Derivazione libera dell'integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo usando la matrice Laminina 521

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di derivare cellule staminali pluripotenti indotte umane omogenee. Questo metodo può essere utilizzato per derivare cellule staminali pluripotenti indotte umane per molti scopi, tra cui la modellazione di malattie, lo screening di farmaci o per derivare cellule per studi preclinici di terapia cellulare. Il vantaggio di questo protocollo è che è robusto e genera cellule omogenee che vengono mantenute in un sistema di coltura facile da usare, privo di xeno e completamente definito chimicamente.

Poiché le cellule iPS umane ricapitolano il background genetico del tessuto del donatore e possono potenzialmente essere differenziate in qualsiasi tipo di cellula rilevante per la malattia, forniscono strumenti eccellenti per la modellazione della tesi. La dissezione bioptica e il prelievo di colonie sono procedure complesse. Vederli eseguiti con mani esperte aiuta nella comprensione delle procedure e ne facilita la ripetizione.

A dimostrare la procedura oggi saranno Harriet RonnHolm e Kelly Day, due tecnici di laboratorio di grande esperienza dell'iPS Core Facility del Karolinska Institutet. I campioni di biopsia cutanea possono essere conservati in PBS più l'1% di penicillina streptomicina per un massimo di 48 ore a quattro gradi Celsius, ma devono essere elaborati il più velocemente possibile dopo essere stati ottenuti. Trasferire la biopsia in un piatto da 35 millimetri.

Immergere la biopsia cutanea in un piatto da 35 millimetri con due millilitri di etanolo al 70% per 30 secondi. Aggiungere un millilitro di soluzione salina bilanciata sterile di Hank integrata con l'1% di penicillina streptomicina a un nuovo piatto da 35 millimetri e trasferire la biopsia nel nuovo piatto. Trasferire la biopsia in un piatto da 35 millimetri riempito con un millilitro di soluzione di dispasi allo 0,1% preparata al momento.

Utilizzando bisturi chirurgici e pinze sterili, tagliare la biopsia cutanea in pezzi da uno a due millimetri cubi. Trasferire i pezzi della biopsia con la soluzione di dispasi in una provetta da 15 millilitri e aggiungere altri due millilitri di dispasi. Sciacquare la pirofila da 35 millimetri con un millilitro di soluzione di dispasi e trasferire la soluzione risciacquata nel tubo da 15 millilitri.

Incubare la biopsia a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, aggiungere quattro millilitri di collagenasi I allo 0,1% alla provetta con i pezzi della biopsia e incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Trenta minuti prima di seminare le cellule, rivestire un pozzetto in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti con un millilitro di gelatina allo 0,1% in DPBS.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo quattro ore di incubazione con collagenasi, centrifugare le cellule digerite a 300 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il digestato in due millilitri di terreno fibroblastico.

Rimuovere la soluzione di gelatina dalla piastra di coltura tissutale a sei pozzetti precedentemente preparata. Trasferire la sospensione cellulare, compresi i pezzi di tessuto rimanenti, nella piastra a sei pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in condizioni di elevata umidità.

I fibroblasti sono pronti per essere fatti passare in un pallone di coltura tissutale T25 quando sono confluenti all'80%. I fibroblasti al passaggio da due a quattro sono ottimali per la riprogrammazione poiché l'efficienza di riprogrammazione è generalmente maggiore per i fibroblasti a passaggio inferiore. Aspirare il terreno di coltura cellulare dal pallone e lavare le cellule con un millilitro di DPBS.

Aspirare il DPBS e aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,5%. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando le cellule non si sono staccate. Aggiungere due millilitri di terreno fibroblastico, risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Centrifugare a 300 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in due millilitri di terreno fibroblastico. Dopo aver contato i fibroblasti con un ematocitometro, seminare cinque volte 10 al quarto cellulare in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, poiché il virus Sendai verrà maneggiato, continuare la procedura in un laboratorio BSL-2 designato utilizzando gli appropriati dispositivi di protezione individuale. Aspirare il terreno di coltura cellulare e aggiungere 250 microlitri di soluzione di virus Sendai.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Un giorno prima di raccogliere le colonie, preparare le piastre di coltura tissutale rivestite con LN-521 a 24 pozzetti. Pipettare 250 microlitri di soluzione LN-521 in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.

Sigillare la piastra con parafilm e incubare a quattro gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, aspirare la soluzione LN-521 da un pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri di E8 nel pozzetto. Si consiglia l'uso di una retina per capelli e di una maschera procedurale durante la raccolta delle colonie al microscopio stereoscopico.

Le colonie sono pronte per essere raccolte quando raggiungono una dimensione superiore a un millimetro di diametro, mostrano spigoli vivi e crescono in monostrati omogenei. Non raccogliere colonie con bordi sfocati e grandi masse cellulari eterogenee non compatte. Taglia ogni colonia con un bisturi in pezzi più piccoli in uno schema a griglia.

Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per raschiare meccanicamente i fogli cellulari dalla piastra, quindi trasferire il foglio in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti precedentemente rivestita con LN-521. La selezione delle colonie è fondamentale per il successo di questo protocollo. La raccolta di alcune colonie aggiuntive garantirà l'attaccamento in numero sufficiente.

Lasciare che le celle si attacchino senza cambiare il terreno E8 per 48 ore. Passa enzimaticamente le cellule quando le colonie hanno raggiunto una dimensione superiore a cinque millimetri. Aspirare il terreno di coltura cellulare dalle cellule e lavare con 250 microlitri di DPBS.

Aspirare il DPBS e aggiungere 250 microlitri di reagente di dissociazione. Incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Osserva che le cellule hanno iniziato ad arrotondarsi per eccesso.

Staccare le cellule dalla piastra sciacquando le cellule con il reagente di dissociazione. Aggiungere 500 microlitri di terreno E8 in una provetta da 15 millilitri e trasferire le cellule e il reagente di dissociazione nella provetta. Centrifugare a 300 volte g per tre minuti.

Aspirare il surnatante dal tubo da 15 millilitri e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di terreno E8. Contare le cellule utilizzando un ematocitometro e seminare da 2,5 a cinque volte 10 fino alla quarta cellula in un altro pozzetto prerivestito LN-521 precedentemente preparato contenente 500 microlitri di terreno E8 a temperatura ambiente. Aggiungere l'inibitore ROCK a una concentrazione finale di 10 micromolari.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Utilizzando questo protocollo, colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane emergono dai fibroblasti trasdotti a circa il giorno 12 dopo la trasduzione. Le colonie erano pronte per essere raccolte a circa tre o quattro settimane dopo la trasduzione.

Le caratteristiche preferite includono masse cellulari compatte appiattite, crescita come monostrati omogenei e spigoli vivi. Queste immagini in campo chiaro mostrano una linea cellulare umana iPS omogenea completamente riprogrammata rispetto a una linea cellulare altamente eterogenea. La perdita del vettore del virus Sendai è stata confermata dall'assenza di marcatori specifici del vettore del virus Sendai nelle cellule iPS umane al passaggio 12, in contrasto con le cellule iPS umane al passaggio tre.

La colorazione immunocitochimica di cellule derivate per i marcatori di pluripotenza OCT4, SSEA-4 e NANOG ha prodotto un risultato omogeneamente positivo. L'espressione dell'mRNA dei geni della pluripotenza endogena è stata dimostrata mediante PCR con trascrittasi inversa. Le colture cellulari contenenti cellule parzialmente riprogrammate che non esprimevano fattori di pluripotenza sono state scartate.

Il potenziale di differenziazione delle cellule iPS umane è stato valutato mediante la formazione di corpi embrioidi. La PCR in tempo reale dopo 21 giorni di differenziazione del corpo embrioide ha rilevato l'espressione dell'mRNA di marcatori specifici dell'endoderma, del mesoderma e dell'ectoderma che hanno confermato che le cellule iPS umane derivate erano in grado di differenziarsi nei tre strati germinali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita con circa 22 ore di pratica durante un periodo di tempo di circa 16 settimane.

Le cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate possono essere differenziate in qualsiasi tipo di cellula del corpo umano adulto per rispondere a qualsiasi domanda rilevante per il tuo campo di ricerca. Dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia una buona comprensione di come eseguire i passaggi necessari per derivare cellule staminali pluripotenti indotte da biopsie cutanee.