Name: Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri la microdissezione laser per isolare cellule da regioni cerebrali specifiche colpite da lesione traumatica nel ratto. Questo metodo consente analisi molecolari mirate di espressione genica e microRNA.

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Vorremmo riconoscere Elizabeth Sumner per il suo aiuto questo manoscritto di editing. Finanziamento per questo progetto è stato fornito in parte dal Moody Project per la ricerca di ferita di cervello traumatica traslazionale e RO1NS052532 di HLH.

Nota: tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato di uso della University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e istituzionali Animal Care come diretto dalla istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di Animali da laboratorio (8 ° edizione, nazionale Consiglio di ricerca).
 1. tissue Collection, identificazione di regione e sezionamento <ol><li>soggetto, maschio adulto, ratti Sprague-Dawley, circa sei settimane di vita e 250-300 g, alla lesione sperimentale percussioni fluido, come descritto in Shimamura et al. 4.</li> <li>twenty-four ora dopo sperimentale TBI, umanamente eutanasia gli animali mettendoli in una camera con una concentrazione di isoflurane del 4% fino a quando non anestetizzati. Garantire la morte per decapitazione, asportare i cervelli e congelare immediatamente in ghiaccio secco in polvere. Archivio congelati cervelli in un congelatore a-80 ° C fino al sezionamento.</li>
	<li>Priore a qualsiasi procedura di LCM che include analisi trascrizionale, pulire tutte le superfici con RNAsi eliminando detergente per mitigare il rischio di contaminazione e degradazione del RNA. 
	Nota: Questo servizio di pulizia prevede l'area utilizzata per la colorazione, il cui tessuto è sezionato, criostato e la zona intorno al dispositivo di LCM.</li>
	<li>Recuperare il tessuto cerebrale da deposito e posto in un criostato raffreddato a -20 ° C. Consenti il cervello per equilibrare la temperatura della camera del criostato per ~ 10 min</li>
	<li>Posto sul lato ventrale del cervello su un foglio di garza sopra la fase del criostato. Con una lama di rasoio pulita, privo di RNasi, tagliato fuori la parte posteriore solo rostral al cervelletto (può essere salvato o eliminato) e la porzione appena anteriore al chiasm ottico (och).</li>
	<li>Mettere una piccola quantità di mezzo di taglio ottimale temperatura (OCT) in due cryomolds separati. Posizionare il cervello (contenente la corteccia frontale associazione (FrA) e il "nucleus accumbens core" (AcbC)) nel lato anteriore cryomolds giù. Aggiungere sufficiente OCT terreno per coprire il tessuto.
	<ol><li>Ripetere questo passaggio con il tessuto di cervello contenente l'ippocampo (Hp) e il nucleo soprachiasmatico (SCN).</li>
		<li>Consentire allo OCT a congelare completamente per ~ 20 min a criostato.</li>
	</ol></li> <li>Una volta che il tessuto e medie OCT sono completamente congelati, spremere una piccola quantità di ottobre su una testa di montaggio e premere il cryomolds congelati contenenti il tessuto sulla testa di montaggio. Consentire l'OCT a congelare completamente in modo che lo stampo contenente il tessuto sia fissato saldamente alla testa.</li>
	<li>Fissare l'attacco testa al Monte sezionamento e serrare la vite. Regolare l'angolo di taglio rispetto alla lama di criostato con le leve di regolazione per garantire sezioni sono tagliati in modo uniforme.</li>
	<li>Impostare lo spessore di sezione a 30 µm. Durante il taglio del blocco di tessuto contenente la FrA e AcbC, prima iniziare sezionamento fino alla corteccia cerebrale è apparente e poi inizio raccolta.</li>
	<li>Riferendosi alla 12 Rat Brain Atlas, sezione e raccogliere cervello sezioni inserendo delicatamente diapositive di temperatura in polietilene napthalate (PEN) membrana sopra il tessuto sezionato per la FrA fino la corteccia motoria secondaria (M2 ) viene raggiunta a Bregma 5.16 mm.
	<ol><li>Visivamente accerti l'aderenza a scivolare controllando se tessuto e OCT sono completamente fusa sulla diapositiva. Memorizzare tutti i vetrini con le sezioni di tessuto nel criostato fino a colorazione.</li>
	</ol></li> <li>Continuare sezionamento fino a quando la commessura anteriore (aca) diventa visibile e unisce in una completa commissura sotto i ventricoli laterali ora apparenti (LV) al Bregma 1,80 mm.</li>
	<li>Raccogliere sezioni fino il LVs appaiono per connettersi con l'aca presso Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Una volta di sezionamento per la FrA e AcbC completata, rimuovere il blocco di tessuto montato e sostituire con il blocco contenente HP e SCN.</li>
	<li>Sezione fino a quando il och è appiattito al Bregma-0,480 mm, quando il terzo ventricolo (3V) diventa apparente.</li>
	<li>Raccolta sezioni per il SCN da questo punto fino al Bregma-0,720 mm, quando inizia il decussation Sopraottico (sox). 
	Nota: Potrebbe essere necessario raccogliere ulteriori sezioni di tessuto in tutto il och come il SCN facilmente è passato sopra.</li>
	<li>Per la raccolta di HP, sezione fino a quando le corna della cellula del granello strato circonvoluzione dentata (GrDG) sono visibilmente evidenti a Bregma-3,000 mm.</li>
	<li>Raccolta sezioni fino a quando i sottocampi di CA hippocampal sono fusi nelle sezioni coronale Bregma-4,780 mm. Questo dettaglio permette di collezione completa dell'ippocampo sotto il sito craniotomy e lesioni. 
	Nota: Come dimostrato in precedenti pubblicazioni da questo laboratorio, più cellule lese sarà evidente all'interno di questa gamma ed è appropriato per l'analisi di espressione genica o microRNA.</li>
</ol> 2. Protocollo di colorazione <ol><li>Priore alla macchiatura, lavare tutte le stoviglie e l'area di colorazione in una cappa chimica con detergente RNasi-eliminando. Questa preparazione riduce il rischio di degradazione del RNA dovuto contaminazione.</li>
	<li>Preparare tutti i reagenti di colorazione e soluzioni a nucleasi acqua gratis.</li>
	<li>Prendere un rack di diapositive memorizzate nel criostato e posto nella cappa. Vetrini per scaldarle per 30 s. posto in colorazione soluzioni (preparati con acqua gratuita nucleasi) come segue: 75% EtOH per 1 min, nucleasi gratis acqua per 1 min, viola di cresyl 1% per 1 min, nucleasi acqua gratuita per 30 s, nucleasi acqua gratuita per 30 s , 95% EtOH per 30 s, 100% EtOH per 30 s, xilene per 3 min e xilene per 3 min.</li>
	<li>Consentire il rack asciugare all'aria per non più di 10 min a temperatura ambiente nella cappa. In alternativa, posizionare rack in un essiccatore sotto vuoto RNAsi-libera per l'asciugatura più veloce. Una volta essiccato, procedere immediatamente al LCM.</li>
</ol> 3. Stereotactic Atlas guidato Laser Capture Microdissection con il sistema di LCM <ol><li>prima di iniziare qualsiasi procedura di LCM per analisi di RNA, pulire l'area di raccolta e la zona intorno al dispositivo con RNAsi-eliminando detergente e 100% EtOH.</li>
	<li>Flip l'interruttore di alimentazione sul laser IR generando unità prima di accendere il microscopio base e consentire al sistema di inizializzare prima software viene avviato dal desktop. 
	Nota: Se non è stata completata in questo ordine, il software non riconosce il microscopio.</li>
	<li>Una volta che il software ha avviato ed eseguito attraverso i passi durante l'inizializzazione, premere il &#34; attuale fase &#34; pulsante del software &#34; Installazione pannello. &#34; il palco modulare si sposterà nella posizione dove LCM Macro tappi e diapositive possono essere caricati e scaricati.</li>
	<li>Porre i vetrini di membrana di penna nei supporti (fino a tre alla volta) con l'estremità smerigliata rivolta verso destra. 
	Nota: Se inserito nel supporto per l'orientamento errato, il software potrebbe non essere in grado di riconoscere correttamente l'area desiderata di taglio di IR o UV.</li>
	<li>Clic la &#34; Mem &#34; checkbox nella &#34; Cap e Area di movimentazione diapositiva &#34; accanto alla rispettiva diapositiva (cioè, A, B o C). Questo passaggio indica se la diapositiva è una lastra di vetro di membrana. Quindi fare clic sulla diapositiva desiderata per essere catturato prima.</li>
	<li>Per rendere la fotocamera prendere un'immagine affiancata per la posizione del tessuto e l'orientamento per i posizionamenti di tappo, selezionare &#34; immagine &#34; sulla barra degli strumenti e selezionare &#34; Acquire panoramica. &#34; 
	Nota: Se l'utente abbia familiarità con il tessuto viene raccolto, questo passaggio può essere omesso utilizzando la pallina di scorrimento manuale per posizionare la &#34; regione centro &#34; per la raccolta.</li>
	<li>Posizionare il cursore sopra l'area immagine affiancata (o posizione relativa senza immagini affiancate), fare clic destro e selezionare &#34; tappo posto alla regione centro. &#34; il software verrà automaticamente posto un tappo sopra la posizione selezionata.</li>
	<li>Selezionare un percorso. 
	Nota: Per assicurarsi che il laser IR è correttamente allineato e preleverà solo alcune aree dove i punti sono disposti dal software deve trovarsi prima di procedere.
	<ol>
		<li>Spostarsi in un'area nell'ambito della PAC dove nessun tessuto è presente. Fare clic su &#34; ho &#34; alla &#34; riquadro strumenti Microdissect &#34; e selezionare il &#34; IR Locate &#34; scheda. Nel riquadro del fuoco una IR scatto di prova per valutare quale sta sparando con il laser IR e la dimensione dello spot.</li>
		<li>Con il cursore, fate clic destro nel mezzo IR spot e selezionare &#34; trova IR Spot. &#34; 
		Nota: Dimensione e l'intensità del fascio IR può essere modificati modificando manualmente il &#34; potenza, diametro o durata &#34; sotto ogni identificatore di formato di punto o spostando la scala di scorrimento nella parte inferiore della finestra di dialogo. Alcuni scatti di prova potrebbero essere necessario essere licenziato per garantire la corretta dimensione di punto. Il laser IR deve essere ri-trovano ogni volta la posizione della PAC modifiche o diapositive sono commutati.</li>
		<li>UV per taglio, individuare il laser UV selezionando la &#34; UV Locate &#34; scheda nella finestra di dialogo. 
		Nota: Perché il laser UV e il laser IR si muovono all'unisono, non c'è nessuna necessità di continuamente ri-localizzare il laser UV ogni volta che viene modificata la posizione.</li>
	</ol></li> <li>Scegli la &#34; disegno a mano libera &#34; opzione nella &#34; selezionare riquadro strumenti &#34;. Utilizzando uno stilo di touchscreen, disegnare intorno al perimetro della regione di interesse facendo in modo di non perdere il contatto tra il touchscreen e la testa di stilo. Assicurarsi di collegare l'inizio e punti finali insieme. 
	Nota: Macchie IR saranno stabilite automaticamente attraverso il software, ma l'utente può scegliere di stabilire ulteriori punti per garantire il tessuto viene rispettato il tappo dopo aver eseguito il taglio UV.</li>
	<li>Collezione per FrA, eseguire un'acquisizione laser lordo del tessuto corticale fino a quando la corteccia M2 appare al Bregma 5.16 mm. 
	Nota: Questo dettaglio può essere modificato tale che vengono raccolti solo specifiche porzioni di Fra' o tipi cellulari specifici.</li>
	<li>Per AcbC raccolta, acquisizione laser un'area vicino in prossimità di aca. 
	Il nucleo e la shell del AcbC svolgono diverse funzioni e sono fisiologicamente unici. Pertanto è importante seguire l'Atlante del cervello più vicino possibile. Si raccomanda di raccogliere da no ulteriore passato bregma 0,84 mm, come i due sottoregioni diventano troppo strettamente associati con l'altro.</li>
	<li>Per Hp collezione, laser capture CA 1, 2 e 3 sottocampi hippocampal Bregma 3.00 mm e impiegando il GrDG completamente formata come un punto di riferimento fisico per l'identificazione morfologica. 
	Nota: Ai fini di questo studio, non raccogliere passato Bregma-4,780 mm, che può essere delimitata visivamente come punto quando i sottocampi di Hp sono fuse e punto ventralmente. Questa zona è stato scelto come più feriti i neuroni possono essere scoperti direttamente sotto il sito di lesione 6.</li>
	<li>Per la raccolta di SCN, in primo luogo identificare visivamente i nuclei densamente imballati che sedersi dorsale per il och e poi raccolgono.</li>
	<li>Dopo la raccolta delle regioni (sopra elencati), spostare LCM Macro tappi per la &#34; posizione QC &#34; e controllare e verificare che l'aderenza completa del tessuto garantendo visivamente UV tagliare il tessuto è attaccato alla membrana. Posizionare rapidamente il tappo ontoan RNAsi-libera provetta di reazione di murato sottile del 0,5 mL contenente 100 µ l di tampone di lisi delle cellule.</li>
	<li>Campioni di vortex brevemente per garantire lisi completa e conservare a-80 ° C. A questo punto, LCM può essere messo in pausa e campioni conservati fino a quando non utilizzato per l'analisi genomica a valle 6.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per gli studi molecolari del cervello dei mammiferi, LCM è diventata una tecnica essenziale. Questo articolo dimostra che usando la combinazione dei laser taglio IR e UV nel sistema LCM può catturare cambiamenti genomici in qualsiasi regione del cervello dei mammiferi. Queste regioni comprendono quelli identificabili con macchie di LCM-compatibile convenzionali, come la viola di cresyl o ematossilina ed eosina. La velocità del processo di laser-acquisizione e capacità di effettuare LCM su più spessa 30 µm sezioni su penna membrana diapositive permette di ottenere non solo una quantità sufficiente di campioni di cellule, ma anche per isolare il RNA dai campioni di LCM di qualità adatta per tutti i tipi di utilizzatori a valle analisi genomica; Queste analisi comprendono microarrays16, PCR matrici17e quantitativa PCR in tempo reale18.
I nostri dati forniscono una spiegazione razionale per gli studi che utilizzano il tessuto di LCM. Troviamo che miR-15b è upregulated nell'ippocampo e corteccia (Figura 4) ma downregulated nel nucleus accumbens e possono essere biologicamente rilevanti per la comprensione degli effetti differenziali di TBI nel cervello. Uno studio precedente suggerito che aumenti di vulnerabilita ' neuronale corticale alla ferita da sovraespressione di diversi Mirna che regolano negativamente il pro-sopravvivenza dei geni, quali Bcl-219. Destinazione scansione analisi spettacoli Bcl-2 è anche regolata da miR-15b; così, i nostri dati suggeriscono una spiegazione meccanicistica per perché regioni specifiche del cervello (cioè, FCx) possono essere selettivamente vulnerabili a TBI. È importante ricordare la maggior parte dei geni sono regolati da Mirna multiple e correlare cambiamenti in qualsiasi uno miRNA ad un gene specifico obiettivo è difficile. Inoltre, questi dati indicano che alcuni cambiamenti nell'espressione genica e microRNA possono essere usati come biomarcatori di danno di cervello di regione-specific. Infatti, stiamo attualmente utilizzando questi dati negli studi di neuroprotective come nuovi composti con proprietà Antidepressive differenzialmente possono influenzare espressione genica e microRNA in regioni del cervello collegata a disturbi neuropsichiatrici. Una limitazione del nostro studio è che durante i passaggi più procedimenti di preparazione di diapositiva per LCM, può diventare compromessa l'integrità del RNA. Questo protocollo descrive le misure necessarie per ridurre il rischio di degradazione del RNA. Un'altra limitazione è la dimensione del campione relativamente piccolo usata per il calcolo statistico. In futuro gli studi, aumentando la dimensione del campione dovrebbero diminuire gli effetti delle variazioni di espressione genica e miRNA tra singoli animali.
Il beneficio di LCM è realizzato negli studi di genomici traslazionali utilizzando modelli animali di malattie umane e tessuti malati20,21,22,,23. Senza la capacità di catturare le popolazioni delle cellule specifiche, i profili trascrizionali di regioni differenti del cervello sarebbe un mix inconoscibile e indecifrabile di molti tipi delle cellule. Utilizzando metodi di LCM negli studi di lesione cerebrale ha portato a attuali sforzi per delineare biomarcatori specifici di regione del cervello e capire come essi correlare con biomarcatori di TBI in circolazione.

Il cervello dei mammiferi è notevolmente complesso ed eterogeneo con centinaia di migliaia di tipi delle cellule1. Infatti, gli studi umani hanno dimostrato che in regioni come la corteccia frontale, strutturali e funzionali differenze nella materia bianca e grigia si riflettono nelle distinte e divergenti profili trascrizionali2. Eterogeneità di cervello è stato dei principali ostacoli per interpretare i dati di espressione genica e nel campo del trauma cranico. Questa ambiguità negli studi preclinici ha successivamente portato a centinaia di studi clinici non riuscite dei trattamenti per lesioni di cervello3.
Utilizziamo metodi laser capture microdissection (LCM) per studiare la ferita di cervello traumatica (TBI)-indotto disregolazione genica in ratto cervello4, concentrandosi sull'ippocampo, una regione del cervello che è essenziale per l'apprendimento e la memoria5. La capacità di cattura del laser e analizzare l'espressione genica sia morire che sopravvivere neuroni ci dà una maggiore comprensione del ruolo della variabilità stocastica nell'espressione genica nella determinazione del risultato (sopravvivenza neuronale) dopo TBI6. Tecniche di LCM si sono anche dimostrati utili per esplorare gli effetti di TBI a neuroni ippocampali quando si confrontano giovani e invecchiamento topi ratti o7 8.
In studi recenti, abbiamo esaminato altre regioni del cervello del ratto negativamente influenzato da TBI, con un focus sulle aree in ratti ed in pazienti TBI umani che sono associati con funzione esecutiva (cioè corteccia frontale9) e comorbidità TBI; Queste comorbidità includono depressione (cioè nucleo accumbens10) e disturbi del ritmo circadiano (di nucleo suprachiasmatic11). In studi precedenti, Huusko e Pitkanen12 e Drexel et al. 13 utilizzato LCM per esaminare l'espressione genica nel talamo e ipotalamo. Il nostro studio si basa su queste osservazioni precedenti e comprende quattro altre regioni del cervello. Per studiare i cambiamenti di regione-specific molecolari indotti dopo TBI, era necessario ottenere la competenza nell'individuare e ottenere tipi di cellule in queste regioni utilizzando un sistema di LCM. I laser di taglio UV e infrarossi (IR) consentono microdissection precisa di regioni cerebrali desiderata. Qui, descriviamo come utilizziamo questo sistema di LCM, guidato da coordinate stereotassiche nel ratto cervello Atlante14, per identificare e laser cattura quattro regioni del cervello del ratto differenzialmente sono interessati dal metodo di lesione sperimentale del cervello fluido-percussioni 4.

<table><tbody><tr><td>Sistema di microdissezione a cattura laser Arcturus</td><td>Biosistemi applicati (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent 6000 Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini a membrana Arcturus PEN&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xilene (Grado istologico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (Grado istologico)</td><td>UTMB Farmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atlas-guida stereotassica del laser capture microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

La possibilità di isolare le regioni specifiche del cervello di interesse può essere impedita in tecniche di dissociazione del tessuto che non conservano la loro distribuzione spaziale. Tali tecniche inclinare anche potenzialmente analisi dell'espressione genica, perché il processo stesso può alterare i modelli di espressione in singole celle. Qui descriviamo un metodo di laser capture microdissection (LCM) per raccogliere in modo selettivo regioni specifiche del cervello colpite dalla ferita di cervello traumatica (TBI) utilizzando un Nissl modificate (viola di cresyl) che macchia protocollo e la Guida di un Atlante del cervello del ratto. LCM fornisce l'accesso a regioni del cervello nelle loro posizioni nativi e la possibilità di utilizzare reperi anatomici per l'identificazione di ogni regione specifica. A tal fine, LCM è stato utilizzato in precedenza per esaminare l'espressione di specifici geni di regione del cervello in TBI. Questo protocollo permette l'esame delle alterazioni indotte da TBI nell'espressione genica e microRNA in aree cerebrali distinte all'interno dello stesso animale. I principi del presente protocollo possono essere modificati e applicati a una vasta gamma di studi che esaminano l'espressione genomica in altre malattie e/o modelli animali.

Lo schema presentato nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro complessivo di Atlante guidato LCM di regioni specifiche del cervello e le potenziali applicazioni di analisi a valle. Questo studio si è concentrato su quattro regioni del cervello pertinenti alla patofisiologia TBI e allo sviluppo di comorbilità: FrA, AcbC, SCN e Hp. Una limitazione presente in LCM di regioni specifiche del cervello è che localizzazioni anatomiche sono spesso oscurate da una mancanza di confini definiti, come si può vedere in Figura 2 (A, D, G, J). L'uso di un Atlante del cervello per guidare il sezionamento e acquisizione di specifiche regioni del laser riduce la possibilità di contaminazione del campione con regioni del cervello diverso da quello di destinazione. Quando la cura è presa per seguire i punti di riferimento del tessuto, sia durante il sezionamento e dopo la colorazione di Nissl, tecnologia di LCM è in grado di fornire un mezzo altamente coerenza per l'acquisizione di discrete popolazioni di cellule, i nuclei o regioni15. Gli obiettivi a lungo termine di questi studi sono di identificare geni e microRNA che potenzialmente possono fungere da surrogato, biomarcatori non invasivi regione specifici della ferita di cervello. Il primo passo in questa pipeline di sviluppo di biomarcatore è la caratterizzazione delle modifiche trascrizionali tessuto-specifica dopo TBI sperimentale. Questi dati quindi possono essere correlati con i cambiamenti indotti da lesione in biofluidi di circolazione.
Le procedure presentate sono state ottimizzate per ridurre i rischi di degradazione di RNA al fine di consentire l'analisi del RNA tramite trascrizione inversa di RNA totale di LCM prima PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). RNA totale (comprese le piccole e grandi specie di RNA) è stato isolato utilizzando un metodo di isolamento basati su colonna sul tessuto che è stato catturato a laser da diverse regioni del cervello. Per valutare l'integrità del RNA, la qualità e quantità dopo procedure di isolamento, campioni del RNA erano brevemente denaturati a 70 ° C ed eseguire su un analizzatore di RNA. Misure qualitative incluso analizzando le ampiezze di picco delle bande rRNA 18s e 28s (Figura 3), che può essere rappresentante di degrado globale e utilizzando il "RNA integrità numero" (RIN). Se utilizza tecniche di RNAsi-libera attenta, RNA isolato dai campioni di LCM in genere risultati in RINs che vanno da 6-8. Un RIN inferiore può implicare la scarsa qualità di RNA e potenzialmente può diminuire la precisione dell'analisi di espressione genica e microRNA. Al contrario, un RIN superiore può migliorare la fiducia nella validità dei risultati ottenuti dall'analisi di RNA.
RT-qPCR è stato effettuato usando set di primer/sonda per singoli geni e microRNA (Figura 4). Circa 1 ng di RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA e pre-amplificate prima qPCR è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. Geni correlati alla lesione valutati in questo studio includevano BCL2 associati X, regolatore di apoptosi (Bax), B-cellula CLL/linfoma 2 (Bcl-2), caspasi 3, Apoptosis-Related cisteina peptidasi (Casp3) , Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) e CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). MiR-15b è stato scelto perché è stato dimostrato essere alterato dopo TBI sperimentale in singoli neuroni morenti. Anche sperimentalmente ha convalidato e bioinformatically predetto geni bersaglio con funzioni di pro-sopravvivenza (dati non pubblicati). Piega-modifica normalizzata coefficienti sono stati calcolati dal metodo ΔΔCt confrontando i livelli di espressione genica e microRNA in TBI animali e controlli ingenuo, con normalizzazione di un gene endogeno (Gapdh) o piccolo RNA (U6), rispettivamente. Un cambiamento di piega superiore a 1 indica un upregulation complessivo in quel gene o microRNA, e al contrario, una piega inferiore a 1 indica un downregulation cambiare. Analisi statistica ha mostrato cambiamenti significativi nell'espressione genica tra controllo TBI e ingenuo (p ≤ 0,05) che dipendevano la regione del cervello. Nessun cambiamento significativo nell'espressione di miR-15b sono stato rilevato tra il controllo TBI e ingenuo, ma c'erano tendenze verso l'espressione più alta e più bassa in un modo dipendente dalla regione di cervello. Questi dati suggeriscono che l'ulteriore ottimizzazione è necessario per valutare i cambiamenti nell'espressione dei microRNA. È anche possibile che la dimensione del campione era troppo piccola per ottenere la significatività statistica, in parte a causa della variabilità intrinseca nell'espressione. Gli studi futuri includeranno animali falsità-azionati per garantire quel gene e cambiamenti di espressione di microRNA sono attribuiti a TBI e non a causa della preparazione chirurgica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Figura 1. Flusso di lavoro di LCM Atlas-guida per l'analisi genomica a valle. (A-F) Procedure da animale preparazione all'analisi qPCR a valle: (A) adulto, maschi ratti Sprague Dawley (~ 6 settimane di età e peso 300 g) sono anestetizzati, sottoposti a percussione fluida TBI e umanamente eutanasizzati 24 h dopo la lesione. (B) sezioni di serie (30 µm) dei cervelli congelati freschi sono basate sulle coordinate delle regioni specifiche del cervello (FrA, AcbC, Hp, SCN) da Paxinos e di Watson The Rat Brain atlas. (C) sezioni sono fisse, macchiato di Nissl (1% Cresyl Violet), disidratati ed essiccato all'aria. (D). LCM eseguita su identificato regioni del cervello con un sistema di LCM. (E) LCM Macro tappi trasferito su un tubo di 0,5 mL RNAsi-libera con 100 μL di tampone di lisi cellulare e conservati a-80 ° c fino a isolamento del RNA per l'analisi genomica a valle. RNA può allora essere retrotrascritto per l'analisi di RT-qPCR gene o microRNA esaminare l'espressione differenziale di target molecolari dopo TBI e/o tra regioni del cervello di interesse (F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Figura 2. LCM di TBI colpite regioni del cervello. Funzioni del sistema di LCM laser immagini rappresentative delle sezioni di tessuto raccolti dal lato ipsilateral del sito di lesione con IR e UV (A-I). Tessuto è stato sezionato un criostato (30 µm) e raccolti sulla penna membrana diapositive. Sezioni sono state poi fissi e Nissl-macchiato con la viola di cresyl (1%) e disidratato per identificare regioni specifiche del cervello basate su punti di riferimento anatomici a cui fa riferimento Paxinos e di Watson The Rat Brain Atlas. (A-C) Un'area della corteccia frontale associazione (FrA) (D-F) componenti degli strati piramidali CA1, CA2 e CA3 dell'ippocampo (Hp) situato vicino le corna completamente formate dello strato del granello di circonvoluzione dentata (GrDG). (G-I) Un'area del nucleo accumbens coRe (AcbC) prossimale e rostral al commissure anteriore (aca). (J-K) Nucleo soprachiasmatico (SCN) rostrale al chiasm Sopraottico (och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Figura 3. Rappresentante scansioni di qualità RNA. Rappresentante elettroferogrammi e gel associate immagini di RNA derivato da LCM raccolti del tessuto (A-D). Elettroferogrammi e gel associato immagini mostrano RNA intatto sulla comparsa di picchi di rRNA 18s e 28s e bande di gel di base. Questo RNA è adatto per tutte le applicazioni a valle, tra cui genomica e proteomica analisi. Corteccia di associazione frontale (A) (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) ippocampo (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) nucleo accumbens del nucleo (AcbC) RNA. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic (SCN) nucleo RNA. RIN 7,6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Nella figura 4. Analisi a valle del Gene di regione-specifico del cervello e di espressione dei MicroRNA tramite RT-qPCR. RT-qPCR individuali per geni di interesse (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) e microRNA d'interesse (miR-15b) è stato effettuato su regioni del cervello laser catturato dopo TBI (Hp e AcbC n = 5, FrA n = 4) e confrontato agli animali di ingenuo illeso (n = 4). Analisi di geni correlati alla patogenesi TBI è stata eseguita per Hp, AcbC, FCx. dati viene presentato come un rapporto di cambiamento piega normalizzato rispetto alle regioni del cervello di ingenuo controllo (test t spaiato con correzione ± di Welch SEM; * p ≤ 0.05) (A). Espressione differenziale di miR-15b in differenti regioni del cervello si presenta come piega normalizzato modifiche rispetto al controllo ingenuo (± SEM) (B). Dati da SCN (n = 2) non inclusa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo l'uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l'analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di microdissezione laser è raccogliere cellule da specifiche aree cerebrali colpite da lesione cerebrale traumatica per l'analisi molecolare. Sono la dottoressa Helen Hellmich. Il mio assistente laureando, Harris Weisz, studente del programma di Fisiopatologia Umana e Medicina Traslazionale presso la University of Texas Medical Branch, mostrerà come utilizziamo i metodi di microdissezione laser nei nostri studi sulle lesioni cerebrali.Questo metodo potrebbe contribuire a chiarire i meccanismi e le conseguenze dei cambiamenti indotti dal TBI in regioni cerebrali distinte, come la corteccia frontale, che controlla le funzioni esecutive, e l'ippocampo, che è importante per i processi dipendenti dalla memoria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo studiare l'effetto di un processo patologico su molteplici regioni cerebrali distinte o su specifici tipi cellulari provenienti dallo stesso cervello.Prima di qualsiasi procedura di LCM che includa l'analisi trascrizionale, pulire tutte le superfici con detergente RNase eliminator per ridurre al minimo il rischio di contaminazione e degradazione dell'RNA. Recuperare il tessuto cerebrale dallo stoccaggio e collocarlo in un criostato raffreddato a meno 20 gradi Celsius.Lasciare che il cervello si equilibri alla temperatura della camera del criostato per circa dieci minuti. Posizionare il cervello, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, su un foglio di garza posto sopra la piattaforma del criostato. Con una lametta RNA pulita, recidere la porzione posteriore appena a livello rostrale rispetto al cervelletto e la porzione appena anteriore rispetto al chiasma ottico.Collocare una piccola quantità di mezzo OCT (optimal cutting temperature) in due stampi criogenici separati. Posizionare il cervello contenente la corteccia frontale associativa e il nucleo accumbens nel primo stampo criogenico, con la superficie interna rivolta verso il basso. Aggiungere mezzo OCT in quantità sufficiente a coprire il tessuto.Ripetere questo passaggio con il frammento di tessuto cerebrale contenente l'ippocampo e il nucleo soprachiasmatico. Lasciare solidificare completamente il mezzo OCT per circa 20 minuti nel criostato. Una volta che il tessuto e il mezzo OCT sono completamente congelati, premere una piccola quantità di OTC su una testa di montaggio.Premere uno stampo criogenico congelato sulla testa di montaggio e lasciare che l'OCT si congeli completamente, in modo che lo stampo contenente il tessuto sia saldamente fissato alla testa. Fissare l'attacco della testa al supporto di sezionamento e serrare la vite. Regolare l'angolo di taglio rispetto alla lama del criostato mediante le leve di regolazione, per garantire che i tagli siano uniformi.Impostare lo spessore della sezione a 30 micron. Durante il taglio del blocco di tessuto contenente l'ippocampo e il SEN, procedere fino a quando il chiasma ottico risulta appiattito a bregma 0,48 millimetri, quando il terzo ventricolo diventa visibile. A questo punto, raccogliere le sezioni per il SEM posizionando delicatamente sul tessuto sezionato vetrini rivestiti con membrana di polietilene naftalato a temperatura ambiente.Verificare visivamente l'adesione al vetrino confermando che il tessuto e l'OTC sono completamente fusi sul vetrino. Conservare tutti i vetrini con sezioni di tessuto nel criostato fino alla colorazione. Interrompere la raccolta delle sezioni al bregma 0,72 millimetri, quando inizia la decussazione sopraottica.Per il prelievo dell'ippocampo, procedere con le sezioni fino a quando i corni dello strato delle cellule granulari del giro dentato risultano visibili a bregma 3,00 millimetri. Raccogliere le sezioni fino a quando i sottocampi CA dell'ippocampo risultano fusi nelle sezioni coronali a bregma 4,78 millimetri. Ciò consente un prelievo completo dell'ippocampo sotto la craniotomia e la sede della lesione.Prima della colorazione, lavare tutti i vetri e l'area di colorazione in una cappa chimica con un detergente eliminatore di RNasi. Prelevare il portavetrini dal criostato e posizionarlo nella cappa. Lasciare che i vetrini si riscaldino per 30 secondi.Colorare i preparati con violetto di cresile e depurare con soluzione salina. Lasciare asciugare all'aria il portapreparati con i vetrini colorati per non più di dieci minuti a temperatura ambiente nella cappa. Una volta asciutti, procedere immediatamente alla LCM.Prima di iniziare qualsiasi procedura di LCM per l'analisi dell'RNA, pulire l'area di raccolta e la zona circostante il dispositivo con un detergente eliminatore di RNAasi e alcol al 100%. Accendere l'interruttore di alimentazione dell'unità generatrice di laser a infrarossi prima di accendere la base del microscopio e attendere che il sistema si inizializzi prima di avviare il software dal desktop. Una volta avviato il software e completati i passaggi di inizializzazione, aprire il pannello di configurazione del software e premere il pulsante per posizionare la piastra.La piattaforma modulare si sposterà nella posizione in cui è possibile caricare e scaricare le capsule macro per microdissezione laser e i vetrini. Posizionare fino a tre vetrini con membrana a penna nei supporti, con il bordo smerigliato rivolto verso destra. Selezionare l'area di gestione delle capsule e dei vetrini accanto al vetrino corrispondente e fare clic sulla casella di controllo MEM per indicare al software che sono stati caricati vetrini in vetro con membrana.Quindi fare clic sulla diapositiva desiderata da acquisire per prima. Per acquisire un'immagine affiancata per la localizzazione e l'orientamento del tessuto ai fini del posizionamento dei cappucci, selezionare l'immagine sulla barra degli strumenti e scegliere acquisisci panoramica. Posizionare il cursore sull'area nell'immagine affiancata, fare clic con il tasto destro e selezionare posiziona cappuccio al centro della regione.Il software posizionerà automaticamente un cappuccio sulla posizione selezionata. Dopo aver localizzato i laser infrarosso e UV, selezionare l'opzione di disegno a mano libera nel riquadro degli strumenti di selezione. Utilizzando uno stilo per schermo tattile, disegnare lungo il perimetro della regione di interesse assicurandosi di non perdere il contatto tra lo schermo tattile e la punta dello stilo.Assicurarsi di collegare i punti iniziali e finali. Per il campionamento dell'ippocampo, utilizzare il microdissezione laser per raccogliere le regioni ippocampali CA1, CA2 e CA3 a partire da bregma a 3,00 millimetri, usando lo strato granulare completamente formato del giro dentato come riferimento anatomico per l'identificazione morfologica. Dopo il campionamento, spostare i tappi macro del LCM nella posizione di controllo qualità (QC) ed esaminare l'adesione completa del tessuto verificando visivamente che il tessuto tagliato con raggi UV sia attaccato alla membrana.È imperativo che il laser UV tagli lungo l'intero perimetro del tessuto. Il mancato rispetto di questa procedura comporterà un'adesione incompleta del tessuto al cappuccio per microdissezione laser (LCM). Successivamente, posizionare rapidamente ogni cappuccio in un tubo da reazione da 0,5 millilitri privo di RNasi e con pareti sottili, contenente 100 microlitri di buffer per la lisi cellulare.Vortexare brevemente i campioni per assicurare un completo lisato e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi genomica successiva. Di seguito sono riportate immagini rappresentative di sezioni di tessuto prelevate dal lato epi laterale del sito di lesione, ottenute mediante le funzioni laser a infrarossi e ultravioletti del sistema LCM. Questa è un'area della corteccia associativa frontale.Questa immagine mostra la stessa regione dopo il prelievo. E questo è il tessuto sul cappuccio dopo il prelievo. Questa immagine mostra i componenti degli strati parameatali CA1, CA2 e CA3 dell'ippocampo situati accanto ai corni completamente formati dello strato granulare del giro dentato.Le regioni CA2 e CA3 sono state raccolte e queste popolazioni cellulari sono visibili sul cappuccio. Qui, un'area del nucleo accumbens core prossimale e adrostrale alla commessura anteriore è stata mirata e riprodotta fedelmente sul cappuccio. Infine, il nucleo soprachiasmatico rostrale rispetto al chiasma sopraottico è stato isolato mediante microdissezione laser dopo trauma cranico.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per processare un cervello in circa otto ore. Ciò include il processamento del tessuto, la colorazione e la LCM. Dopo questa procedura, altri metodi, come l'analisi epigenetica, possono essere eseguiti per rispondere a domande riguardanti i profili di metilazione o l'espressione di micronic.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come eseguire la LCM su più regioni cerebrali dello stesso cervello.

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Fonte: Furmanski, O., et al. Modello di impatto corticale controllato di lesione cerebrale di topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2019)In questo video, le cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo vengono iniettate stereotassicamente nel confine tra materia grigia e materia bianca della corteccia profonda in un modello murino di lesione cerebrale traumatica. Le cellule...

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Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

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