Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

L'obiettivo generale di questo protocollo di immunocolorazione è quello di valutare la densità sinaptica in fette di cervello ex vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze ed è utile quando si studiano i cambiamenti di densità delle sinapsi, come osservato nelle malattie neurodegenerative. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una stima semiquantitativa della densità delle sinapsi, che può essere confrontata tra le condizioni sperimentali preparate contemporaneamente.

Inizia posizionando il cervello del topo su una capsula di Petri. Quindi, rimuovere il cervelletto e una piccola sezione della corteccia frontale con un bisturi, prima di emisectare sulla linea mediana del cervello. Gira una semisfera sul lato che è stato appena tagliato e incollalo sul tavolino di un vibratomo.

Versare l'ACSF ghiacciato nella camera del microtomo e ossigenare la soluzione. Tagliare sezioni spesse da 200 a 300 micron dell'intera regione di interesse. Per l'ippocampo, si dovrebbero ottenere circa tre o quattro fette per emisfero.

Utilizzare una pipetta Pasteur di plastica per trasferire le fette in una camera a temperatura controllata immersa in ACSF ossigenato. Mantenere a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Trascorsi 30 minuti, trasferire le fette in una piastra a 24 pozzetti contenente il 4% di paraformaldeide con il 4% di saccarosio e fissare per 20 minuti a un'ora a temperatura ambiente.

Dopo il fissaggio, lavare le fette tre volte in 1x PBS per 10 minuti ogni volta. Per iniziare la colorazione con immunofluorescenza, sostituire la PBS nei pozzetti della fetta con un tampone bloccante e permeabilizzante e incubare a temperatura ambiente per quattro-sei ore sull'agitatore. Verso la fine della fase di blocco, diluire l'anticorpo a vGlut1 da uno a 2.000 in tampone bloccante e permeabilizzante.

Si prega di notare che questa diluizione può variare a seconda dell'azienda e del lotto di anticorpi utilizzati. Incubare le fette nella soluzione di anticorpi primari per una notte a quattro gradi Celsius. Usa una piattaforma di scuotimento con un movimento vigoroso.

La distribuzione uniforme degli anticorpi primari e secondari è importante per una colorazione ottimale. Nella nostra esperienza, l'agitazione vigorosa consente la migliore penetrazione degli anticorpi. Dopo l'incubazione in anticorpo primario, lavare le fette tre volte in PBS per 10 minuti ogni volta, come prima.

Durante l'ultimo lavaggio, diluire gli anticorpi secondari appropriati da uno a 500 in tampone bloccante. Quindi, incubare le fette in questa soluzione per due o tre ore a temperatura ambiente. Assicurarsi che le fette siano protette dalla luce, poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.

Dopo aver lavato le fette, come prima, rimuovere con cura le fette dalla piastra a 24 pozzetti con una spazzola e posizionarle uniformemente su vetrini preetichettati. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sopra ogni fetta. E poi, appoggiate delicatamente un vetrino coprioggetti sopra le fette, facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle d'aria.

Proteggere dalla luce e lasciare asciugare i vetrini per un minimo di tre o quattro giorni a temperatura ambiente. Conservare i vetrini a quattro gradi Celsius a breve termine. Ma per la conservazione a lungo termine, mantienili a meno 20 gradi Celsius.

Inizia utilizzando un obiettivo 10x o 20x per identificare la regione dell'ippocampo da visualizzare, in questo caso, le sinapsi tra i neuroni piramidali CA1 e gli assoni collaterali di Schaffer. Passa a un obiettivo a immersione in olio 40x o 63x e assicurati che l'anatomia della fetta sia intatta identificando i neuriti continui e una struttura organizzata. Utilizzare un marcatore neuronale, come MAP2, come riferimento.

Regola le impostazioni per ciascun canale per ottenere un segnale e un contrasto ottimali con una risoluzione di 1,024 x 1,024 pixel. Imposta l'intensità di ciascun laser per evitare la saturazione di qualsiasi pixel. Valutare la profondità in cui la colorazione è uniforme, quindi impostare il software per acquisire pile di immagini di almeno otto piani equidistanti da 250 nanometri.

Quindi, prendi tre pile di immagini rappresentative adiacenti dalla stessa area di interesse per sezione. Ripetere l'acquisizione in almeno tre fette per condizione e da sei a otto animali per gruppo di trattamento. Le sinapsi eccitatorie possono essere identificate mediante colocalizzazione tra vGlut1 e PSD95, come indicato dalle frecce bianche nell'immagine con ingrandimento maggiore.

Il blocco della segnalazione Wnt nell'ippocampo adulto inducendo l'antagonista Wnt Dkk1 innesca la perdita eccitatoria delle sinapsi, in particolare nello strato CA1 radio. La percentuale di sinapsi eccitatorie tra i topi di controllo e i topi iDkk1 è stata quantificata ed è risultata significativamente più bassa negli animali transgenici iDkk1. Le sinapsi inibitorie possono essere identificate dalla colocalizzazione tra vGat e Gephyrin.

La percentuale di sinapsi inibitorie tra i topi di controllo e i topi iDkk1 è stata quantificata e non è stata rilevata alcuna differenza significativa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prestare la massima attenzione possibile alle fette. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la densità sinaptica in fette di cervello ex vivo.