Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una visione tridimensionale completa della distribuzione capillare nei follicoli ovarici di topo e mostrare le loro relazioni. L'ovaio è un organo essenziale nella riproduzione e in endocrinologia. Conta ogni diverso stadio di sviluppo del follicolo e delle cellule somatiche.

Inoltre, a differenza di altri organi, l'ovaio non mostra la ramificazione ripetuta dell'unità funzionale. Il sistema vascolare locale può essere insieme al sistema nervoso sono anche in grado di subire importanti cambiamenti in ogni ciclo mestruale nelle femmine adulte. L'applicazione della chiarezza passiva nell'ovaio ci permette di vedere la distribuzione generale e la connessione tra quelle cellule e follicoli nell'ovaio.

La maggior parte dell'unica chiave di questa misura è che ha il minor effetto sull'ovaio e tiene conto dell'eliminazione di vari marcatori. Attraverso la ricostruzione dell'immagine microscopica abbiamo fornito una mappa dell'ovaio. Alcuni dettagli dei vasi, dei neuroni e dei follicoli possono essere osservati chiaramente.

Per l'analisi delle immagini, sono state utilizzate alcune opzioni di Imaris per valutare le relazioni tra l'ovaio e le strutture. Preparare le soluzioni a profusione secondo le istruzioni dell'articolo e tenerle in ghiaccio. Anestetizza i topi e assicurati che il topo non abbia una risposta di pizzicamento delle dita.

Spruzzare etanolo, praticare un'incisione sull'atrio destro, quindi spruzzare immediatamente il ventricolo sinistro con 20 ml di PBS ghiacciato alla velocità di 10 ml al minuto per eliminare il sangue. Quindi cospargere l'animale con una soluzione di idrogel fredda con la stessa velocità. Raccogli le ovaie e l'utero per mantenere l'integrità della morfologia ovarica.

Trasferire le ovaie separate nella soluzione fredda di idrogel. Sotto uno stereomicroscopio rimuovere i tessuti adiposi intorno all'ovaio. Per un migliore risultato della fissazione dei tessuti, si consiglia di rimuovere la borsa ovarica.

Conservare le ovaie in soluzione di idrogel per tre giorni. Dopo tre giorni, trasferire le ovaie in un tubo di vetro e riempire il tubo con una soluzione di idrogel fresca. Allungare il parafilm sulla parte superiore del tubo e poi avvolgere un altro parafilm attorno al collo del tubo.

Assicurarsi che non vi siano bolle tra il parafilm e la soluzione di idrogel. Posizionare il tubo di vetro su un'incubatrice shaker a 37 gradi centigradi per due ore fino a quando non si forma il gel. Rimuovere con cura il gel in eccesso intorno alle ovaie con un filtro di carta.

Metti le ovaie in un tubo da 15 ml e riempi il tubo con 10 ml di soluzione chiarificante. Posizionare la provetta su un'incubatrice shaker a 37 gradi centigradi per almeno due mesi. Cambiare la soluzione schiarente ogni giorno nei primi tre giorni e poi settimanalmente fino a quando l'ovaio non diventa cleare.

Tutte le procedure di immunocolorazione vengono eseguite a 37 gradi centigradi su un agitatore. Per prima cosa, lavare l'ovaio in PBST per 24 ore. In secondo luogo, incubare l'ovaio in un anticorpo primario diluito da PBST per due giorni.

In terzo luogo, lavare via gli anticorpi primari con tampone PBST. In quarto luogo, incubare l'ovaio con l'anticorpo secondario desiderato in PBST per due giorni. Quinto, lavare via gli anticorpi secondari con PBST.

In sesto luogo, trasferire l'ovaio in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione per l'omogeneizzazione dell'RI. Controllare la trasparenza visiva, quando l'ovaio è stato completamente chiarito può essere visualizzato. Per prima cosa, prepara un piatto con fondo di vetro pulito.

Crea un cilindro di mastice e modellalo a forma di ferro di cavallo. Premere saldamente il bordo esterno sul vetrino per creare uno spazio sigillato. L'altezza dello stucco dovrebbe essere leggermente superiore all'ovaio.

Spostare l'ovaia con cautela al centro e aggiungere la soluzione di montaggio. Spingi un piatto sopra lo stucco e usa due pezzi di mastice per fissarlo. Quando l'ovaio è pronto per l'immagine, è possibile selezionare il microscopio confocale Nikon con obiettivo 16X per l'immagine.

Per l'imaging con microscopio confocale, scegliere prima la lente nel pannello Ni-E. Nell'acquisizione del pannello, selezionare il numero di canali. Innanzitutto, utilizzare la linguetta Eye Port e il joystick del controller XY per spostare il tessuto al centro del campo attraverso il controllo da parte degli oculari del microscopio.

In secondo luogo, dopo aver spento la luce dell'otturatore, fare clic sulla scheda live per regolare la potenza del laser, l'HV e l'offset per ciascun canale. Nel pannello Z Intensity Correction regolare l'acquisizione per il livello superiore, fare clic sul pulsante più per definire la parte superiore, spostare la lente verso il basso e impostare la potenza HV e laser appropriata sul fondo del tessuto e aggiungere le informazioni sul livello più basso fare clic su A ND per sincronizzare l'impostazione con il pannello e l'acquisizione. E nell'acquisizione, impostare prima il numero di passaggi di scansione.

Fare clic sulle schede della Z e sull'immagine grande. In secondo luogo, vai alla finestra dell'immagine grande di scansione per definire la dimensione del campo in base al bordo del tessuto. In terzo luogo, torna all'acquisizione ND per inserire la dimensione dei campi di scansione e scegliere la sovrapposizione tra il 10 e il 50%Quindi fare clic su Esegui correzione Z e attendere il processo di imaging.

Per prima cosa usa imagic per aprire il file NIS originale. Fare clic sul pulsante dell'immagine, scegliere il colore e i canali di visualizzazione, quindi fare clic su file, scegliere le sequenze di immagini e salvarle separatamente come file tiff. In secondo luogo, usa Imaris per aprire uno dei file tiff.

Fai clic sul pulsante di modifica e scegli di aggiungere i canali per aggiungere il resto. Il nome e il colore possono essere modificati durante la regolazione del display. Anche lo spessore del tessuto dovrebbe essere corretto nelle proprietà dell'immagine.

Terzo, fai clic sul pulsante di modifica e scegli Ritaglia 3D per tagliare la parte in più. Innanzitutto, fai clic sul pulsante del filamento e fai clic su Avanti. Vai al pannello della fetta, trova una nave di tracciamento e la distanza, quindi torna al Surpass, inserisci l'elettricità statica e fai clic su Avanti.

In secondo luogo, regolare la soglia iniziale e di set point. Nel pannello della fotocamera, scegli la selezione, premi Maiusc e fai clic sul punto per rimuovere la parte extra. Terzo, scegli la soglia più alta e fai clic su Avanti.

Non selezionare rileva punti e vai avanti. Alcune parti in eccesso possono essere rimosse nel pannello di modifica. Il colore può essere modificato facendo clic sul colore.

L'architettura 3D della vascolarizzazione ovarica è stata studiata dopo l'immunocolorazione CD31. La struttura 3D può essere osservata sia da sezioni che da altre fette o da intere attraverso il rendering del volume. CD 31 è stata eseguita la colorazione del sistema vascolare del topo adulto.

Attraverso la ricostruzione dei capillari da parte dei filamenti, abbiamo potuto mostrare la relazione tra i singoli follicoli e i loro capillari. L'ovaio, come una donna, è sempre attiva e intercambiabile. Tuttavia, a causa dei limiti dell'analisi istologica tradizionale, è molto difficile descrivere le relazioni tra costituenti così complessi.

Il metodo di nuova concezione, la chiarezza passiva, può aiutarci a superare l'ostacolo ottico, mantenere l'integrità di tutti i tessuti e fornire gli indizi funzionali.