perdere il contatto tra il touch screen e la testa dello stilo.
Assicurati di collegare insieme i punti iniziale e finale. Per la raccolta dell'ippocampo, catturare con il laser i sottocampi dell'ippocampo CA1, CA2 e CA3 a partire da 3,00 millimetri e utilizzando lo strato granulare completamente formato del giro dentato come punto di riferimento fisico dell'identificazione morfologica. Dopo la raccolta, spostare i macro tappi LCM in posizione QC e ispezionare la completa aderenza del tessuto, assicurandosi visivamente che il tessuto tagliato UV sia attaccato alla membrana.
È imperativo che il laser UV tagli l'intero tessuto. In caso contrario, si verificherà un'aderenza tissutale incompleta al cappuccio LCM. Quindi posizionare rapidamente ogni tappo in una provetta di reazione a parete sottile da 0,5 millilitri priva di RNAsi contenente 100 microlitri di tampone lisus cellulare.
Agitare brevemente i campioni per garantire un livello completo e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento di eseguire l'analisi genomica a valle. Di seguito sono riportate immagini rappresentative di sezioni di tessuto raccolte dal lato epcilaterale del sito della lesione con funzioni laser a infrarossi e UV sul sistema LCM. Questa è un'area della corteccia di associazione frontale.
Questa immagine mostra la stessa regione dopo la raccolta. E questo è il fazzoletto sul cappuccio dopo la raccolta. Questa immagine mostra i componenti degli strati parameatali CA1, CA2 e CA3 dell'ippocampo situati accanto alle corna completamente formate dello strato granulare del giro dentato.
Sono state raccolte le regioni CA2 e CA3 e queste popolazioni cellulari sono visibili sul tappo. Qui, un'area del nucleo accumbens core prossimale adrostrale alla commessura anteriore è stata presa di mira ha fedelmente riprodotto sul cappuccio. Infine, il nucleo soprachiasmatico rostrale al chiasma sopraottico è stato catturato da LCM dopo trauma cranico.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per elaborare un cervello in circa otto ore. Ciò include la lavorazione dei tessuti, la colorazione e la LCM. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'analisi epigenetica, possono essere eseguiti per rispondere a domande riguardanti i modelli di metilazione o l'espressione micronica.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire LCM su più regioni del cervello sullo stesso cervello.
Panoramica
Questo articolo descrive l'uso della microdissezione con cattura laser (LCM) per ottenere popolazioni cellulari specifiche da diverse aree del cervello di ratto al fine di analizzare l'espressione genica e dei microRNA. La tecnica migliora la comprensione degli effetti differenziali della lesione cerebrale traumatica (TBI) in diverse regioni cerebrali, come la corteccia frontale e l'ippocampo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Analisi molecolare
Sfondo
- Il TBI può causare effetti diversi in diverse regioni del cervello.
- Comprendere questi effetti a livello cellulare richiede tecniche di campionamento precise.
- La LCM consente un'analisi mirata di specifici tipi cellulari senza contaminazione.
- Questo studio presenta implicazioni sia pratiche che metodologiche per la ricerca in neuroscienze.
Scopo dello studio
- Utilizzare la LCM per isolare le cellule cerebrali colpite dal TBI.
- Analizzare l'espressione genica e dei microRNA rilevanti per il TBI.
- Chiarire le conseguenze molecolari del TBI in aree cerebrali selezionate.
Metodi Utilizzati
- La microdissezione con laser (LCM) è la piattaforma principale utilizzata.
- Il modello biologico consiste in tessuti cerebrali di ratto, con un focus specifico sulle regioni colpite da TBI.
- Lo studio stabilisce tempistiche fondamentali per la preparazione, la sezionatura e la colorazione dei tessuti.
- Particolare enfasi è posta su rigorose misure di prevenzione della contaminazione durante tutto il protocollo.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di popolazioni cellulari bersaglio da regioni come la corteccia frontale e l'ippocampo.
- Acquisizione di informazioni sui cambiamenti indotti dal trauma cranico a livello molecolare, utili per futuri studi meccanicistici.
- Individuazione di fasi critiche nella sezionatura e nella colorazione per un recupero affidabile dell'RNA.
Conclusioni
- Lo studio dimostra come la LCM possa facilitare analisi molecolari mirate sugli effetti del danno cerebrale traumatico.
- Le implicazioni includono una migliore comprensione dei meccanismi neuronali alterati dal trauma.
- Questo metodo aumenta la precisione nella ricerca neuroscientifica e offre nuove possibilità per l'esplorazione terapeutica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microdissezione mediante cattura laser (LCM) consente un profilo molecolare preciso di aree cerebrali distinte interessate da lesione cerebrale traumatica (TBI), supportando la validazione degli obiettivi attraverso l'analisi dell'espressione genica e di microRNA con risoluzione spaziale. Questo approccio riduce i segnali di confondimento derivanti da tessuti eterogenei, migliorando la fiducia predittiva nella riduzione del rischio meccanicistica dei percorsi del TBI. Isolando risposte specifiche per area provenienti dallo stesso animale, la LCM migliora la continuità traslazionale e il triage del portafoglio nella scoperta nel campo delle neuroscienze.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando le regioni colpite dal TBI, come la corteccia frontale e l'ippocampo, per chiarire i percorsi coinvolti.
- Valore operativo: Fornisce una validazione degli obiettivi biologicamente più sicura mediante analisi molecolari con risoluzione spaziale, evitando artefatti legati alla dissociazione del tessuto.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando modifiche dell'espressione genica specifiche per regione a esiti funzionali nei processi esecutivi e nella memoria.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per saggi genomici successivi preservando l'integrità spaziale e la posizione nativa delle regioni cerebrali.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mediante sezionamento guidato da punti di riferimento anatomici, utilizzando un atlante del cervello di ratto.
- Valore di scalabilità: Consente una valutazione affidabile dei composti fornendo letture molecolari quantitative e specifiche per regione provenienti da aree cerebrali distinte.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Mantiene la rilevanza per la patologia consentendo l'analisi delle alterazioni indotte dal trauma cranico nell'espressione genica e dei microRNA in aree cerebrali anatomicamente definite.
- Continuità preclinica: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato permettendo un profilo molecolare longitudinale che copre le fasi dalla scoperta a quella preclinica.
- De-risking meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo isolando i cambiamenti molecolari causali in regioni distinte piuttosto che su medie dell'intero tessuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La LCM si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente fino alla validazione preclinica, consentendo un'analisi basata su ipotesi dei meccanismi del danno cerebrale traumatico in diverse regioni cerebrali chiave.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici isolando popolazioni cellulari specifiche da regioni colpite da lesioni, come il nucleo accumbens e il nucleo sopraottico.
- Screening: Garantisce la prontezza per i saggi mediante sezionamento standardizzato a coordinate definite del bregma e lavorazione priva di RNasi per un rendimento affidabile di RNA.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti, inclusi profili di espressione genica e di microRNA ottenuti da tessuti isolati con microdissezione laser.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico permettendo l'analisi epigenetica e della metilazione successiva alla microdissezione laser, come indicato nel protocollo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile in diversi modelli di malattia, con principi applicabili a studi sull'espressione genomica in altri contesti di lesione o malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla validazione degli obiettivi e alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'analisi dei percorsi del danno cerebrale traumatico (TBI).
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante sezionamento criostatico, guida tramite atlante e flussi di lavoro controllati per la RNasi.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate isolando risposte molecolari specifiche della regione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sull'allineamento di biomarcatori con risoluzione spaziale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in neuroanatomia, sezionamento al criostato e utilizzo di strumentazione per microdissezione laser.
- È dipendente da ambienti privi di RNasi, criostato a -20°C, mezzo di ottima temperatura di taglio e sistemi laser UV/IR.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per le procedure di colorazione, raccolta dei sezioni e caricamento dei tappi tra i team di neuroscienze e biologia molecolare.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la regolazione delle coordinate di sezionamento basate sul bregma per diverse regioni cerebrali e modelli animali.
- I limiti pratici comprendono la necessità di un rigoroso controllo della contaminazione e di una competenza tecnica nell'uso del tracciamento con laser UV per garantire l'adesione completa del tessuto.
