Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di descrivere come i batteriofagi vengono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di traduzione di trascrizione completamente privo di cellule di E.coli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia sintetica, come chiarire i meccanismi di autoassemblaggio molecolare nei sistemi viventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è la versatilità della piattaforma.

Molti sistemi biologici possono essere completamente ricapitolati e finemente sintonizzati per l'analisi sperimentale. Inizia questa procedura con la preparazione delle placche fagiche come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare l'estremità di una pipetta Pasteur sterile per il nucleo e rimuovere una singola placca.

Soffiare la placca nelle cellule diluite. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Per verificare l'infezione completa, prelevare un campione da 500 microlitri in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 10 microlitri di cloroformio.

Agitare immediatamente la miscela ad alta velocità e osservare se la soluzione si chiarifica, il che indica un'infezione da fago. Una volta che le cellule sono completamente infette, incubare per altre due ore. Quindi, aggiungere la DNasi prima di centrifugare le cellule a 8.000 volte g e quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante, quindi sospendere nuovamente il pellet in 10 millilitri di cloruro di magnesio 1X Tris. Aggiungere 500 microlitri di cloroformio e vorticare ad alta velocità per lisare le cellule. Chiarificare mediante centrifugazione a 12.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi decapsulare il surnatante in un tubo conico da 15 millilitri e conservarlo a quattro gradi Celsius. Preparare quattro gradienti di saccarosio da cinque al 45% pipettando 2,5 millilitri di saccarosio al 45% in quattro provette per ultracentrifuga. Ricoprire lo strato con circa 2,6 millilitri di saccarosio al 5%, fermandosi quando il liquido raggiunge i due millimetri dal bordo del tubo.

Miscelare i gradienti mediante rotazione del tubo di inclinazione utilizzando uno strumento di formazione del gradiente per 43 secondi a 86 gradi e 23 giri/min. Utilizzando una pipetta da un millilitro, aggiungere 500 microlitri della sospensione fagica raggruppata portando il puntale a contatto con la superficie del liquido e dosando molto lentamente il volume sulla parte superiore del gradiente di saccarosio, facendo attenzione a non mescolare attraverso un pipettaggio rapido. Centrifugare a 70.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Immergere una cannula smussata nella soluzione fino a quando la punta non è centrata sul bordo superiore della banda dei fagi. Rimuovere la fascia tirando lo stantuffo della siringa fino a rimuovere la maggior parte della banda dei fagi. Quindi aggiungere il volume di saccarosio con il fago sospeso a tre o quattro provette per ultracentrifuga.

Riempire i tubi a una distanza compresa tra tre e quattro millimetri dalla parte superiore del tubo con 1XTM freddo. Coprire i tubi con pellicola di paraffina e capovolgerli per mescolare. Rimetti le provette in un'ultracentrifuga e spendi a 145.000 volte g per un'ora a quattro gradi Celsius.

Versare rapidamente il surnatante e scolare a testa in giù su salviette usa e getta. Dividere da 200 a 400 microlitri di 1XTM freddo su tutti i pellet e risospendere per una notte a quattro gradi Celsius. Non è necessario agitare.

Il giorno prima di creare i titoli, preparare una coltura di cellule ospiti di E.coli in 10 millilitri di terreno di crescita LB e lasciare la coltura in un incubatore agitatore impostato a 250 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, preparare una miscela master pipettando 5,25 millilitri di agar superiore, 220 microlitri di campioni di fagi diluiti e 50 microlitri di cellule batteriche ospiti in una provetta di coltura da 14 millilitri. Tappare il tubo di coltura e vorticare ad alta velocità.

Recupera due piastre di coltura dall'incubatore a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere 2,5 millilitri di master mix lentamente al centro del primo piatto. Ruotare delicatamente la piastra a mano per distribuire uniformemente la miscela master in modo che si estenda su tutta la piastra di coltura.

Attendere 20 minuti per garantire la solidificazione dell'agar superiore. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per quattro-sette ore. Contare le placche e determinare la concentrazione di fagi per ogni campione di reazione.

Diluire una parte del brodo fagico a 400 microlitri con tampone 1XTM in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Aggiungere un volume uguale di cloroformio trifenolo alla diluizione. Agitare delicatamente la miscela su un dondolo da laboratorio o a mano per cinque minuti.

Quindi centrifugare l'emulsione risultante a 17.000 volte g in una centrifuga da banco per cinque-10 minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore in un nuovo tubo, facendo attenzione a non disturbare il confine di interfase. Ripetere questi passaggi altre due volte per un totale di tre estrazioni di fenolo.

Trasferire la fase acquosa in una provetta nuova e aggiungere un volume uguale di cloroformio. Agitare e centrifugare prima di trasferire il campione di DNA acquoso in una provetta pulita. Successivamente, aggiungere 0,4 volumi di acetato di sodio a tre molari e tre volumi di etanolo al 95%.

Metti il tubo in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per le precipitazioni notturne. Centrifugare a 17.000 volte g in una centrifuga da banco per 10-15 minuti. Rimuovere ed eliminare il surnatante, mediante travaso o pipettaggio.

Quindi aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% e agitare delicatamente il tubo fino a quando il pellet non galleggia libero dal fondo del tubo. Dopo la centrifugazione, rimuovere e gettare l'etanolo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Dopo aver aggiunto l'etanolo e centrifugato come prima, rimuovere e scartare l'etanolo una seconda volta, facendo nuovamente attenzione a non disturbare il pellet.

Asciugare il pellet all'aria sul piano di lavoro per 30-60 minuti. Una volta asciutto, aggiungere 50 microlitri di acqua distillata doppia al pellet e incubare per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius per rimettere in sospensione. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando misure di assorbimento a 280 nanometri.

Per eseguire la reazione senza cellule, aliquotare il volume indicato di estratto grezzo, il 33% del volume finale di reazione, in una provetta da microcentrifuga. Preparare il master mix come elencato nel protocollo di testo. Aggiungere il volume appropriato di ciascun componente all'estratto grezzo.

Dopo aver aggiunto l'ultimo componente, omogeneizzare la reazione mediante vortex. Quindi dividere la miscela master in n provette per microcentrifuga. Quindi, aggiungere i volumi indicati dei componenti variabili all'array di mix master.

Aggiungere acqua a ciascuna reazione per raggiungere il volume di reazione finale desiderato prima del vortice. Quindi incubare le provette per microcentrifuga a 29 gradi Celsius per almeno otto ore o durante la notte. Dopo aver preparato le cellule per il titolo fagico come descritto nel protocollo di testo, titolare la soluzione finale LB di reazione libera da cellule come dimostrato in precedenza in questo video.

Qui sono mostrati i risultati rappresentativi di una reazione libera da cellule che sintetizza il fago phi X 174. Questa placca fagica mostra una reazione fagica riuscita che è stata titolata a una diluizione appropriata, evidente dal numero numerabile di placche. Tuttavia, una reazione riuscita può manifestarsi male se il fattore di diluizione è troppo basso per la resa fagica della reazione.

Questa targa mostra un numero incalcolabile di placche. Qui è mostrata una piastra con distribuzione disomogenea delle placche fagiche a causa di un insufficiente pre-bilanciamento della temperatura della piastra di coltura. Durante il titolo fagico, la piastra di coltura ha solidificato la reazione nella parte inferiore destra della piastra.

Le condizioni di affollamento molecolare hanno un forte effetto sulla sintesi dei fagi per phi X 174 e, T7.In particolare, la resa dei fagi per T7 diminuisce di tre ordini di grandezza quando le concentrazioni di PEG scendono dal 4% al 2% in peso in volume. Una volta padroneggiata, la purificazione dei fagi e l'estrazione del DNA possono essere eseguite in due giorni se eseguite correttamente. La reazione senza cellule richiede solo poche ore quando non ci sono problemi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come far crescere i fagi, estrarre e purificare il loro DNA e utilizzare il risultato per ricostituire i fagi completamente infettivi utilizzando il sistema di reazione senza cellule. Lavorare con il fenolo può essere estremamente pericoloso e durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare precauzioni come camice da laboratorio, protezione per gli occhi e guanti. Tutti i lavori con contenitori aperti di fenolo devono essere eseguiti in una cappa aspirante.