Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è misurare il rilascio di neurotrasmettitori in animali svegli. Sebbene questo video dimostri l'applicazione alle neuroscienze comportamentali, con la capacità di caratterizzare il rilascio di specifici neurotrasmettitori, in relazione a specifici eventi comportamentali, questa tecnica può essere impiegata in una varietà di altre sottodiscipline delle neuroscienze, come l'iniezione di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua natura chiavi in mano per misurare il rilascio quasi in tempo reale di neurotrasmettitori in vivo.

Inizia iniettando 500 microgrammi di progesterone in 0,1 millilitri di olio di semi di cotone, per via sottocutanea, quattro ore prima dell'introduzione del maschio per indurre la ricettività sessuale. Assicurati di testare ogni animale all'inizio della fase di buio del loro ciclo quotidiano, poiché i comportamenti sociali dei roditori sono soggetti ad alterazioni in condizioni di test con luce bianca e luce rossa. Preparare le soluzioni di calibrazione fresche il giorno del test in provette da centrifuga di vetro da 20 millilitri.

Per la soluzione dell'analita, sciogliere 7,4 milligrammi di acido L-glutammico in 10 millilitri di acqua ultra pura capovolgendo delicatamente la provetta. Quindi, preparare la soluzione di interferenza sciogliendo 176,1 milligrammi di AA in 10 millilitri di acqua ultra pura. Impostare la calibrazione posizionando un agitatore magnetico sulla base di un supporto per anelli da laboratorio di base.

Posizionare un becher incamiciato da 20 millilitri sopra l'agitatore magnetico e bloccare in posizione utilizzando un morsetto medio a due punte. Collegare il becher incamiciato a un bagnomaria circolante per riscaldare la soluzione tampone a 37 gradi Celsius. Aggiungere un'ancoretta magnetica e 20 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato da 100 millimolari, o PBS, nel becher incamiciato.

Quindi, posizionare il supporto di calibrazione del sensore sulla parte superiore del becher incamiciato e posizionare un preamplificatore di calibrazione a quattro canali sulla parte superiore, fissandolo in posizione utilizzando un morsetto ad angolo retto. Quindi, collegare il preamplificatore a un dispositivo di condizionamento e acquisizione dati per registrare i dati di calibrazione. Testare la sensibilità di ciascun biosensore enzimatico al glutammato prima della registrazione sperimentale posizionando la sonda nel supporto di calibrazione, sopra un becher incamiciato, immergendo la cavità di rilevamento e una parte del filo di riferimento del cloruro d'argento nella soluzione tampone.

Avvia una nuova registrazione sull'interfaccia del computer utilizzando il software di acquisizione scaricabile gratuitamente. Quindi, collegare ciascun sensore da testare a una porta su un preamplificatore di calibrazione a quattro canali. Consentire ai sensori di raggiungere una linea di base stabile.

Iniziare ad aggiungere le iniezioni dell'analita quando i sensori hanno raggiunto una linea di base stabile. Utilizzare il foro nel supporto di calibrazione per introdurre una punta di pipetta nella soluzione tampone. Quindi, utilizzare lo strumento di annotazione rapida dei tasti nel software di registrazione per annotare quando viene effettuata un'iniezione.

Successivamente, effettuare 10 iniezioni micromolari di glutammato pipettando 40 microlitri della soluzione di analita nella soluzione tampone. Attendere che il sensore si stabilizzi tra un'aggiunta e l'altra. Quindi, aggiungere tre iniezioni di soluzione di analita prima di aggiungere una singola iniezione dalla soluzione di AA interferente.

Rivestire la camera di prova con lettiere prese dalla gabbia di casa dell'animale. Rimuovere l'obduratore occlusivo dalla cannula guida e inserire l'elettrodo in fibra di carbonio o la sonda enzimatica attraverso l'albero di guida. Collegare il sensore al sistema di registrazione.

Quindi stabilizzare il collegamento del sensore avvitando un attacco a perno sul supporto della testa. Quindi, posizionare l'animale nella camera di prova. Iniziare a registrare il segnale amperometrico video e temporizzato nel programma software.

Lasciare che il sensore si equilibri nel cervello prima dei test sperimentali. Quindi, introdurre uno stimolo maschile nella camera di prova. Dopo la prima montatura con inserimento del pene da parte del maschio stimolante, continuare la registrazione per altri 10-30 minuti, a seconda degli obiettivi sperimentali.

Infine, dopo il test comportamentale, scollegare il sensore femmina. Rimuovere entrambi i criceti dalla camera di prova, così come la lettiera, per pulire la camera utilizzando etanolo al 70%. Inizia visualizzando e annotando i video, utilizzando un software scaricabile gratuitamente in commercio, al rallentatore per codificare con precisione i comportamenti legati al tempo al segnale amperometrico.

Annotare la lordosi iniziale nell'inquadratura quando la femmina inizia una dorsiflessione della schiena e devia la coda verso l'alto. Annotare la fine della lordosi quando la femmina termina questa postura, che spesso si verifica quando la femmina si riadatta in un'altra posizione nella camera di prova. Quindi, annota Start AI quando la femmina è in posizione di lordosi e il maschio muove il muso verso la regione anogenitale della femmina, dove può verificarsi annusare, leccare o strofinare la sua regione perineale.

Annota End AI quando il maschio rimuove il muso dalla vicinanza alla regione anogenitale della femmina. Quindi, annota Start Mount quando il maschio si avvicina e posiziona le zampe anteriori sulla femmina in una posizione di montaggio, indipendentemente dall'orientamento del tentativo di montaggio. Allo stesso modo, annota Inizia intromissione quando la spinta riuscita ottiene l'accesso del pene maschile montato alla vagina della femmina.

Quando applicabile, annota l'eiaculato, che può essere notato da un movimento di calpestio con la zampa posteriore del maschio. Infine, annota contemporaneamente End Intromission e End Mount nell'inquadratura quando il maschio ha rimosso le due zampe anteriori e quindi non ha alcun contatto con la femmina. A causa della frequente incapacità di visualizzare il suo ritiro, codificare contemporaneamente questi due comportamenti per consentire coerenza e affidabilità tra gli incontri di accoppiamento.

Nella scheda file, selezionare la funzione Esporta e scegliere la scheda TSV per salvare le misurazioni della tensione come file di estensione TSV. Apri ogni file con un programma per fogli di calcolo e salvalo come XLS/XLSX. Infine, aggiungi manualmente le annotazioni per l'inizio dell'incontro di preaccoppiamento lordosi nello stesso momento in cui inizia il comportamento della lordosi che include anche un comportamento di montatura, e anche all'inizio di un nuovo incontro di accoppiamento se la femmina rimane nella postura della lordosi.

Durante gli attacchi di accoppiamento, la transitorietà dopaminergica nel nucleo incombente si verifica durante l'inserimento vaginale, o intervallo, da parte del maschio. Un modello simile è stato osservato in altri animali per quanto riguarda il rilascio di glutammato. Con una rapida transitorietà che corrisponde a singoli intervalli nel nucleo dorsale accumbens durante un attacco copulatorio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica, esclusi gli interventi chirurgici sterotattici preparatori, può essere completata in un giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che ogni sensore sia funzionante. Sebbene questo video dimostri la registrazione di una singola sonda, questo approccio può essere esteso alla doppia registrazione simultanea.

Ma questo aggiunge un livello di complessità non banale. Questo video è dimostrato in condizioni di luce per una facile visibilità. Tuttavia, conduciamo i nostri esperimenti comportamentali in condizioni di oscurità e questo parametro può essere modificato a seconda delle specifiche esigenze sperimentali.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la successiva analisi istologica delle fette di cervello, al fine di identificare e confermare l'esatto posizionamento del sensore. Inoltre, è possibile eseguire ulteriori analisi dei dati, utilizzando i dati comportamentali codificati, per quanto riguarda i parametri di interesse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare il rilascio di neurotrasmettitori, compresi i neurotrasmettitori non elettroattivi come il glutammato in tempo quasi reale negli animali svegli

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come calibrare le sonde glutammatergiche, impiantare sonde, eseguire un esperimento comportamentale che misura i cambiamenti nel rilascio di neurotrasmettitori in diversi componenti del comportamento e codificare tali dati per l'analisi successiva. Non dimenticare che quando lavori con animali vivi devi essere sensibile al loro comfort e al loro benessere generale per garantire i migliori risultati e quelli degli animali