Name: Ricostruzione tridimensionale dellarchitettura vascolare dellovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Impara la ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaio utilizzando il metodo CLARITY passivo nel topo. Questo protocollo consente di visualizzare la distribuzione dei capillari nei follicoli ovarici intatti.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del fondo speciale cinese per Assegnisti (n. 2014T70392 a YF), Natural Science Foundation della Cina nazionale (n. 81673766 a YF), il nuovo fondo di Priming insegnante, la Fondazione di Zuoxue dell'Università di Fudan e lo sviluppo Progetto di Shanghai picco discipline-Integrative Medicine (20150407).

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguito le linee guida del Comitato di etica animale a Shanghai Medical College, Fudan University (numero di omologazione 20160225-013).
1. preparazione dell'ovaia Mouse trasparente
<ol><li>
Preparazione delle soluzioni
	<ol>
<li>Preparare la soluzione tampone fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) con 0,1% Triton X-100 (PBST). Per fare 1 L di soluzione stock di 10 x PBS, mescolare 87 g di NaCl, 3,1 g di NaH2PO4 · 2H2O e 28,7 g di Na2HPO4 ·12H2O. aggiungere dH2O a 1 L e mescolare ~ 2 h. regolare a pH 7.4 con 1 N NaOH e conservare a temperatura ambiente. Diluire questa soluzione stock di 10 x di 1/10 utilizzando dH2O e poi fare 0.1% Triton X-100 in PBS.</li>
		<li>Preparare la soluzione di idrogel (pH 7,5) da mescolamenti 4% (wt/vol) soluzione di paraformaldeide (PFA), 4% (wt/vol) di acrilammide, 0,05% (wt/vol) bisacrylamide e 0,25% (wt/vol) VA-044 iniziatore in acqua bidistillata sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare la soluzione di schiarimento (pH 8.5) con 200 mM di tampone borato di sodio contenente 4% (wt/vol) sodio dodecil solfato (SDS) in acqua bidistillata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di aspersione e ovaia di perfusione
	<ol>
<li>Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio durante tutte le procedure.</li>
		<li>Anestetizzare mouse C57BL/6 adulto femmina wild-type con un'iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital (0,35 mg/kg). Una volta non si vede nessuna risposta di punta-pizzico, è possibile che il mouse correttamente è anestetizzato.</li>
		<li>Utilizzare nastro adesivo per fissare il mouse con le membra tese su una tavola piatta schiuma.</li>
		<li>Esporre il cuore da un'incisione sul processo xifoideo attraverso il petto, la pelle e ossa con le forbici.</li>
		<li>Praticare un'incisione nell'atrio di destra dell'animale e poi irrorare il ventricolo sinistro con 20 mL di PBS 1X ghiacciata a 10 mL/min.</li>
		<li>Irrorare l'animale con almeno 20 mL di soluzione di idrogel a 10 mL/min.</li>
		<li>Incidere la pelle sopra l'addome lungo la linea di medioventral con le forbici, che espone l'intera polifiletismo, e rimuovere gli intestini. Raccogliere le ovaie, come pure l'utero per mantenere l'integrità della morfologia ovarica.</li>
		<li>Rimuovere i tessuti grassi intorno l'ovaia sotto un microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Degasaggio
	<ol>
<li>Posizionare le ovaie in 10 mL di soluzione idrogel a 4 ° C per la fissazione per 3 giorni.</li>
		<li>Trasferimento dell'ovaia in una provetta da 5 mL e riempire la provetta con la soluzione di idrogel. Parafilm si estendono sopra la parte superiore del tubo e poi avvolgere parafilm intorno al collo del tubo. Attenzione: Accertarsi che non ci sono bolle tra il parafilm e la soluzione di idrogel.</li>
		<li>Posizionare il tubo su un agitatore in incubatore a 37 ° C per un massimo di 3 h per consentire l'idrogel di polimerizzare.</li>
		<li>Rimuovere l'ovaio dal gel con una spatola e rimuovere con cura il gel in eccesso da intorno ovaia di carta velina. Lavare l'ovaia quattro volte con PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compensazione passiva
	<ol>
<li>Immergere l'ovaia in 10 mL di soluzione di schiarimento. Agitare delicatamente a 80 giri/min a 37 ° C per avviare il processo di schiarimento.</li>
		<li>Nella prima settimana, cambiare la soluzione ogni 3 giorni. Dopo una settimana, è necessario aggiornare la soluzione di compensazione una volta a settimana fino all'ovario diventa chiara. Questo processo richiede solitamente circa 2-3 settimane. Nota: L'ovaia può essere direttamente immunostained o possa essere memorizzato in sodio azide (0,02%) in PBS a 4 ° C per diverse settimane prima che immunostaining.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunostaining
<ol><li>Lavare l'ovaio due volte in PBST il 1 giorno a 37 ° C in un agitatore.</li>
	<li>Incubare l'ovaia su un agitatore in soluzione di anticorpi primari/PBST (tabella 1) il giorno 2-3 a 37 ° C. Nel lavoro presentato qui, gli anticorpi primari erano la molecola di adesione cellulare endoteliale della piastrina 1 (CD31) e della tirosina idrossilasi diluito a 01:10 e 01:50 in PBST, rispettivamente. Attenzione: Se vengono utilizzati due o più tipi di anticorpo primario, assicurarsi che ci sono diverse fonti animali.</li>
	<li>Lavare gli anticorpi primari con tampone PBST a 37 ° C il giorno 4 su un agitatore.</li>
	<li>Incubare le ovaia con gli anticorpi secondari desiderati in PBST il giorno 5-6 a 37 ° C in un agitatore. Nel lavoro qui presentato, gli anticorpi secondari erano Alexa farina 488 tirosina idrossilasi e Alexa 594 di farina per CD31 diluito a 01:50 in PBST.</li>
	<li>Lavare gli anticorpi secondari con tampone PBST a 37 ° C il giorno 7 su un agitatore.</li>
	<li>Trasferire il tessuto nella soluzione corrispondente indice di rifrazione per l'omogeneizzazione di indice di rifrazione il giorno 8. Mettere il tessuto su una carta con la griglia per controllare la sua chiarezza visiva controllando se le linee della griglia può essere visto. Una volta che il tessuto è stato completamente chiarito, possono essere imaged.</li>
	<li>Fa un cilindro mastice che potrebbe solo circonda il tessuto, modellarlo a forma di ferro di cavallo e premere la cresta esterna strettamente su una lastra di vetro al fine di rendere uno spazio sigillato. L'altezza dello stucco deve essere un po' più alto di ovaia.</li>
	<li>Disporre l'ovaia chiarificato con cura nel centro dello stucco e aggiungere la soluzione di corrispondenza di indice di rifrazione. Mettere un piatto con fondo di vetro sopra lo stucco strettamente e utilizzare putty per fissare il piatto.</li>
</ol>3. microscopio confocale
<ol><li>Per l'imaging con un microscopio confocale, nel pannello "Ni-E" scegliere l'obiettivo (in questa immersione di acqua causa 25 X lente obiettiva, 1.1-NA, 2 mm-WD) con la corretta distanza di lavoro (in questo caso 2.0 mm).</li>
	<li>
Nel pannello "Acquisizione", selezionare il numero di canali. Qui, utilizzare tre canali.
	<ol>
<li>In primo luogo, utilizzare la scheda "occhio porta" e il joystick di XY per spostare il tessuto al centro del campo controllando attraverso gli oculari del microscopio.</li>
		<li>Dopo aver spento la luce dell'otturatore, fare clic sulla scheda "live" per regolare il "potere del laser", "HV (guadagno)", e "offset" per ogni canale separatamente. Aumento della potenza laser e HV può portare a segnali più alta, e offset superiore può ridurre il rumore di fondo.</li>
		<li>Selezionare la dimensione corretta"Scan" e "Totali". Utilizzare un formato di scansione di 1024x1024 µm2 e un conteggio di 4 a 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dopo aver impostato la qualità dell'immagine per definire la profondità del tessuto nel pannello "Correzione di intensità di Z" e dopo aver individuato l'obiettivo sul livello più alto dell'ovaia (nel centro del tessuto) e l'acquisizione per lo strato superiore di regolazione, fare clic sul "più" pulsante per definire il livello superiore.
	<ol>
<li>Spostare la lente verso il basso e impostare la HV appropriato e la potenza del laser per la parte inferiore del tessuto e aggiungere le informazioni di livello più basse nella tabella di correzione Z-intensità. Fare clic su "A ND" per sincronizzare le impostazioni con il pannello di "Acquisizione ND".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pannello in "ND acquisizione", prima serie, il numero di scansione passi. Poi, spuntare le schede "Z" e "Grande immagine".
	<ol>
<li>Passare alla finestra "Scansione grande immagine" per definire le dimensioni del campo secondo il bordo del tessuto con l'aiuto di visualizzazione del tessuto attraverso gli oculari. Tornare al pannello "Acquisizione ND" immettere le dimensioni dell'area di scansione ("campi") e scegliete la sovrapposizione tra 10% e 15%.</li>
		<li>Fare clic su "Esegui Z correzione", non "Esegui ora", automaticamente impostare il corretto HV, potenza laser e offset per ogni strato, e attendere che l'immagine da elaborare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D ricostruzione dei singoli follicoli e loro Vasculatures
<ol><li>In primo luogo, utilizzare ImageJ5 per aprire il file originale di NIS. Fare clic sul pulsante "Immagine" e scegliere il "colore" e i "canali di Spalato". Fare clic su "File", quindi salvare separatamente i canali come serie di file tiff utilizzando l'opzione "Sequenze di immagini" in "Salva come".</li>
	<li>Utilizzare Imaris per aprire una delle serie di file tiff. Fare clic sul pulsante "Modifica" e scegli "Aggiungi canali" per aggiungere il resto dei canali. Il nome e il colore del canale può essere cambiati nelle schede "Regolazione del Display". Lo spessore del tessuto potrebbe essere necessario essere corretto nel pannello "Proprietà immagine" nell'elenco a discesa sotto "Modifica".</li>
	<li>Per il ritaglio 3D immagini finali e la rimozione di parti in eccesso, fare clic sul pulsante "Modifica" e scegliete "Crop 3D". La dimensione del campo può essere regolata trascinando il bordo.</li>
	<li>
Per ricostruire i segnali di nave con l'algoritmo di filamenti nel pannello Surpass, fare clic sul pulsante "Filamenti" per creare un nuovo filamento e fare clic su Avanti.
	<ol>
<li>Al fine di definire il più grande e il diametro più sottile, andate al pannello "Slice" e trovare la nave di tracciatura. La distanza viene automaticamente visualizzata sul pannello di "Misura" selezionando due punti presso la larghezza massima della nave.</li>
		<li>Tornare al pannello di "Superare" e la larghezza misurata in ingresso e fare clic su Avanti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare la soglia di punto di partenza e seme. Nel pannello "Fotocamera", scegliere "Seleziona". Se è necessario rimuovere alcune delle sfere prodotte automaticamente, premere MAIUSC e fare clic sul punto. Scegliendo "Navigate" e spostando il mouse, la struttura può essere ruotata per garantire che tutti i punti corretti sono stati mantenuti e quindi fare clic su Avanti.</li>
	<li>Scegli la soglia massima per il contrasto locale e fare clic su Avanti. Non selezionare "Rilevare spine" e continuare finalizzare la ricostruzione del cilindro del vaso sanguigno. Il colore può essere modificato facendo clic sulla scheda "Colore". I dati statistici possono essere estratti nel pannello "Statistica" del filamento ricostruito. Parti in eccesso possono essere rimosso nel pannello "Edit". Nota: Altri algoritmi possono essere utilizzati per misurare il volume totale follicoli o pareti follicolari. Nei lavori presentati qui, gli ovociti sono stati caratterizzati dall'autofluorescenza di entrambi gli anticorpi secondari. A causa della grande quantità di dati, un server di workstation è stato utilizzato per l'analisi dei dati.</li>
</ol>5. elaborazione statistica
Nota: Dati di analisi di immagine sono presentati come mezzi ± errori standard.
<ol><li>Eseguire confronti tra i follicoli usando campioni indipendenti t-test e utilizzare test di correlazione di Pearson per confrontare i coefficienti di correlazione della parete follicolare e lunghezza capillare. Impostare un valore di P < 0,05 come limite della significatività statistica.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, H. M., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+vasculature+in+the+ovary%3A+development%2C+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease.</a> Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).</li>
<li>McFee, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+signal+transduction+blocks+follicle+progression+but+does+not+necessarily+disrupt+vascular+development+in+perinatal+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries.</a> Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).</li>
<li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ%2C+the+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice.</a> Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).</li>
<li>Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+expression+of+alpha+%281%29-+and+beta+%282%29-adrenoceptors+and+p75+neurotrophin+receptors+in+rats+with+steroid-induced+polycystic+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries.</a> Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).</li>
<li>Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annual+and+periovulatory+changes+in+tyrosine+hydroxylase+activity+in+the+ovary+of+the+catfish+Heteropneustes+fossilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis.</a> Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Serotonergic+Fibers+in+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+the+CLARITY%2FCUBIC+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique.</a> J Vis Exp. (108), e53673(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Sci Rep. 6, 26013(2016).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).</li>
<li>Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+ovarian+follicular+antrum+and+follicular+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid.</a> Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).</li>
<li>Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-follicle+barrier+%28BFB%29+in+disease+and+in+ovarian+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function.</a> Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clear%28T%29%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v16/n8/full/nn.3447.html">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationalisation+and+validation+of+an+acrylamide-free+procedure+in+three-dimensional+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging.</a> PLOS ONE. 11, e0158628(2016).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27627784">Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+three-dimensional+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue.</a> Sci Rep. 7, 9895(2017).</li>
<li>Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+of+vasoconstriction+in+rupture+of+the+ovarian+follicle+at+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nello studio corrente, presentiamo 3D imaging per valutare le relazioni fra capillari e singoli follicoli crescente. Nel nostro lavoro precedente utilizzando il protocollo stesso 9, abbiamo studiato i ruoli di grande sistema vascolare, interazioni tra follicoli piliferi e la posizione dei follicoli nelle ovaie intatte del mouse. L'approccio passivo di chiarezza ci ha permesso di studiare le interrelazioni tra i corpi lutei e follicoli anche di ricostruire l'architettura ovarico a diversi stadi di ...

Il follicolo è l'unità fondamentale strutturale e funzionale dell'ovaia, e suo sviluppo è altamente relativo al sistema vascolare all'interno dell'ovaio. Vasi sanguigni fornire nutrizione e ormoni ai follicoli e quindi svolgono un ruolo importante nella crescita e maturazione dei follicoli1.
Una combinazione di tecnologie, tra cui marcatori selettivi del vaso sanguigno, modelli murini transgenici e sviluppo farmaceutico, hanno aumentato la nostra conoscenza sulle reti vascolari ovarici, l'angiogenesi e la funzione dei vasi sanguigni nei follicologenesi. L'ovario è conosciuto come un organo attivo perché rimodella vari tessuti e reti vascolari durante la follicologenesi e dell'ovulazione. Tale rimodellamento attivo con le dimensioni e la struttura dei vasi è richiesto per la funzione biologica di sviluppo e reclutamento follicoli.
Tradizionali metodi istologici ed istomorfometrici utilizzando sezioni ovarici e immunolabeling dei vasi sanguigni sono limitati a immagini bidimensionali (2D)2. Con lo sviluppo di tecnologie di ricostruzione tridimensionale (3D), immagini 2D delle fette del tessuto possono essere sovrapposta per rendere una struttura 3D, ma questo metodo ha ancora alcune limitazioni — sezionamento del tessuto può distruggere le microstrutture, alcune parti della tessuto spesso mancano, e significativo lavoro è coinvolto nella fabbricazione di ricostruzioni 3D da immagini ottenute dalle fette. Intero-tessuto imaging 3D con microscopia confocale possono superare molte di queste limitazioni, ma questi metodi sono limitati alla valutazione dell'angiogenesi in ovaia embrionali3. Usando il tessuto intero metodi come chiarezza4 di compensazione può aumentare il volume visualizzato in modo da risolvere questi problemi in ovaie postnatale e adulte, e tali metodi forniscono spazio ottico dell'ovaia senza deformazioni strutturali. Imaging dell'architettura 3D dell'ovaia intatta fornisce un database di immagini precise per software di analisi di immagine, ad esempio il pacchetto di software di Imaris utilizzato in questo lavoro.
Rimodellamento dell'ovaia durante l'età adulta è parte di un sistema dinamico di fisiologico, e questo rende l'ovaia un eccellente modello per indagini nel regolamento dell'angiogenesi. Inoltre, valutare il ruolo dei vasi sanguigni ovarici in condizioni patologiche del sistema riproduttivo femminile come sindrome dell'ovaio policistico o cancri ovarici può essere studiato attraverso formazione immagine del tessuto ovarico intero. Lo sviluppo del metodo chiarezza passivo e l'uso del software di analisi avanzata delle immagini hanno fornito dettagliate informazioni spaziali sui rapporti tra vasi sanguigni e strutture ovariche come follicoli.

<table><tbody><tr><td>Acrilammide</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Farina Alexa 488 (Diluizione 1:50)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Farina 594 (Diluizione 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisacrilammide</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro a parete nera (Willco-Dish)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Idrogeno fosfato disodico dodecaidrato (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Sinopharm Reagente Chimico</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sinopharm Chemical Reagente</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, molecola di adesione piastrinica-cellula endoteliale 1 (Diluizione 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Fotoiniziatore VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Sodio diidrogeno fosfato diidrato (NaH2PO4 2H2O)</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Sodico dodecil solfato</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tirosina idrossilasi (TH, Diluizione 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del mouse

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

L'ovaio è il principale organo dell'apparato riproduttivo femminile ed è essenziale per la produzione di gameti femminili e per il controllo del sistema endocrino, ma le complesse relazioni strutturali e le architetture di sistema vascolare (3D) tridimensionale della ovaia non sono ben descritti. Per visualizzare le connessioni 3D e architettura dei vasi sanguigni nell'ovaia intatta, il primo importante passo è di rendere l'ovaia otticamente chiaro. Per evitare il restringimento del tessuto, abbiamo usato l'idrogel basati su fissazione passiva chiarezza (chiaro del lipido-scambiati rigida di acrilamide-ibridato idrogel tessuto Imaging / Immunostaining/In situ ibridazione-compatibile) metodo per cancellare un'ovaia intatta di protocollo . Immunostaining, microscopia confocale multifotonica avanzata e immagine-ricostruzioni 3D poi sono stati utilizzati per la visualizzazione dei vasi ovarici e capillari follicolari. Utilizzando questo approccio, abbiamo mostrato una correlazione positiva significativa (P < 0,01) tra la lunghezza dei capillari follicolari e volume della parete follicolare.

Abbiamo adattato il metodo passivo di chiarezza in un metodo semplice e rapido per l'ovaia passiva di compensazione preservando l'architettura follicolare e vascolare e ottenere il più alto segnale fluorescente da marcatori con etichettati delle navi e dei follicoli. L'architettura 3D del vasculature follicolare è stata determinata immunostaining per CD31, un indicatore per le cellule endoteliali6. CD31 colorazione nelle ovaie di topi adulti è stata tracciata utili...

Qui presentiamo un adattamento del passivo chiarezza e metodo di ricostruzione 3D per la visualizzazione del vasculature ovarico e capillari follicolari nelle ovaie intatte del mouse.

Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Lo scopo generale di questo protocollo è fornire una visione tridimensionale completa della distribuzione dei capillari nei follicoli ovarici del topo e mostrare le loro relazioni. L'ovaio è un organo essenziale nella riproduzione e nell'endocrinologia. Contare ogni diversa fase di sviluppo del follicolo e le cellule somatiche.Inoltre, a differenza di altri organi, l'ovaio non presenta un ripetuto ramificarsi dell'unità funzionale. Il sistema vascolare locale, insieme al sistema nervoso, è in grado di subire notevoli cambiamenti in ciascun ciclo mestruale nelle donne adulte. L'applicazione della trasparenza passiva nell'ovaio ci consente di osservare la distribuzione generale e le connessioni tra le cellule e i follicoli presenti nell'ovaio.La maggior parte dell'importanza di questa misura risiede nel fatto che ha il minimo effetto sull'ovaio e spiega la chiarezza di diversi marcatori. Attraverso la ricostruzione dell'immagine microscopica abbiamo fornito una mappa dell'ovaio. Alcuni dettagli dei vasi, dei neuroni e dei follicoli possono essere osservati chiaramente.Per l'analisi delle immagini, alcune funzioni di Imaris sono state utilizzate per valutare le relazioni tra l'ovaio e

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

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Questo studio presenta un protocollo per il tessuto reversibile di compensazione, immunostaining, 3D-rendering e analisi di reti vascolari nei campioni di villi di placenta umana nell'ordine di 1-2 mm3.

Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare i follicoli nelle ovaie colte di giovani topi senza sezionamento seriale. Mediante immunofluorescenza di intero organo e tessuto di compensazione, sezionamento fisico viene sostituito con sezionamento ottico. Questo metodo di preparazione del campione e visualizzazione mantiene l'integrità dell'organo e facilita la quantificazione automatizzata di cellule specifiche.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

I cambiamenti nel flusso sanguigno ovarico durante il periodo preovulatorio sono essenziali per l'ovulazione. L'ecografia Doppler è stata utilizzata nell'uomo e negli animali di grossa taglia per valutare l'emodinamica e la perfusione ovarica. Viene presentato un protocollo per l'applicazione dell'ecografia Doppler per valutare l'emodinamica ovarica durante le fasi preovulatorie e periovulatorie nei topi.

Ecografia Doppler per l'imaging dal vivo e la quantificazione della funzione vascolare ovarica nei topi

L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Abbiamo sviluppato una piattaforma software che utilizza Imaris Neuroscienze, ImarisXT e MATLAB per misurare i cambiamenti nella morfologia di una forma indefinita preso da tridimensionale fluorescenza confocale di singole cellule. Questo nuovo approccio può essere usato per quantificare i cambiamenti nella forma cellulare dopo l'attivazione del recettore e rappresenta quindi un possibile strumento aggiuntivo per la scoperta di farmaci.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

Impara la ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaio utilizzando il metodo CLARITY passivo nel topo. Questo protocollo consente di visualizzare la distribuzione dei capillari nei follicoli ovarici intatti.

Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

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