Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse
10 dicembre 2017
Qui presentiamo un adattamento del passivo chiarezza e metodo di ricostruzione 3D per la visualizzazione del vasculature ovarico e capillari follicolari nelle ovaie intatte del mouse.
Lo scopo generale di questo protocollo è fornire una visione tridimensionale completa della distribuzione dei capillari nei follicoli ovarici del topo e mostrare le loro relazioni. L'ovaio è un organo essenziale nella riproduzione e nell'endocrinologia. Contare ogni diversa fase di sviluppo del follicolo e le cellule somatiche.
Inoltre, a differenza di altri organi, l'ovaio non presenta un ripetuto ramificarsi dell'unità funzionale. Il sistema vascolare locale, insieme al sistema nervoso, è in grado di subire notevoli cambiamenti in ciascun ciclo mestruale nelle donne adulte. L'applicazione della trasparenza passiva nell'ovaio ci consente di osservare la distribuzione generale e le connessioni tra le cellule e i follicoli presenti nell'ovaio.
La maggior parte dell'importanza di questa misura risiede nel fatto che ha il minimo effetto sull'ovaio e spiega la chiarezza di diversi marcatori. Attraverso la ricostruzione dell'immagine microscopica abbiamo fornito una mappa dell'ovaio. Alcuni dettagli dei vasi, dei neuroni e dei follicoli possono essere osservati chiaramente.
Per l'analisi delle immagini, alcune funzioni di Imaris sono state utilizzate per valutare le relazioni tra l'ovaio e le strutture. Preparare le soluzioni di perfusione seguendo le istruzioni dell'articolo e mantenerle sul ghiaccio. Anestetizzare i topi e verificare l'assenza di risposta alla pressione sulle dita dei piedi.
Spruzzare etanolo, praticare un'incisione nell'atrio destro, quindi perfondere immediatamente il ventricolo sinistro con 20 ml di PBS freddo ghiaccio alla velocità di 10 ml al minuto per rimuovere il sangue. Successivamente, perfondere l'animale con Soluzione di Idrogel fredda alla stessa velocità. Raccogliere le ovaie e l'utero per mantenere l'integrità della morfologia ovarica.
Trasferire le ovaie separate nella soluzione di idrogel fredda. Al microscopio stereoscopico, rimuovere i tessuti adiposi intorno all'ovaio. Per un migliore risultato della fissazione del tessuto, si raccomanda la rimozione della bursa ovarica.
Mantenere le ovaie in soluzione di idrogel per tre giorni. Dopo tre giorni, trasferire le ovaie in un tubo di vetro e riempire il tubo con soluzione di idrogel fresca. Stendere un foglio di parafilm sulla parte superiore del tubo, quindi avvolgere un altro strato di parafilm attorno al collo del tubo.
Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria tra il parafilm e la Soluzione di Idrogel. Posizionare il tubo di vetro su un incubatore agitatore a 37 gradi Centigradi per due ore, fino a quando si forma il gel. Rimuovere con cura il gel in eccesso attorno alle ovaie utilizzando un filtro di carta.
Mettere le ovaie in un tubo da 15 ml e riempire il tubo con 10 ml di soluzione chiarificante. Posizionare il tubo su un incubatore agitatore a 37 gradi centigradi per almeno due mesi. Cambiare la soluzione chiarificante ogni giorno nei primi tre giorni, quindi settimanalmente fino a quando l'ovaio non diventa trasparente.
Tutte le procedure di immunomarcatura vengono eseguite a 37 gradi centigradi su un agitatore. In primo luogo, lavare l'ovaio in PBST per 24 ore. In secondo luogo, incubare l'ovaio in anticorpo primario diluito in PBST per due giorni.
Terzo, rimuovere gli anticorpi primari con tampone PBST. Quarto, incubare l'ovaio con l'anticorpo secondario desiderato in PBST per due giorni. Quinto, rimuovere gli anticorpi secondari con PBST.
Sesto, trasferire l'ovaio in una soluzione di adattamento dell'indice di rifrazione per l'omogeneizzazione dell'IR. Verificare la trasparenza visiva; quando l'ovaio è stato completamente chiarificato, può essere sottoposto a imaging. Per prima cosa, preparare una piastra pulita con fondo in vetro.
Formare un cilindro di pasta modellabile e dargli una forma a ferro di cavallo. Premere saldamente il bordo esterno su un vetrino per creare uno spazio sigillato. L'altezza della pasta deve essere leggermente superiore a quella dell'ovaio.
Spostare con attenzione l'ovaio al centro e aggiungere la soluzione di montaggio. Posizionare una piastra sopra la pasta modellabile e utilizzare due pezzi di pasta per fissarla. Quando l'ovaio è pronto per essere osservato, si può selezionare un microscopio confocale Nikon con obiettivo 16X per acquisirne l'immagine.
Per l'acquisizione con microscopio confocale, selezionare innanzitutto l'obiettivo nel pannello Ni-E. Nel pannello di acquisizione, scegliere il numero di canali. Utilizzare prima la scheda Eye Port e la leva joystick del controllore XY per spostare il tessuto al centro del campo visivo, verificando attraverso gli oculari del microscopio.
In secondo luogo, dopo aver spento la luce dell'otturatore, fare clic sulla scheda live per regolare la potenza del laser, l'alta tensione (HV) e l'offset per ogni canale. Nel pannello Correzione dell'intensità Z, regolare l'acquisizione per lo strato superiore, fare clic sul pulsante più per definire la parte superiore, abbassare l'obiettivo e impostare un'adeguata alta tensione (HV) e potenza del laser alla base del tessuto, quindi aggiungere le informazioni del livello più basso. Fare clic su To ND per sincronizzare le impostazioni con il pannello e con l'acquisizione. Nell'acquisizione, impostare innanzitutto il numero di passi di scansione.
Fare clic sulle schede di Z e dell'immagine grande. In secondo luogo, passare alla finestra di scansione dell'immagine grande per definire le dimensioni del campo in base al bordo del tessuto. In terzo luogo, tornare all'acquisizione ND per inserire le dimensioni dei campi di scansione e scegliere un sovrapposizione compresa tra il 10 e il 50%. Quindi fare clic su esegui correzione Z e attendere il processo di acquisizione immagine.
Utilizzare innanzitutto imagic per aprire il file NIS originale. Fare clic sul pulsante immagine, scegliere i canali colore e di visualizzazione, quindi fare clic su file, selezionare le sequenze di immagini e salvarle separatamente come file tiff. In secondo luogo, utilizzare Imaris per aprire uno dei file tiff.
Fare clic sul pulsante modifica e scegliere l'aggiunta di canali per aggiungere i rimanenti. Il nome e il colore possono essere modificati nell'aggiustamento della visualizzazione. Lo spessore del tessuto deve essere corretto anche nelle proprietà dell'immagine.
In terzo luogo, fare clic sul pulsante di modifica e scegliere Ritaglia 3D per eliminare la parte eccedente. Prima di tutto, fare clic sul pulsante del filamento e quindi su avanti. Andare al pannello di sezione, individuare un vaso tracciato e la distanza, quindi tornare a Surpass, inserire il valore statico e fare clic su avanti.
In secondo luogo, regolare la soglia iniziale e quella di riferimento. Nel pannello della telecamera, selezionare l'opzione, premere Maiusc e fare clic sul punto per rimuovere la parte aggiuntiva. In terzo luogo, scegliere la soglia più alta e fare clic su Avanti.
Non selezionare i punti rilevati e vai avanti. Alcune parti in eccesso possono essere rimosse nel pannello di modifica. Il colore può essere modificato cliccando sul colore.
È stata analizzata l'architettura tridimensionale della vascolarizzazione ovarica a seguito di immunomarcatura per CD31. La struttura 3D può essere osservata mediante sezioni successive o nell'insieme attraverso la ricostruzione volumetrica. È stata eseguita la marcatura per CD31 sulla vascolarizzazione follicolare del topo adulto.
Mediante la ricostruzione dei capillari da parte dei filamenti, siamo stati in grado di mostrare la relazione tra i singoli follicoli e i loro capillari. L'ovaio, come una donna, è sempre attivo e intercambiabile. Tuttavia, a causa delle limitazioni dell'analisi istologica tradizionale, è molto difficile descrivere le relazioni tra questi costituenti così complessi.
Il metodo appena sviluppato, la chiarezza passiva, potrebbe aiutarci a superare l'ostacolo ottico, mantenere l'integrità di tutti i tessuti e fornire indizi funzionali.
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Panoramica
Questo studio presenta un'adattamento del metodo passivo CLARITY per la visualizzazione della vascolarizzazione ovarica e dei capillari follicolari in ovaie intatte di topo. Il protocollo ha lo scopo di fornire una visione tridimensionale completa della distribuzione dei capillari all'interno dei follicoli ovarici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia della Riproduzione
- Biologia Vascolare
Sfondo
- L'ovaio svolge un ruolo cruciale nella riproduzione e nell'endocrinologia.
- I follicoli attraversano diverse fasi di sviluppo, ognuna caratterizzata da cellule somatiche distinte.
- A differenza di altri organi, l'ovaio non presenta un ripetuto ramificarsi di unità funzionali.
- Il sistema vascolare nell'ovaio può subire cambiamenti significativi durante ogni ciclo mestruale.
Scopo dello studio
- Visualizzare la distribuzione complessiva dei capillari nei follicoli ovarici del topo.
- Illustrare le relazioni tra le cellule e i follicoli all'interno dell'ovaio.
- Migliorare la comprensione della vascolarizzazione ovarica e delle sue implicazioni per la salute riproduttiva.
Metodi Utilizzati
- Applicazione della tecnica passiva CLARITY.
- Ricostruzione tridimensionale della vascolarizzazione ovarica.
- Visualizzazione dei capillari follicolari in ovaie Integre di topo.
- Conteggio delle diverse fasi di sviluppo dei follicoli e delle cellule somatiche.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita delle reti capillari nei follicoli ovarici.
- Mappatura dettagliata delle connessioni vascolari tra i follicoli.
- Informazioni sui cambiamenti dinamici della vascolarizzazione ovarica.
- Definizione di un quadro di riferimento per futuri studi sulla biologia ovarica.
Conclusioni
- Il metodo passivo CLARITY rivela in modo efficace l'architettura vascolare ovarica.
- Questo approccio può approfondire la nostra comprensione della funzione e della salute ovarica.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per esplorare l'endocrinologia riproduttiva.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
La visualizzazione tridimensionale della vascolarizzazione ovarica integra consente di ridurre i rischi meccanicistici delle ipotesi sui bersagli riproduttivi chiarificando le relazioni strutturali tra follicoli e le loro reti capillari. Questo approccio sostiene la previsione affidabile nella fase iniziale di scoperta fornendo letture quantitative e riproducibili dell'architettura vascolare che possono guidare la validazione dei bersagli e i flussi di lavoro di screening fenotipico. Il metodo affronta una sfida fondamentale nella fase di scoperta: collegare il contesto anatomico alla biologia ovarica funzionale senza distorsione del tessuto.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando la lunghezza dei capillari follicolari rispetto al volume della parete follicolare, supportando la validazione funzionale delle target.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo di chiarificazione standardizzato che minimizza il restringimento e preserva l'integrità del tessuto per analisi vascolari riproducibili.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio biologico mediante dati quantitativi di correlazione (P<0.01) tra l'estensione capillare e lo sviluppo follicolare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera mappe vascolari 3D validate che fungono da sistemi pertinenti alle malattie per valutare gli effetti dei composti sulla microstruttura ovarica.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi mediante parametri costanti di immunomarcatura (CD31), chiarificazione e acquisizione delle immagini tra diversi follicoli.
- Scalabilità: Favorisce il riutilizzo della piattaforma grazie a flussi di lavoro di chiarificazione e ricostruzione adattabili, applicabili ad altri tessuti endocrini.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i fenotipi vascolari nella fase di scoperta a modelli preclinici preservando l'architettura ovarica nativa per studi longitudinali.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce le interazioni neurovascolari nell'ovaio, riducendo l'ambiguità nei percorsi di bersaglio endocrino.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Fornisce biomarcatori strutturali (ad esempio, lunghezza dei capillari, volume dei follicoli) per informare decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di modulazione follicolare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta consentendo un'analisi basata su ipotesi sui contributi vascolari alla maturazione dei follicoli, sostenendo l'identificazione di composti promettenti attraverso un profilo fenotipico vascolare e fornendo indicazioni per la validazione preclinica mediante fenotipizzazione su tessuti integri.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui regolatori vascolari nello sviluppo dei follicoli mediante la visualizzazione diretta in 3D delle reti capillari.
- Screening: Fornisce tessuto ovarico chiarificato e pronto per saggi, con parametri quantitativi del sistema vascolare, per campagne di screening di composti.
- Analisi: Offre misurazioni morfometriche (lunghezza dei capillari, volume follicolare) e statistiche di correlazione per consentire l’analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la fedeltà istologica dalla fase di scoperta fino alle fasi precliniche, evitando gli artefatti derivanti dalla sezionatura del tessuto.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di mappatura vascolare riutilizzabile per atlanti del tessuto endocrino e riproduttivo in diversi progetti di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella biologia vascolare ovarica.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori grazie al minimo disturbo tissutale offerto dal CLARITY passivo.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di fenotipi follicolari legati ai vasi sanguigni, riducendo l'abbandono in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli obiettivi in base al rischio, basandosi su fenotipi vascolari-strutturali nei gruppi follicolari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella schiaritura dei tessuti basata su idrogel, nell'immunomarcatura e nella microscopia confocale a fotoni multipli.
- È subordinato a strumentazioni specializzate, tra cui incubatori con agitazione, sistemi di abbassamento dell'indice di rifrazione e software per la ricostruzione tridimensionale (ad esempio, Imaris).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo la durata della schiaritura, la validazione degli anticorpi e i parametri di acquisizione, al fine di garantire una quantificazione vascolare riproducibile.
- Richiede opportune modifiche quando il protocollo viene applicato a tessuti non ovarici, a causa delle differenze nella densità e nel contenuto lipidico.
- È limitato dai lunghi tempi di schiaritura (fino a due mesi) e dalla necessità di ottimizzare la penetrazione degli anticorpi nelle regioni stromali più dense.
