Name: Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Scopri la sintesi dei batteriofagi infettivi utilizzando un sistema di espressione senza cellula basato su E. coli. Questo metodo innovativo permette di studiare i meccanismi di autoassemblaggio molecolare in biologia sintetica.

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Questo materiale si basa su lavori sostenuta dall'Office of Naval Research award numero N00014-13-1-0074 (V.N.), Human Frontier Science Program grant numero RGP0037/2015 (per V.N.) e la Fondazione di scienza binazionale concedere 2014400 (al V.N.).

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<li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+biochemical%2C+biophysical%2C+and+physiological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano l'interesse finanziario concorrenti seguenti: Noireaux laboratorio riceve fondi per la ricerca da microarray, un distributore del kit di espressione della proteina senza cellula MYtxtl.

Seguendo la tecnica in Chen, et al. 14 per SPMC, un passaggio critico è raggiunto nel determinare le condizioni adeguate per superinfezione. Il parametro che controlla maggiormente capacità di un ceppo di host di resistere a superinfezione è frequentemente la concentrazione iniziale del fago d'infezione. Cellule dell'ospite devono essere in fase di crescita logaritmica prima infezione iniziale con una piccola quantità del fago. Alla fine, il fago raggiungerà anche crescita logaritmica e l...

Nell'ultimo decennio, la tecnologia di espressione senza cellula è stata studiata per applicazioni innovative di indirizzo in biologia relativa sintetica e quantitativa di aree di ricerca multidisciplinare emergente. Originariamente utilizzato per esprimere proteine indipendenti di un organismo vivente, nuovi sistemi senza cellula di TXTL sono stati sviluppati per entrambi Scienze di base e applicata1,2, ampliando notevolmente il campo di questa tecnologia. La nuova generazione di piattaforme TXTL è stata progettata per essere facile da usare, più efficiente (raggiungendo 2 mg/mL di sintesi proteica in batch mode3), più versatile a livello di trascrizione4e modulare in modo da integrare facilmente romanzo naturale o funzioni sintetiche che ampliano le funzionalità esistenti sistemi biologici5,6. In particolare, sistemi TXTL senza cellula sono diventati comodo per la prototipazione rapida di programmi genetici, quali elementi regolatori o piccoli circuiti genetici7,8,9, riducendo la progettazione-costruzione-prova ciclo per un paio di giorni. Notevolmente, i nuovi sistemi TXTL sono anche in grado di elaborare programmi di grandi dimensioni del DNA come la sintesi completa di fagi10,11, dimostrando forte abbastanza prestazioni per supportare la ricostituzione dell'attivo genomica DNA codificato entità viventi.
TXTL sistemi presentano molti vantaggi rispetto ai tradizionali in vitro costruttiva analisi biochimiche. Senza cellula TXTL collega il processo di espressione genica al prodotto finale in un ambiente aperto e ridotto, in contrasto con il complesso citoplasma di una cellula vivente. TXTL utilizza il DNA per ricostruire sistemi biochimici in vitro, che, con moderne tecniche di assemblaggio di DNA, è conveniente e veloce oltre a non richiedere fasi di purificazione della proteina fastidiosa. Espressione senza cellula fornisce accesso diretto alla maggior parte dei componenti nelle reazioni biochimiche, permettendo così una dissezione più profonda delle interazioni molecolari12. In una reazione di TXTL, uno può cambiare le impostazioni biochimiche e biofisiche a volontà, che è quasi impossibile in una cellula vivente. Dato questi vantaggi e miglioramenti recenti, la tecnologia TXTL sta diventando sempre più popolare come una piattaforma alternativa per la biologia sintetica e quantitativa. Mentre la comunità di ricerca utilizzando TXTL è in rapida crescita e TXTL sta diventando una tecnologia standard in Bioingegneria, è essenziale comprendere come utilizzare tali piattaforme al fine di sviluppare adeguate pratiche relazionate all'esecuzione delle reazioni di TXTL e alla interpretazione dei risultati.
In questo articolo, descriviamo come utilizzare un sistema TXTL di e. coli tutto per sintetizzare, nelle reazioni di uno-pentola, batteriofagi dal loro genoma11, quali MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Vi mostriamo come la quantità di fagi sintetizzata cambiamenti per quanto riguarda alcune delle impostazioni biochimiche delle reazioni (concentrazioni di magnesio e potassio). Affollamento molecolare, emulato attraverso una gamma di PEG 8000 concentrazioni, ha un effetto drammatico sulla sintesi dei fagi parecchi ordini di grandezza. La realizzazione di questi grandi sistemi biochimici nelle reazioni di singola provetta che ricapitolano contemporaneamente i processi di trascrizione, traduzione e auto-assemblaggio, sono interessante per affrontare questioni fondamentali legate alla biologia e biofisica 10 (regolazione genica, self-assembly), come pure per lo sviluppo di applicazioni, ad esempio di riuso funzioni dei fagi per costruire nuove nanostrutture13. Oltre a un pratico su TXTL, sono disponibili metodi per l'amplificazione dei fagi, genoma estrazione e purificazione e quantificazione dei fagi dall'analisi della placca. I metodi presentati in questo manoscritto sono appropriati per i ricercatori che utilizzano sistemi senza cellula basata l'Estratto di e. coli e sono interessati a batteriofagi.
I protocolli presentati in questo lavoro si possono riassumere come segue: amplificazione 1) dei fagi (giorno 1: preparare l'inoculazione cellule, giorno 2: singola placca, più crescita dei fagi e concentrazione e 3 ° giorno: purificazione del fago), 2) estrazione di DNA Double-stranded del genoma (estrazione del fenolo/cloroformio) e 3) senza cellula reazione dei fagi e titolo esperimento (giorno 1: piastra di cellule dell'ospite e rendere le piastre di agar, giorno 2: reazione senza cellula e host cella pre-cultura e il giorno 3: titolo di cultura e dei fagi cellula ospite).

<table><tbody><tr><td>Provette per ultracentrifugazione</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Creatore di gradienti</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>vedi Anale Biochem. 1985 luglio; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Siringa e cannula smussata</td><td>Monoject</td><td>8881513918 e 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a foro largo</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di placche</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Colony Counter Modello C-110</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Sistema senza cellule</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Modello 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB ricetta piastra</td><td></td><td></td> agar <td>25 g/L terreno Luria-Bertani (brodo LB, Miller - Fisher BioReagents codice prodotto BP1426) e 15 g/L Bacto-Agar solido (Brenton, Dickenson and Company - codice prodotto 214010).</td></tr></tbody></table>

sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Una nuova generazione di sistemi senza cellula trascrizione-traduzione (TXTL), progettato per avere una maggiore versatilità e modularità, fornire nuove funzionalità per eseguire delle scienze di base ed applicate in provetta reazioni. Nell'ultimo decennio, senza cellula TXTL è diventata una tecnica potente per un'ampia gamma di biologia related to quantitativa e sintetiche aree di ricerca multidisciplinare romanzo. Le nuove piattaforme TXTL sono particolarmente utili per costruire e interrogare i sistemi biochimici mediante l'esecuzione di circuiti gene sintetico o naturale. In vitro TXTL ha dimostrato conveniente rapidamente elementi regolatori prototipo e reti biologiche anche per quanto riguarda Riepilogo molecolare autoassemblaggio meccanismi trovano nei sistemi viventi. In questo articolo, descriviamo come infettivi batteriofagi, quali MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), interamente sono sintetizzati dal loro genoma in reazioni di uno-pentola usando un tutti Escherichia coli, sistema senza cellula TXTL. Sintesi dei tre fagi sono quantificato utilizzando il saggio della placca. Vi mostriamo come la resa del fago sintetizzato dipende dalle impostazioni delle reazioni biochimiche. Affollamento molecolare, emulato attraverso una controllata concentrazione di PEG 8000, influisce sulla quantità di fagi sintetizzati da ordini di grandezza. Inoltre descriviamo come amplificare i fagi e purificare i loro genomi. L'insieme di protocolli e risultati presentati in questo lavoro dovrebbe essere di interesse per i ricercatori multidisciplinari coinvolti in Bioingegneria e biologia sintetica senza cellula.

Indichiamo quattro risultati rappresentativi. Nella Figura 1, vi presentiamo una serie di controlli negativi per garantire che il sistema TXTL senza cellula e le scorte di DNA dei fagi non sono contaminate con vita cellule di Escherichia coli . Verificare che il sistema TXTL senza cellula è libero di intatto e. coli contaminazione della cellula da placcatura sia una soluzione di reazione non incubate e incubate Sub del DNA genomico (<strong ...

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è descrivere come i batteriofagi vengano sintetizzati a partire dal loro genoma utilizzando un sistema completamente cell-free di trascrizione e traduzione basato su E.coli. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia sintetica, come chiarire i meccanismi molecolari di autoassemblaggio nei sistemi viventi. Il principale vantaggio di questa tecnica è la versatilità della piattaforma.Molti sistemi biologici possono essere completamente riprodotti e finemente regolati per l'analisi sperimentale. Iniziare questa procedura preparando le placche fagiche come descritto nel protocollo testuale. Utilizzare l'estremit&agrave; di una pipetta di Pasteur sterile per prelevare e rimuovere una singola placca.Soffiare la placca nelle cellule diluite. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Per verificare l'infezione completa, prelevare un campione di 500 microlitri in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 10 microlitri di cloroformio.Vortexare immediatamente la miscela ad alta velocità e osservare se la soluzione si schiarisce, il che indica l'infezione da fago. Una volta che le cellule sono completamente i

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Costruzione di una biblioteca con fosmid ambientale DNA genomico isolato dal continuum profondità verticale di un fiordo stagionalmente ipossia è descritto. La biblioteca clone risultante è raccolto in 384 pozzetti e archiviati per il sequenziamento a valle e screening funzionale con l'applicazione di un sistema automatizzato di raccolta colonia.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione...

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Questo protocollo di cinque giorni delinea tutte le fasi, attrezzature e software supplementare necessario per la creazione e l'esecuzione di un sistema di espressione TX-TL cell-free da zero efficiente Escherichia coli endogeno basato. Con i reagenti, il protocollo dura 8 ore o meno per impostare una reazione, raccogliere e elaborare i dati.

Protocolli per l'implementazione di un Escherichia coli Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Questo protocollo descrive il metodo, i materiali, le attrezzature e i passaggi per la preparazione bottom-up di RNA e proteine che producono cellule sintetiche. Il compartimento acquoso interno delle cellule sintetiche conteneva il lisato batterico S30 incapsulato all'interno di un bistrato lipidico (cioè liposomi stabili), utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione dell'acqua-in-olio.

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Questo protocollo descrive il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) utilizzato nella costruzione di cellule sintetiche. Delinea le fasi chiave con risultati rappresentativi in diversi micro-compartimenti. Il protocollo mira a stabilire le migliori pratiche per i diversi laboratori della comunità delle cellule sintetiche, facendo avanzare i progressi nello sviluppo delle cellule sintetiche.

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Questo protocollo descrive un metodo per produrre e valutare l'attività antimicrobica e la citotossicità del peptide cationico Mel4 e del mimetico dei peptidi RK758. Integrando sintesi chimica, espressione ricombinante e saghi funzionali standardizzati, fornisce un flusso di lavoro semplificato per la produzione e il test di peptidi e mimetici di piccole molecole.

Produzione e test di peptidi antimicrobici e dei loro mimetici

Scopri la sintesi dei batteriofagi infettivi utilizzando un sistema di espressione senza cellula basato su E. coli. Questo metodo innovativo permette di studiare i meccanismi di autoassemblaggio molecolare in biologia sintetica.

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

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