Name: Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri come misurare il rilascio di dopamina e glutammato in criceti siriani femmine durante comportamenti riproduttivi naturali. Questa tecnica di amperometria offre alta risoluzione temporale per studiare la neurobiologia del comportamento.

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Gli autori vorrei ringraziare universitari Daniel Korus per il suo aiuto in esecuzione il codice Matlab e undergraduate Alex Boettcher per la sua assistenza nell'esecuzione di esperimenti comportamentali. Questo progetto è sostenuto da NSF IOS 1256799 a R.L.M. e dall'Istituto nazionale su abuso di droga dei National Institutes of Health, sotto Premio numero T32DA007234.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se relativamente semplice, alcuni problemi possono sorgere quando si impiegano questa tecnica. In primo luogo, il posizionamento delle sonde stereotassica deve essere preciso: a differenza di microdialysis che campiona un raggio più ampio del milieu extracellulare che circonda la sonda, questa tecnica permette solo la misura di un neurotrasmettitore che entra in contatto diretto con la sonda. In secondo luogo, nel caso la registrazione di fibra di carbonio, a causa della piccola larghezza di fibra, può verificarsi ...

La capacità di misurare il rilascio di neurotrasmettitori in animali svegli comportamento permette ai ricercatori di collegare comportamenti specifici con i modelli spaziali e temporali di neurotrasmissione-un potente strumento per indagare i meccanismi e circuiteria sottostante sia naturale e comportamenti operanti in tempo reale. Storicamente, il microdialysis è stato impiegato per misurare sostanze sia elettricamente reattivi e non reattivi nell'ambiente extracellulare del cervello1. Questa tecnica utilizza un flusso continuo di una soluzione acquosa di composizione ionica simile al liquido extracellulare, attraverso una sonda di microdialysis composta da un piccolo albero con una punta di una membrana semipermeabile fibra cava2. Dopo l'inserimento della sonda, neurotrasmettitori o altri analiti di interesse possono attraversare la membrana semipermeabile con la diffusione passiva prima di essere raccolti a intervalli per la successiva analisi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), un chimica analitica tecnica comunemente utilizzata per separare, identificare e quantificare i componenti in una miscela eterogenea3.
Anche se il microdialysis è una tecnica sensibile che può essere utilizzata per misurare praticamente qualsiasi analita di interesse, la risoluzione temporale è bassa, con frequenze di campionamento massima dell'ordine di minuti a decine di minuti1,2. L'invenzione della scansione rapida voltammetria ciclica (FSCV), una tecnica che si basa sul potenziale redox di specie elettroattivi, può delucidare vicino istantanee concentrazioni dell'analita di interesse nel liquido extracellulare. In breve (Vedi Robinson et al. 4 per una vasta revisione), un elettrodo è applicato per alzare e abbassare la tensione in una moda onda triangolare su una scala di tempo veloce4. Quando la tensione è nell'intervallo corretto, il composto di interesse ripetutamente è ossidato e ridotto. Questa ossidazione e riduzione si traduce in un movimento di elettroni che crea una piccola corrente alternata. Scansione tariffe avvengono sulla scala di frazioni di secondo con ossidazione e riduzione dei composti che si verificano in microsecondi. Sottraendo lo sfondo corrente creato dalla sonda dalla corrente risultante, uno può generare una tensione vs attuale trama unica per ogni composto. Poiché la scala temporale delle oscillazioni della tensione è conosciuta, questi dati possono essere utilizzati per calcolare un complotto della corrente in funzione del tempo. Così, le concentrazioni relative del composto possono essere determinate, purché il numero di elettroni trasferiti in ogni ossidazione e reazione di riduzione è nota4.
Questa specificità chimica ed elevata risoluzione temporale fare FSCV una potente tecnica per la rilevazione cambiando concentrazioni chimiche in vivo. Tuttavia, nonostante questi molteplici vantaggi, questa tecnica richiede ampie competenze tecniche e attrezzature costose e installazione. Ulteriormente, i neurotrasmettitori nonelectroactive (ad es., glutammato) non possono essere misurati utilizzando questa tecnica. Fortunatamente, i progressi tecnologici nel campo della elettrochimica5, come pure la commercializzazione di queste invenzioni, ha introdotto un approccio relativamente semplice per misurare non-elettroattivi neurotrasmettitori in animali comportamento svegli senza compromettere temporale precisione-una tecnica nota come tecnologia dei biosensori enzimatici. Questa tecnica utilizza la conversione enzimatica del neurotrasmettitore nonelectroactive di interesse nei due substrati, uno dei quali è il perossido di idrogeno elettroattivi viene rilevato come un'ossidazione amperometrici corrente generata da un potenziale applicato5 . Biosensore commercialmente disponibili sonde (vedere Figura 1) selettivamente misurano analiti di interesse competitivo riducendo il contributo di interferenti endogeni. Nel caso di glutammato, il contributo di comune interferent acido ascorbico (AA) competitivo viene ridotto alla corrente misurata di co-localizzazione di ossidasi AA sulla superficie enzimatica attiva del sensore, conversione AA in non-elettroattivi dihydroascorbate e acqua. Inoltre, uno strato di polimero Nafion caricato negativa presente sotto lo strato di enzima esclude composti anionici endogeni.
Questa stessa impostazione sperimentale di biosensore in grado di misurare elettroattivi neurotrasmettitori come in FSCV, ma invece impiega un potenziale fisso registrazione6. In contrasto con la tensione oscillante applicata in FSCV, in una registrazione di potenziale fissa la tensione è mantenuta a redox potenziale per l'analita di interesse. Anche se è meno chimicamente selettivo rispetto FSCV come neurotrasmettitori multipli possono avere la stessa potenziale, redox nelle aree del cervello che schiacciante inclinare verso un neurotrasmettitore, la natura di turno-chiave di questo approccio supera la mancanza di sostanza chimica specificità.
La possibilità di misurare sia elettroattivi e nonelectroactive rilascio di neurotrasmettitori in tempo quasi reale e collegarlo a specifici eventi comportamentali offre l'opportunità di esaminare convergenti del rilascio di neurotrasmettitore. Questo manoscritto descrive in dettaglio l'utilizzo di questo sistema per interrogare la neurotrasmissione del glutammato e della dopamina in risposta alla naturale ricompensa in criceti comportamento svegli. Lo scopo di questa carta è di dettagliare il processo di misurazione questo rilascio di neurotrasmettitore durante il comportamento sessuale nei criceti femminili, con l'obiettivo di dimostrare la fattibilità per l'esame di altri comportamenti e paradigmi sperimentali.
I criceti sono un modello ideale per l'uso in elettrochimiche registrazioni Storicamente, i modelli del ratto e topi sono stati impiegati nello studio del comportamento sessuale. Queste specie di roditori impegnano in una sequenza dinamica di copula, che coinvolge numerosi comportamenti femminili sollecitazione che includono hopping, guizzanti e orecchio dimenando per attirare il maschio inseguire e infine montare la femmina7. Il montaggio da parte del maschio (con o senza penetrazione vaginale) dura solo pochi secondi, durante il quale la donna si impegna nella sua postura di comportamento sessuale (chiamato lordosi) anche solo per pochi secondi prima di riprendere i comportamenti attivi sollecitazione. Questo modello di comportamento, composto da alti livelli di attività intervallati da brevi periodi di immobilità, è problematico per la misurazione di neurotrasmissione nel comportarsi animali. In primo luogo, possono esserci artefatti di movimento nelle registrazioni amperometrico che non sono correlate all'attività neurale. In secondo luogo, la locomozione è associata con il rilascio di neurotrasmettitori particolare in determinate regioni del cervello. Ad esempio, rilascio della dopamina è stato accoppiato ad attività locomotrice nel corpo striato dorsale e ventrale8,9, trovando quello ha costituito la base per le misurazioni di microdialisi della dopamina seguendo psicostimolante amministrazione10. Perché i comportamenti di donna-tipica sollecitazione a most roditori comportano alti livelli di attività locomotrice e sono rappresentati dalla mole di un test di comportamento sessuale di 10 minuti, questo rende difficile attribuire i cambiamenti nella neurotrasmissione ai componenti esplicite di comportamento sessuale che collettivamente durano solo minuti.
Per analizzare il profilo del neurochemical del comportamento sessuale femminile, questo laboratorio ha cercato una specie in cui c'è minima attività locomotrice che accompagna il comportamento sessuale. La sequenza copulatoria in criceti siriani (Mesocricetus auratus) è ideale per le registrazioni del neurochemical a causa della mancanza di comportamenti di sollecitazione tipicamente osservati in ratti e topi11. Di conseguenza, criceti femminile entrerà e mantenere la postura di lordosi per verso l'alto 9 minuti fuori 10 minuti test sessione12. Con la mancanza di movimenti estranei locomotore dalla femmina, in vivo si ottengono registrazioni elettrochimiche che possono essere associate a componenti di interazioni sessuali con l'uomo.
Bouts copulatoria in criceti Dopo l'introduzione di un animale maschio stimolo nella camera di prova, l'uomo inizialmente si impegnerà nell'inchiesta anogenital (AI) della femmina prima di montare il suo (Figura 2A). In ordine per il maschio montare, la donna deve assumere un atteggiamento di sessuale ricettivo conosciuto come lordosi, in cui lei inarca la schiena e devia la coda in modo che il maschio di montaggio possa accedere del pene vagina per lei. Il maschio monterà la femmina, stringendo il suoi quarti posteriori con entrambe le zampe (Figura 2B) e iniziare spingendo nel tentativo di guadagnare intromission penile (Figura 2C). Il maschio montare la femmina (senza inserimento) così come cooptare un numero di volte prima di raggiungere alla fine eiaculazione precoce. Questa sequenza di Monti e intromissions che conduce alla eiaculazione è definita un "incontro copulatoria". I maschi avranno diversi attacchi copulatore all'interno di una singola sessione.

<table><tbody><tr><td>Nembutal</td><td>Oak Pharmaceuticals Inc.</td><td>76478-501-50</td><td>Iniezione di pentobarbital sodico, USP. Questo laboratorio utilizza 8,5 mg/100 g di peso corporeo, iniettato per via intraperotinaria.</td></tr><tr><td>Analgesico Loxicom&nbsp;</td><td>Laboratori Norbrook</td><td>6451603670</td><td>FANS antinfiammatorio e analgesico utilizzato per il controllo del dolore post-operatorio. Generico: meloxicam.</td></tr><tr><td>Antibiotico Enroflox&nbsp;</td><td>Laboratori Norbrook</td><td>5552915411</td><td>Antibiotico fluorochinolone per la prevenzione delle infezioni post-operatorie. Generico: Enrofloxacina.</td></tr><tr><td>Beutanasia-D&nbsp;</td><td>Merck Animal Health</td><td>00061047305</td><td>Pentobarbital sodico, fenitoina Agente di eutanasia sodica.</td></tr><tr><td>Viti per ossa</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8111-16</td><td>Vite ossea da 1/8" (confezione da 16) utilizzata per fissare la calotta cranica al cranio.</td></tr><tr><td>Acrilico dentale (Bosworth Duz-All)</td><td>Bosworth&nbsp;</td><td>Codice 166261C</td><td>L'acrilico dentale autopolimerizzante viene utilizzato nella costruzione di una calotta cranica per fissare la cannula e il supporto della testa al cranio.</td></tr><tr><td>Configurazione del biosensore hardware&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8400-K2</td><td>Pinnacle offre kit hardware completi per i nuovi utenti del nostro sistema di biosensori cablati per ratti. I kit includono un commutatore, un preamplificatore e un sistema di condizionamento e acquisizione dati</td></tr><tr><td>Pacchetto base per computer</td><td>video Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>9000-K1</td><td>Il pacchetto del computer di base include un computer preconfigurato con ampio spazio di archiviazione su disco rigido, un monitor ad alta definizione, una tastiera e un mouse, un gruppo di continuità e tutti i cavi necessari.</td></tr><tr><td>Pacchetto fotocamera Video EQ700 EverFocus</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>&nbsp; 9000-K10&nbsp;</td><td>La telecamera box EQ700 con visione notturna e sorgente IR indipendente è stata ottenuta come parte del pacchetto di computer video Pinnacle. Sono disponibili anche le opzioni telecamera dome (9000-K9) e telecamera HD (9000-K11).&nbsp;</td></tr><tr><td>Software di acquisizione Sirenia</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>Gratuito--disponibile per il download da pinnaclet.com</td><td>Sirenia&nbsp; L'acquisizione fornisce un'unica piattaforma per la registrazione dei dati da qualsiasi sistema hardware Pinnacle. Il software offre la sincronizzazione di tutti i flussi di dati, le impostazioni configurabili dall'utente, il consolidamento dei dati e molteplici opzioni di esportazione. Inoltre, il software include moduli di revisione e analisi di base per le registrazioni dei biosensori. Sirenia&nbsp; Offre un software LL-in-one gratuito, ideale per l'acquisizione e la revisione dei dati.</td></tr><tr><td>Ratto legato&nbsp; in vitro kit di calibrazione</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7000-K2-T-BAS&nbsp;</td><td>Per mettere in relazione le variazioni attuali misurate da un biosensore con le variazioni effettive della concentrazione dell'analita, è necessario calibrare il biosensore prima dell'impianto nell'animale. Il processo conferma anche l'integrità e la selettività dei sensori. Il kit di calibrazione include un becher incamiciato da 20 mL (#7058), un'ancoretta magnetica da 1/2" per 1/8" (#7059), un morsetto ad angolo retto (#7056), un morsetto a regolazione singola a 2 poli (#7055), un preamplificatore di calibrazione a 4 canali (#7053) e un supporto di calibrazione (#7051).&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra di agitazione&nbsp;</td><td>Corning</td><td>6795-410D</td><td>Agitatore digitale Corning, 5" x 7", 120 V CA utilizzato per far girare l'agitatore magnetico in un becher incamiciato durante la calibrazione in vitro dei biosensori di glutammato.</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua in grado di circolazione a circuito chiuso</td><td>PolyScience</td><td>8006A11B</td><td>PolyScience 8006A11B Bagno di circolazione riscaldato digitale standard da 6 litri, bagno d'acqua da 120 V CA è stato utilizzato con tubi di plastica per riscaldare il becher rivestito alla temperatura fisiologica.</td></tr><tr><td>Sensore in fibra di carbonio con cannule di ratto BASi</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7002-CFS Elettrodo</td> in <td>fibra di carbonio utilizzato per registrare la neurotrasmissione della dopamina.</td></tr><tr><td>Elettrodo di riferimento Ag/AgCl</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7065</td><td>Necessario per registrazioni in fibra di carbonio.</td></tr><tr><td>Biosensori di glutammato&nbsp;</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7001&nbsp;</td><td>Sonda biosensore enzimatica utilizzata per la registrazione della neurotrasmissione glutammatergica.</td></tr><tr><td>Cannule guida BASi</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7030&nbsp;</td><td>Cannule guida impiantate nella regione cerebrale di interesse per guidare la sonda.</td></tr><tr><td>Copricapo in plastica per cannula BASi per ratti&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7011&nbsp;</td><td>Il supporto per la testa stabilizza la sonda e si collega al potenziostato.</td></tr></tbody></table>

misurare in vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente premiando i comportamenti in criceti siriani femminili

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

La capacità di misurare il rilascio di neurotrasmettitore su una scala di tempi rapidi consente modelli della neurotrasmissione per essere collegati a specifici comportamenti o manipolazioni; un potente strumento nel delucidamento sottostanti meccanismi e circuiti. Mentre la tecnica della microdialisi è stata utilizzata per decenni per misurare quasi qualsiasi analita di interesse nel cervello, questa tecnica è limitata nella risoluzione temporale. In alternativa, voltammetria ciclica scansione veloce è sia temporalmente preciso ed estremamente sensibile; Tuttavia, poiché questo metodo tecnicamente difficile si basa sull'electroactivity dell'analita di interesse, è eliminata la possibilità di rilevare sostanze nonelectroactive (ad es., il glutammato, un neurotrasmettitore). Questo documento descrive in dettaglio l'utilizzo di un sistema di chiavi che unisce potenziale fisso amperometria e biosensori enzimatici per misurare sia elettroattivi e nonelectroactive neurotrasmettitori con precisione temporale. L'abbinamento di questi due potenti tecniche consente la misurazione di tonico e fasico neurotrasmissione con relativa facilità e permette di registrare dei neurotrasmettitori multipli contemporaneamente. Lo scopo di questo manoscritto è per illustrare il processo di misurazione della dopamina e glutammato neurotrasmissione in vivo mediante un comportamento naturalmente gratificante (cioè, comportamento sessuale) in criceti femminile, con l'obiettivo finale di visualizzare il fattibilità tecnica di questo test per l'esame di altri comportamenti e paradigmi sperimentali.

Utilizzando l'elettrochimica e comportamentali codifica metodologia descritta sopra, questo laboratorio ha cominciato a caratterizzare sia tonico e fasiche fluttuazioni in dopamina e glutammato durante le registrazioni in vivo del comportamento sessuale. A causa del modo temporalmente precisa di questa metodologia, noi possiamo caratterizzare più accuratamente neurotrasmissione durante il comportamento sessuale; così come attribuire specifici cambiamenti nei modelli di rilascio a...

Questa carta dettaglia l'uso di registrazioni di fisso-potenziale amperometrico utilizzando elettrodi in fibra di carbonio e tecnologia dei biosensori enzimatici per misurare il rilascio di dopamina e glutammato con elevata risoluzione temporale durante il naturale comportamento gratificante nella criceto femmina.

Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è misurare il rilascio di neurotrasmettitori in animali svegli e in attività. Sebbene questo video illustri l'applicazione alle neuroscienze comportamentali, con la capacità di caratterizzare il rilascio specifico di neurotrasmettitori in relazione a eventi comportamentali specifici, questa tecnica può essere impiegata in diverse altre sottodiscipline delle neuroscienze, ad esempio in associazione all'iniezione di farmaci. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua natura "pronta all'uso" per misurare in tempo quasi reale il rilascio di neurotrasmettitori in vivo.Iniziare iniettando 500 microgrammi di progesterone in 0,1 millilitri di olio di semi di cotone, per via sottocutanea, quattro ore prima dell’introduzione del maschio per indurre la ricettività sessuale. Assicurarsi di testare ogni animale all’inizio della fase scura del loro ciclo giornaliero, poiché i comportamenti sociali dei roditori possono subire alterazioni in condizioni di luce bianca o luce rossa. Preparare le soluzioni di calibrazione fresche nel giorno del test in provette in vetro da 20 millilitri per centrifuga.Per la soluzione dell'analita, sciogli

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Questo video mostra l'impianto di elettrodi e cannule in un ratto anestetizzato per misurare il rilascio di dopamina nel nucleo accumbens utilizzando un potenziostato e l'infusione di farmaci per modulare l'attività dopaminergica nell'area tegmentale ventrale.

Monitoraggio del rilascio di dopamina in un modello di ratto con manipolazione del recettore dei neuroni dopaminergici VTA

Questo protocollo descrive due diverse manipolazioni ambientali e un protocollo di infusione cerebrale concomitante per studiare i cambiamenti cerebrali indotti dall'ambiente alla base del comportamento adattivo e della riparazione cerebrale nei topi adulti.

Modulazioni ambientali del numero di Mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti

Questo protocollo descrive la scheda di fori modificata, che è un set-up di test comportamentale che comprende le caratteristiche di un campo aperto e di una scheda di fori tradizionale. Questa configurazione consente l'analisi differenziale del comportamento incondizionato di piccoli mammiferi da laboratorio e l'analisi delle capacità cognitive.

The Hole Consiglio Modified - Behavior, Cognition e l&#39;interazione sociale in topi e ratti di misura

Questo articolo descrive un nuovo protocollo per la misurazione quantitativa della motivazione sociale nei topi utilizzando il condizionamento operante per una ricompensa sociale. Il protocollo è utile per la misurazione della motivazione sociale in modelli murini di autismo e altri disturbi del comportamento sociale.

Quantificare motivazione sociale nei topi mediante condizionamento operante

Descriviamo un protocollo per indurre gratificante e nonrewarding esperienze nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) utilizzando il consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

Questo protocollo misure di apprendimento spaziale e memoria utilizzando il labirinto di Barnes. Un nuovo paradigma di Damsel in Distress viene utilizzato per valutare l'attività locomotrice e comportamento prosociale nei topi.

Analisi apprendimento spaziale e comportamento prosociale nei topi utilizzando il labirinto di Barnes e paradigmi Damsel in Distress

Il protocollo qui presentato fornisce informazioni sull'elettroencefalografia simultanea (EEG) e sulla valutazione comportamentale in tempo reale. Abbiamo discusso tutti i passaggi coinvolti in questo protocollo come soluzione attraente per i ricercatori in molti campi delle neuroscienze, in particolare nelle aree di apprendimento e memoria.

Monitoraggio simultaneo dell'elettrofisiologia wireless e del test comportamentale della memoria come strumento per studiare la neurogenesi ippocampale

Un modello di abbuffata è stato stabilito nei topi utilizzando l'accesso intermittente a M&amp;M's (un alimento altamente appetibile a base di grassi e zuccheri). I topi con accesso intermittente a questo alimento ad alto contenuto di grassi e zuccheri hanno mostrato comportamenti simili allo stress, un aumento dell'apporto calorico e una preferenza per quel cibo rispetto al cibo standard rispetto ai topi con accesso continuo o nullo al cibo.

Modello di abbuffata intermittente nei topi

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

Scopri come misurare il rilascio di dopamina e glutammato in criceti siriani femmine durante comportamenti riproduttivi naturali. Questa tecnica di amperometria offre alta risoluzione temporale per studiare la neurobiologia del comportamento.

Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili (Video) | JoVE Journal

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