Analisi del promotore di pianta: Identificazione e caratterizzazione di radice nodulo specifico promotore nel fagiolo comune

Le radici pelose vengono utilizzate per ottenere radici trasformate in Phaseolus con un costrutto reporter. Le radici transgeniche risultanti vengono utilizzate per esaminare l'espressione del gene reporter. Gli studi sull'espressione dei promotori sono fondamentali per comprendere i modelli di espressione spazio-temporale dei geni.

Oggi dimostreremo le metodologie per l'induzione delle radici pelose e studieremo i pattern di espressione dei promotori in radici pelose transgeniche in condizioni simbiotiche di noduli radicali in Phaseolus. Estrada-Navarrete e colleghi hanno precedentemente stabilito l'apparato radicale peloso indotto da Agrobacterium rhizogenes in Phaseolus. Il metodo attuale aiuterà ad accelerare la durata dell'induzione della radice pelosa e quindi a migliorare la versatilità del sistema.

A dimostrare le procedure saranno il mio collega Manoj-Kumar Arthikala e le studentesse universitarie Alma Leticia e Brenda Mariana del mio laboratorio. Per cominciare, cerca la sequenza del gene NIN nel database del genoma di Phaseolus vulgaris da Phytozome e seleziona la lunghezza richiesta della sequenza a monte di ATG. Progettare gli oligonucleotidi seguendo l'analisi appropriata della sequenza del promotore.

Il DNA genomico Phaseolus appena preparato servirà come modello per la PCR per amplificare la sequenza del promotore. Preparare la miscela master PCR con Taq polimerasi ad alta fedeltà e componenti PCR standard, insieme agli oligonucleotidi progettati in precedenza. Aliquotare la miscela master in provette PCR da 2 mL ed eseguire l'amplificazione del frammento del promotore in un termociclatore e con un programma adatto.

Separare elettroforeticamente il prodotto della PCR su un gel di agarosio all'1,2%. Visualizza il frammento NIN amplificato a 700 coppie di basi sotto transilluminazione UV. Asportazione, eluizione e clonazione del frammento nel vettore di ingresso del gateway pENTR/D-TOPO seguendo le istruzioni standard.

Trasformare due microlitri della miscela di reazione in cellule di E.coli competenti a 42 gradi Celsius per 50 secondi e impiattare l'E.coli trasformato su LB integrato con 50 milligrammi per litro di kanamicina. Far crescere le cellule piastrate a 37 gradi Celsius durante la notte. Eseguire una reazione PCR per plasmidi isolati da colonie di E.coli selezionate casualmente utilizzando oligonucleotidi M13.

Il frammento a 1024 coppie di basi dovrebbe indicare cloni positivi. Eseguire la reazione LR tra il clone di ingresso positivo e il vettore binario di destinazione. Trasformare due microlitri di miscela di reazione in E.coli e selezionare le colonie su 100 milligrammi per litro di spectinomicina a 37 gradi Celsius.

Amplificare i plasmidi con oligonucleotidi specifici per NIN. Il clone positivo dovrebbe amplificarsi a 700 coppie di basi. Sequenziare e verificare la correttezza del frammento clone.

Mobilizzare il costrutto del promotore NIN in cellule elettrocompetenti K599 Agrobacterium rhizogenes. E ancora una volta, confermare il clone con oligonucleotidi promotore-specifici. I semi di Phaseolus vulgaris sterilizzano con zolfo e germinano su carta da filtro sterile e bagnata per due giorni al buio a 28 gradi Celsius.

Diffondere 150 microlitri di cellule di Agrobacterium rhizogenes con costrutto NIN e vettore di controllo su piastre LB con selezione di spectinomicina. Coltiva la coltura durante la notte a 28 gradi Celsius. Rivestire le piantine di Phaseolus e raschiare le cellule di Agrobacterium rhizogenes con una punta piegata da 200 microlitri dalla piastra.

E risospendere in provetta Eppendorf con un mL di acqua distillata sterile. Raccogliere le cellule di Agrobacterium rhizogenes in una siringa da tre ml e posizionare le piantine di Phaseolus in una provetta precedentemente preparata. Bucherellare leggermente gli ipocotili dei semi germinati con la punta dell'ago, iniettando contemporaneamente le cellule dell'Agrobacterium rhizogenes.

Bisogna fare attenzione che l'ago non passi attraverso l'ipocotile. Mantenere le piantine iniettate in una camera di crescita a 28 gradi Celsius con 16 ore di luce e otto ore di buio. Il callo sugli ipocotili feriti dovrebbe essere visibile da cinque a sette giorni.

Dopo due settimane, rimuovere la radice primaria tagliando il gambo due centimetri sotto le radici pelose e trapiantarle in vasi contenenti vermiculite sterile. Contemporaneamente, inoculare le piante con un ml di Rhizobium tropici per indurre la nodulazione. Assicurati di diluire la coltura di rizobio a 6 a OD 600.

Mantieni le piante in una camera di crescita a 28 gradi Celsius, 16 ore di luce e otto ore di fotoperiodo buio e irriga con soluzioni B e D. Per studiare i pattern di espressione spazio-temporale del promotore NIN, il campionamento viene effettuato in diversi punti temporali. Togli le piante senza danneggiare le radici e lava le radici senza gracchioline di vermiculite.

Selezionare casualmente le radici da NIN e dalle piante di controllo e procedere alla colorazione istochimica GUS incubando i campioni nel tampone di saggio GUS a 37 gradi Celsius per 16 ore al buio. Osservare le radici colorate di GUS al microscopio stereo e composto. Questa immagine mostra l'espressione del promotore NIN indotta dal rizobio nelle radici primarie.

L'espressione del promotore NIN potrebbe essere osservata anche nelle cellule ciliate delle radici infettate da rizobio. Inoltre, l'espressione di GUS può essere documentata in diversi stadi di sviluppo del nodulo radicolare. Non è stata osservata alcuna espressione di GUS nelle radici di controllo vettoriale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della progettazione dei costrutti del tuo promotore e dello studio dei modelli di espressione del promotore nelle radici pelose transgeniche di Phaseolus. Questo sistema potrebbe essere ulteriormente esteso per studiare i modelli di espressione del promotore in altre interazioni simbiotiche e patogene in Phaseolus e anche in altri eudicotiledoni.