Name: Basato su Fourier analisi di diffrazione di Live Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Scopri l'analisi di diffrazione basata su Fourier per caratterizzare la locomozione di Caenorhabditis elegans in tempo reale. Questo metodo permette di distinguere fenotipi wild type e Roller per studi neurobiologici.

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Ringraziamo Juan Vasquez per i suoi contributi computazionali con questo progetto. Siamo grati per il sostegno del Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), al fondo di ricerca di Lucy Maynard salmone e la NSF Premio n. 1058385.

1. c. elegans crescita e manutenzione <ol><li>preparare piatti di cultura del nematode.
	<ol><li>Riempire le capsule di Petri con una soluzione di agar e lasciarli a solidificare, poi il seme con una coltura di Escherichia coli del OP50 ceppo 9 , 10.</li>
	</ol></li> <li>Preparare una popolazione iniziale di nematodi adulti su ogni piatto spostando alcuni vermi adulti di fresco pieno di agar Petri con un patch di e. coli. Mantenere le culture del nematode a 20 ° C in un incubatore. 
	Nota: Ceppi di nematodi possono essere reperite al centro del genoma di Caenorhabditis elegans. Per questo studio, il tipo selvaggio, N2, ceppo e il OH7547 (otls199 [gatto-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + rol-6(su1006)]) ceppo, che esibisce un fenotipo di rullo, sono stati utilizzati.</li>
	<li>Propaga worms per future culture.
	<ol><li>Rimuovi il Petri piatto contenente c. elegans e un habitat inutilizzato di Petri da incubatore termostatato. Metterli sul palco di un microscopio per dissezione.</li>
		<li>Accendere il bruciatore di Bunsen e sterilizzare il platino pick del nematode inserendo il metallo nella fiamma fino a quando si illumina di rosso. Consentire il pick raffreddare a temperatura ambiente. Non impostare il pick o lasciare che il plettro entrano in contatto con contaminanti.</li>
		<li>Toccare delicatamente la punta del plettro al bordo del cerchio di batteri. Questa sostanza è appiccicosa e farà raccolta individuali nematodi adulti più facile.</li>
		<li>Trasferire fino a 4 nematodi gravid ad una piastra di Petri Nematode crescita medio (NGM) pieno di agar e incubare a 20 ° C. I vermi si depongono le uova che maturano in quattro giorni.</li>
		<li>Restituire i nematodi rimanenti nell'incubatore dopo lo spostamento di quattro nematodi adulti.</li>
	</ol></li></ol> 2. Configurazione ottica ( Figura 1) <ol><li>Secure l'elio-neon laser vicino all'angolo posteriore sinistro del banco ottico di lavoro e collegarlo a una fonte di alimentazione. 
	Nota: Il laser &#39; s fascio deve soddisfare i requisiti di sovracampionamento. Il c. elegans sono lunghi circa 1 mm, pertanto il raggio laser dovrebbe avere un diametro supera a 2 mm mentre incidente il nematode, ma non superiore a 5 mm in modo che il pattern di diffrazione non è difficile da individuare.</li>
	<li>Disporre un filtro a densità neutra tra il laser a elio-neon e il campione in modo tale che il raggio laser passa attraverso il filtro prima di raggiungere il campione.</li>
	<li>Dello sterzo anteriore alluminio superficie utilizzando due specchi, costruire un periscopio fissando il primo mirror dopo il filtro a densità neutra. Fissare il secondo mirror circa 10 cm sotto il primo mirror per dare spazio per guidare il raggio laser e inserire la provetta tra gli specchi. Allineare il fascio laser e la provetta in modo che il raggio laser si sposta verticalmente attraverso la cuvetta. 
	Nota: La distanza tra l'organismo generano il fotodiodo deve essere molto più grande dell'organismo stesso per raggiungere campo lontano diffrazione. In questo esperimento, la distanza tra la cuvetta e fotodiodo è 20 cm.</li>
	<li>Secure fotodiodo direttamente di fronte il secondo specchio con il sensore rivolto verso lo specchio. 
	Nota: La provetta contenente il nematode verrà inserita tra i due specchi con fascette di chimica. Vedere le sezioni 4 e 5.</li>
	<li>Disponga una provetta piena d'acqua sul cavalletto. Regolare l'altezza dello stand. Regolare le altezze e angoli di specchio 1 e 2, in modo che il raggio laser attraversa la cuvetta volta vicino ma non direttamente a fotodiodo.</li>
	<li>Utilizzare un livello per garantire la forma stand una superficie livellata per la cuvette. Se necessario, regolare gli specchi ulteriormente.</li>
	<li>Collegare il fotodiodo all'oscilloscopio digitale utilizzando il cavo USB fornito con l'oscilloscopio digitale. Collegare l'oscilloscopio digitale al computer che verrà utilizzato per registrare e salvare i dati.</li>
</ol> 3. Installazione di oscilloscopio <ol><li>utilizzando il software per l'oscilloscopio sul computer, impostare la frequenza di campionamento di almeno 8 Hz a risolvere sufficientemente il ciclo thrashing del worm. 
	Nota: La frequenza di campionamento deve essere più di due volte che delle frequenze thrashing previsto delle specie modo che concluda il teorema di Nyquist 11.</li>
</ol> 4. Preparando il verme e la provetta per la raccolta dati <ol><li>trasferire quattro nematodi adulti a una fresco NGM 10 agar-riempito piastra di Petri usando un plettro appiattito, sottile filo di platino (Vedi punto 1.3).</li>
	<li>Rimuovere una cuvetta monouso in plastica dalla confezione, facendo attenzione a toccare solo la cuvetta sui suoi lati scanalati.</li>
	<li>Uso una micropipetta a dispensare acqua distillata nella cuvetta fino a quando la cuvetta è circa l'80% riempita con acqua distillata. 
	Nota: È importante solo usare acqua distillata o ionizzato buffer come M9 10 o tampone fosfato salino (PBS) quando si maneggia i nematodi, come l'acqua del rubinetto contiene composti di microrganismo-uccisione.</li>
	<li>Porre la capsula Petri c. elegans per essere utilizzato in un ambito dissezione.</li>
	<li>Utilizzando il plettro platino, staccare uno maturo di c. elegans di Petri e immergere il plettro nella cuvetta, spostando il pick in cerchi se necessario per sloggiare il nematode.</li>
	<li>Per prevenire bolle formando in cuvetta, riempire la cuvetta con acqua fino a quando si gonfia leggermente sopra la cuvetta &#39; superiore di s. Riempire la cuvetta &#39; s cap interamente con acqua quindi rapidamente messo il tappo sulla provetta.</li>
	<li>Utilizzare un panno di pulizia ottico per rimuovere le goccioline di acqua che possono avere versato sopra e ottica pulizia carta per pulire eventuali piccole goccioline rimanenti.</li>
</ol> 5. Dati-acquisizione in tempo reale dei cambiamenti di intensità reticolo di diffrazione <ol><li>accendere l'elio-neon laser e regolare l'impostazione di frequenza/colore che produce un raggio rosso. Attivare il sensore. 
	Attenzione: Utilizzare un fascio di bassa energia a 632 nm, come c. elegans evitare luce ad alta frequenza (blu) 12.</li>
	<li>Individuare il worm nella cuvetta. Tenendo la cuvetta sui suoi lati scanalati, inclinare delicatamente la provetta fino al nematode è approssimativamente nel centro della parte della provetta. 
	Nota: Agitazione o inclinando la cuvetta violentemente fa sì che il worm per scontrarsi con le pareti della provetta. Ciò può danneggiare il nematode.
	<ol><li>Posto la provetta sul supporto nel sistema ottico, il worm all'interno il laser di centraggio &#39; s fascio riflesso da 1 specchio a specchio 2. Assicurarsi di eliminare le luci parassite.</li>
	</ol></li> <li>Centro il worm nel raggio laser.
	<ol><li>Posizionare il fotodiodo nel pattern di diffrazione, in modo che la posizione del fotodiodo e massima centrale la figura di diffrazione non coincidono.</li>
		<li>Regolare il filtro a densità neutra per evitare la saturazione del fotodiodo. Ruotando la rotellina del filtro di densità neutra regola l'intensità della luce.
		<ol><li>Ruotare la densità neutra filtro in modo che aumenta la tensione in uscita dal fotodiodo. 
			Nota: La tensione di uscita è osservato utilizzando il software per il digital fotodiodo. Il fotodiodo è saturo se la tensione non cambia. In tal caso, ruotare il filtro a densità neutra, fino a quando la tensione si riduce senza appiattire in una lettura minima. Assicurarsi che il segnale di tensione non appiattire presso le letture di picco, che indica la saturazione del fotodiodo. Ridurre l'intensità della luce ruotando la rotellina del filtro di densità neutra se si osserva una saturazione.</li>
		</ol></li> <li>Una volta che il modello di diffrazione movimento è visibili, Raccogli dati con fotodiodo facendo clic sul pulsante start sul software di controllo dell'oscilloscopio durante il monitoraggio il worm &#39; s movimento. Continuare a prendere misure fino a quando il verme si muove fuori il raggio laser e la diffraczione modello scomparirà, che richiede solitamente circa 20 s.
		<ol><li>Fermata la raccolta di dati processo cliccando il pulsante di stop sul software per l'oscilloscopio. Salvare ogni prova &#39; s dati in formato CSV o txt.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Ripetere i passaggi da 5.2-5.3 fino ad almeno 50 set di dati sono stati raccolti per ogni fenotipo. Utilizzare otto-dieci animali per prova.</li>
	<li>Se la cuvetta è graffiato smaltire e il verme e ripetere il passaggio 4. Se il worm è danneggiato nel trasferimento, smaltirlo e sciacquare la provetta con acqua distillata prima di ripetere passaggio 4 utilizzando la stessa cuvetta.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 5 tramite il OH7547 &#34; rullo &#34; sforzo, facendo attenzione a etichettare i dati per indicare il ceppo di vite senza fine.</li>
</ol> 6. Spettro di Fourier di dati <ol><li>importare i dati acquisiti in un programma di analisi di dati in grado di eseguire trasformazioni di Fourier discreta 3.</li>
	<li>Eseguire trasformate di Fourier su ogni set di dati utilizzando l'opzione veloce di Fourier transform (FFT) del software.</li>
	<li>Media le frequenze dai risultati della FFT per ogni ampiezza per il tipo selvaggio N2 worm.</li>
	<li>Ripetere il punto 6.3 utilizzo FFTs dalla OH7547 &#34; rullo &#34; worm.</li>
</ol> 7. Modellazione dello spettro di Fourier <ol><li>programma un modello binario del nematode locomozione (Vedi programma incluso nei materiali supplementari). 
	Nota: Questo modello è un'approssimazione, che al primo Visualizza le caratteristiche prominenti del movimento del verme. Il modello può essere raffinato come i risultati sono confrontati con i vermi effettivi. Forme di vite senza fine sono approssimazioni utilizzando microscopio foto 13.
	<ol><li>Crea fotogrammi sequenziali del modello binario si muove attraverso almeno due cicli di vite senza fine ( Figura 2a). Vedere i video in materiali supplementari; C Worm video (CWorm.avi) e Worm W video (WWorm.avi).</li>
	</ol></li> <li>Produrre modelli di diffrazione sequenziale. Vedere i video nei materiali supplementari. C Worm diffrazione video (CWormDiff.avi) e Worm W video (WWormDiff.avi).
	<ol><li>Di Fourier ogni binario cornice dell'immagine verme. Più grande l'imbottitura della cornice intorno il worm, migliore la risoluzione dell'immagine di diffrazione sarà. 
		Nota: Il valore assoluto di ogni fotogramma di trasformata di Fourier è proporzionale al corrispondente modello di diffrazione ( Figura 2b).</li>
		<li>Regolare il contrasto del pattern di diffrazione mappando le intensità dei pattern di diffrazione su una scala logaritmica. 
		Nota: Telecamere e gli occhi tendono a funzionare su una scala non lineare. Una scala logaritmica può simulare come un reticolo di diffrazione è in genere percepito dall'occhio umano.</li>
	</ol></li> <li>Estrarre il segnale di diffrazione modellato.
	<ol><li>Prendere una posizione fuori centro che corrisponde alla posizione del fotodiodo nel modello di diffrazione.</li>
		<li>Aggiungere gli elementi di matrice vicini che circondano la posizione del fotodiodo per simulare le dimensioni del fotodiodo. Le dimensioni del fotodiodo sono in genere 0,1% del pattern di diffrazione modellato.</li>
		<li>Record e trama la sequenza della grandezza della diffrazione segnali. Controllare che il segnale sia fisicamente ragionevole (cioè, in caso di sovraccarico del periodico, il segnale dal fotodiodo dovrebbe essere periodico pure).</li>
	</ol></li> <li>Fourier trasformano il segnale di diffrazione ottenuto al punto 7.3 e confrontare i risultati con i dati sperimentali.</li>
	<li>Ripetere per vari ceppi di vite senza fine e confrontare.</li>
</ol>

<ol><li>Magnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/Html/6-1850026_21423.htm">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+Student%27s+Guide+to+Fourier+Transforms+with+Applications+in+Physics+and+Engineering%22">A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).</li>
<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+A+revolution+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>Thibault, P., Rankenburg, I. C. <a target="_blank" href="http://aapt.scitation.org/doi/10.1119/1.2750378">Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory.</a> Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).</li>
<li>Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/233743787_Phase_retrieval_of_diffraction_patterns_from_noncrystalline_samples_using_the_oversampling_method">Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method.</a> Phys. Rev. B. 67, 174104(2003).</li>
<li>Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030402613003215">Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography.</a> Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).</li>
<li>Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroToxicology%22%5BJournal%5D)">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li>
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<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).</li>
<li>Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1306.4423.pdf">Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids.</a> Phys. Fluids. 25, 081902(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Compresi gli specchi dei dati con inattività sarà distorcere i risultati poiché artificiale frequenze più basse saranno mediate nei risultati. Saturare il fotodiodo può essere riconosciuto da cime piatte o "tagliare" picchi nei dati raw. Dividendo ogni set di dati grezzi per intensità di picco vi aiuterà con la contabilità per le fluttuazioni dell'intensità del laser.
Le frequenze di picco sono un indicatore nel suo complesso thrashing frequenza; Tuttavia, complicato movimento provoca interferenze a frequenze di battimento il pattern di diffrazione e devono essere esaminati attentamente.
Questo metodo può essere utilizzato per studiare la locomozione dei altri nematodi. L'ambiente può essere modificato su un altro supporto. Lunghezze d'onda può essere cambiato pure. Lavorando nella gamma visibile dello spettro elettromagnetico è più semplice e sicuro.
Un modello più raffinato simulerà gli spettri di diffrazione più realisticamente in futuro. Un modello futuro può includere un worm che possa modificare gli orientamenti, che non inciderebbe sulla frequenza posizioni ma altezze dei picchi relativi. Un modello più realistico sarebbe consentono una distribuzione probabilistica delle frequenze di botte, che amplierebbe le cime come i dati sperimentali. Una diffusione nelle frequenze spiegherebbe variazioni nelle frequenze di botte.
L'attuale forma di verme è grezza, soprattutto nella regione della coda e della testa, che dovrebbe essere più affusolata rispetto nel modello corrente. Può essere interessante per condurre una dettagliata analisi delle serie temporali del segnale poiché potrebbe dare indizi sulla complessità della locomozione in diversi mutanti.
Vale la pena considerare la praticità di espandere questa tecnica in che caratterizzano i nematodi multipli contemporaneamente. Questo metodo dovrebbe essere inteso come un metodo complementare ai metodi esistenti utilizzando microscopi tradizionali. Questo metodo ha un vantaggio di non richiedere un microscopio durante l'acquisizione dei dati affinché il worm può spostare fuori dal piano focale. Gli spettri di frequenza media mostrano chiare differenze in movimento a vite senza fine e possono essere quantificati per i picchi di frequenza prevalente, che è un metodo novello nella quantificazione del verme locomozione. Analisi dei dati delle firme di diffrazione sono in ulteriore sviluppo e speriamo che porterà ad un processo di identificazione automatica di più mutanti e gli individui.

Questo metodo confronta spettri di frequenza sperimentale e modellato di locomozione di c. elegans utilizzando due ceppi con molto diversi pattern locomotorio. I risultati mostrano che lo spettro di frequenza dipende dalle variazioni temporali come il nematode nuota in una colonna d'acqua affinché immagini chiare microscopiche non sono necessari per l'analisi. Questo metodo consente l'analisi quantitativa in tempo reale e fornisce informazioni complementari a immagini e video acquisiti con microscopi tradizionali. Diffrazione di Fraunhofer, chiamato anche campo lontano diffrazione, fornisce la base per l'ottenimento di diffrazione live dati1,2. L'intensità della luce in un singolo punto nel modello di diffrazione è il risultato della sovrapposizione di luce da ogni punto della struttura del nematode3. Di conseguenza, l'intensità della luce raccolto nel tempo trasporta informazioni sulla locomozione del nematode. Analizzando il segnale di diffrazione del tempo-dipendente può identificare il caratteristico movimento del mutante corrispondente poiché analizzando tutte le frequenze coinvolte nella locomozione integra l'analisi del video tradizionale. In questo caso, le differenze caratteriali tra la locomozione del "rullo" e wild type c. elegans sono confermate confrontando gli spettri di frequenza dei due ceppi diversi del nematode.
Alcune caratteristiche precedenti sono stati confermati mediante analisi della frequenza di segnali di diffrazione come nuoto frequenze2,4. Ancora più importante, questo metodo può essere utilizzato come metodo complementare per microscopia tradizionale osservare locomozione in tempo reale sullo schermo del computer, come i dati vengono raccolti. Lo spettro di frequenza di vermi con distinti pattern locomotorio può essere quantificato considerando che la trasformata di Fourier trasforma il segnale del segnale di diffrazione.
La natura multidisciplinare della diffrazione basato sulla trasformata di Fourier in questo lavoro coinvolge i campi della biologia e della fisica. Diffrazione da sotto campionamento lungo è stato utilizzato per indagare le strutture cristalline in biologia5 e altri campi. In questo esperimento, tuttavia, a sovracampionamento6,7 crea il modello di diffrazione di campo lontano affinché l'organismo è centrato nel raggio laser. Sovracampionamento è in genere utilizzato per imaging lente-meno8 in combinazione con un algoritmo di recupero fase che ricostruisce un'immagine dell'oggetto originale. Fase di recupero è difficile da raggiungere quando scatterers sono presenti, come è il caso con un nematode. La firma di diffrazione temporale è sufficiente per valutare frequenze chiave del movimento verme. Questo metodo è meno computazionalmente faticoso e consente di quantificare la locomozione in modo ottico. Questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata per l'analisi di mutazioni o di condizioni ambientali che alterano il comportamento.

<table><tbody><tr><td>Laser elio-neon sintonizzabile</td><td>Ricerca Elettro-Ottica</td><td>30602</td><td>È possibile selezionare quattro lunghezze d'onda tra 543 nm e 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Specchi frontali in alluminio Fotodiodo</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>: Rivelatore amplificato SI</td><td>Thorlabs</td><td>PDA 100A</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta al quarzo</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td>Possono essere utilizzate anche celle in plastica.</td></tr><tr><td>MatLab (Software)</td><td>MathWorks</td><td>R2016b (9.1.0.441655)</td><td>Utilizzare il comando fft per simulare la diffrazione</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>14.7.1</td><td>Utilizzato per l'analisi dei dati di Figure 4</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Roller</td><td>Università del Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)</td><td>Deformazione: OH7547 Genotipo: otIs199.</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Wild Type</td><td>Università del Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)</td><td>Ceppo:N2 Genotipo: C. elegans isolato selvatico</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr></tbody></table>

basato su fourier analisi di diffrazione di live caenorhabditis elegans

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Questo manoscritto descrive come classificare i nematodi mediante diffrazione di campo lontano temporale firme. Un singolo c. elegans è sospeso in una colonna d'acqua all'interno di un'ottica cuvetta. Un laser HeNe ad onda continua nm 632 è diretto attraverso la cuvetta utilizzando specchi superficiali. Una distanza significativa di almeno 20-30 cm ha viaggiato dopo la luce passa attraverso la cuvetta assicura un utile modello di diffrazione (Fraunhofer) di campo lontano. Le modifiche del modello di diffrazione in tempo reale come il nematode nuota entro il raggio laser. Il fotodiodo è posizionato fuori centro nel pattern di diffrazione. Il segnale di tensione dal fotodiodo è osservato in tempo reale e registrate utilizzando un oscilloscopio digitale. Questo processo viene ripetuto per 139 wild type e 108 "rullo" di c. elegans. Worm di tipo selvaggio esibiscono un modello di oscillazione rapida in soluzione. I vermi "rullo" presentano una mutazione in un componente chiave della cuticola che interferisce con la locomozione liscia. Intervalli di tempo che non sono liberi di saturazione e di inattività vengono scartati. È pratico dividere ogni media dal suo massimo di confrontare le intensità relative. Il segnale per ogni verme è che Fourier trasformata in modo che il pattern di frequenza per ogni verme emerge. Il segnale per ogni tipo di worm è una media. Gli spettri di Fourier media per il tipo selvaggio ed il "rullo" di c. elegans sono distintamente differenti e rivelano che le forme di verme dinamico dei due ceppi diversi worm possono distinguere mediante analisi di Fourier. Lo spettro di Fourier di ogni ceppo di vite senza fine corrisponde un modello approssimato utilizzando due diversi binari verme forme che corrispondono ai momenti locomotore. La busta della distribuzione frequenza media per vermi effettivi e modellati conferma che il modello corrisponde ai dati. Questo metodo può servire come base per l'analisi di Fourier per molte specie microscopiche, come ogni microorganismo avrà il suo unico spettro di Fourier.

La messa a punto sperimentale ottico illustrato nella Figura 1 consente lo studio dei microrganismi senza essere legato ad un piano focale. Il segnale di botte da fotodiodo può essere osservato in tempo reale sullo schermo del computer come i dati vengono raccolti. Modelli insoliti saranno visibili immediatamente senza dover analizzare un video in dettaglio.
Esempi di movimento modellato verme sequenziale e diffrazione corrispondenti modelli sono illustrati nella Figura 2. I modelli di diffrazione modellato qualitativamente assomigliano a modelli sperimentali1 e sono una prima indicazione che le simulazioni del modello con successo il nematode.
Una firma di diffrazione temporale campione dei due tipi di c. elegans studiato qui è illustrata nella Figura 3. Può essere visto qualitativamente che ogni nematode thrashes alle ampiezze e tariffe diverse. Alcune delle differenze può essere quantificata attraverso la curva di raccordo come è stato fatto in una precedente pubblicazione1. La trasformata di Fourier discreta, tuttavia, rivela ulteriori dettagli sulle frequenze incorporate:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq1.jpg">, (1)
dove Fk è digitale di Fourier (FT) e fn è il segnale di diffrazione crudo dipendente dal tempo con tempo discreto variabile n e la discreta frequenza variabile k. N è il numero totale di punti dati. La trasformata di Fourier media digitale consente il nematode di essere identificati dai ampiezza del suo spettro di frequenza di diffrazione (Figura 4). Lo spettro di tipo selvaggio è dominato da frequenze più basse che lo spettro di movimento del rullo.
Un modello che approssima il tipo selvaggio contro le note di c. elegans rullo tipo selvatico tende al thrash in un movimento ondulatorio di (forma W o S) (Figura 2a), mentre il rullo tende a favorire un lato approssimativamente simile a una forma C oscillante ( Figura 5). Questo offre qualche spiegazione per gli spettri differenti. Il rullo principalmente formeranno una C su un lato mentre l'oscillazione di W può essere pensato come due opposti movimenti C. Per questo motivo, il movimento di W è più complesso rivelando basse frequenze più secondarie rispetto al movimento di C. Questo risultato è confermato nel modello computazionale. La forma W ha una densità di frequenza molto più alta rispetto alla forma di C (Figura 6). Ciò è confermato nella FFT in Figura 4 dove le frequenze di rullo sono raggruppate più mentre non completamente discreti. Le statistiche del rullo sono inclinate poiché il rullo può ripristinare temporaneamente locomozione wild-type.
Gli spettri di potenza levigata del rullo tipo di c. elegans Mostra un vasto picco a ~1.5 Hz, mentre nuoto wild type c. elegans esibisce uno spettro multimodale (tra cui picchi a ~1.0 Hz e Hz 1,75). Il fotodiodo (PD) ha una dimensione limitata diffusione sopra diversi elementi di matrice. Elementi di matrice singoli o i punti del reticolo di diffrazione variano di intensità, poiché varia di interferenza costruttiva e distruttiva; Tuttavia, le frequenze in cui variano le intensità sono la stessa per tutti gli elementi di matrice, come si può vedere nella Figura 7. Considerando il derivato di tempo EQ. 1, si vede che le fluttuazioni di frequenza non dipende la matrice di fase ma solo fluttuazioni dell'oggetto originale:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq2.jpg">, (2).
Come il PD si estende su diversi elementi di matrice, le posizioni di picco media a un profilo di frequenza coerente. Qualche variazione può essere previsto e può dare indizi circa l'orientamento del worm. La distribuzione di frequenza cambierà come l'andatura dei cambiamenti verme. L'attuale modello è un modello semplice che consente solo per la valutazione delle posizioni di picco piuttosto che altezze dei picchi relativi. Diversi pattern locomotorio media alle posizioni di punta diversi.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig1.jpg"> 
Figura 1. Messa a punto sperimentale. I viaggi di fascio laser di bassa potenza attraverso il filtro a densità neutra, è riflessa dallo specchio M1 giù attraverso la provetta contenente il worm sul specchio M2 e viaggia verso il fotodiodo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig2.jpg"> 
Figura 2. Forme di Worm sequenziale e corrispondenti modelli di diffrazione. (un) alcuni selezionare immagini binarie sequenziale del modellato W forma nematodi e i modelli di diffrazione sequenziale corrispondenti (b). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig3.jpg"> 
Figura 3. Campione sperimentale diffrazione firme. Diffrazione firme raccolte per (un) OH7547 "rullo" e (b) N2 tipo selvaggio di c. elegans utilizzando un singolo fotodiodo nel modello di diffrazione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig4.jpg"> 
Figura 4. Sperimentale ha stato in media di spettri di potenza dei rulli e serie di diffrazione di Fraunhofer Wild tipo. Lo spettacolo di spettri le frequenze presentano in media trasformata di Fourier della serie temporale registrata con fotodiodo. Un filtro gaussiano di deviazione standard 0,075 Hz, troncato a 3 deviazioni standard, viene utilizzato per la lisciatura. Si noti il vasto picco spettrale a ~1.5 Hz nello spettro rullo levigata, confrontato con lo spettro di multimodale levigata wild-type (tra cui picchi a ~1.0 e 1.75 Hz). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig5.jpg"> 
Figura 5. Diffrazione formazione illustrazione. Modelli di diffrazione possono essere modellate dal pensiero di ogni segmento di linea come una linea retta infinitamente piccola (a sinistra). La sovrapposizione di queste linee (a destra) dimostra la costruzione di modelli di campo lontano diffrazione generato da una C a forma di nematodi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig6.jpg"> 
Nella figura 6. Simulato spettri di potenza dei rulli e serie di diffrazione di Fraunhofer Wild tipo. (un) C forma e (b) W forma vermi con fotodiodo centrato gli elementi di matrice 200 (verticale) e 175 (orizzontale). La forma W Mostra una maggiore densità delle frequenze a causa la locomozione più complessa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig7.jpg"> 
Figura 7. Simulato spettri di potenza dei rulli e Wild Type Fraunhofer diffrazione serie alle posizioni differenti fotodiodo. (un) W forma verme e il verme di forma (b), C per gli elementi di matrice singola in varie località simulando varie località del fotodiodo. Altezze dei picchi variano per varie località; Tuttavia, posizioni di picco rimangono le stesse per forme specifiche. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo manoscritto descrive come distinguere diversi nematodi utilizzando firme di diffrazione in campo lontano. Confrontiamo la locomozione 139 wild-type e 108 "Roller" di c. elegans calcolando le frequenze associate alla firma di diffrazione di Fraunhofer temporale in un unico luogo utilizzando un laser ad onda continua.

Basato su Fourier analisi di diffrazione di Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

L'obiettivo generale di questa analisi di diffrazione basata sulla trasformata di Fourier è caratterizzare la locomozione di C elegans in tempo reale mentre la specie si muove liberamente in uno spazio tridimensionale. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia descrivendo le risposte della specie a diverse densità della soluzione o a mutanti della locomozione. Questo metodo costituisce una base di riferimento per l'analisi di Fourier di specie microscopiche.Presenta il vantaggio che ogni specie microscopica avrà il proprio spettro di Fourier unico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul movimento di C elegans, può essere applicato anche ad altri microorganismi. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché individuare il nematode nella cuvetta, sotto il fascio laser, può risultare complesso.L'idea iniziale di questo metodo è nata nel tentativo di ottenere informazioni sul comportamento natatorio a partire dal segnale di diffrazione temporale stesso, un segnale rumoroso. Per cominciare, fissare un laser a elio-neon in prossimità dell'angolo posteriore sinistro del banco ottico e collegarlo a una fonte di alimentazione. Posizionare un filtro neutro attenuatore tra il laser e il punto in cui si trova il campione, in modo che il fascio laser attraversi il filtro prima di raggiungere il campione.Utilizzando due specchi di orientamento in alluminio a superficie frontale, costruire un periscopio fissando il primo specchio dopo il filtro neutro. Successivamente, fissare il secondo specchio circa 10 centimetri al di sotto del primo specchio per lasciare spazio per indirizzare il fascio laser. Inserire una cuvetta tra gli specchi e allineare il fascio laser e la cuvetta in modo che il fascio laser attraversi verticalmente la cuvetta.Successivamente, posizionare il fotodiodo direttamente di fronte al secondo specchio in modo che il sensore sia rivolto verso lo specchio. Poi, collocare una cuvetta riempita d'acqua su un supporto. Regolare l'altezza del supporto e gli angoli degli specchi uno e due in modo che il fascio laser attraversi la cuvetta e sia indirizzato vicino al fotodiodo, ma non direttamente su di esso.Utilizzare una leva per assicurare che il supporto formi una superficie livellata per la cuvetta. Se il supporto non è livellato, effettuare le regolazioni appropriate fino a quando non risulta in bolla. Infine, collegare il fotodiodo all'oscilloscopio digitale utilizzando il cavo USB fornito e collegarlo al computer.Caricare il software dell'oscilloscopio e impostare la frequenza di campionamento a almeno otto hertz per risolvere in modo sufficiente il ciclo di movimento del verme. Utilizzare un ago di platino sottile e appiattito per trasferire quattro nematodi adulti in una nuova piastra di Petri contenente agar NGM fresco. Successivamente, rimuovere una cuvetta di plastica monouso dalla sua confezione, avendo cura di toccare la cuvetta solo sui lati zigrinati.Quindi, utilizzare una micropipetta per trasferire acqua distillata in una cuvetta fino a riempirla per circa l'80% con acqua distillata. Posizionare la piastra di Petri contenente i C elegans sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, utilizzare il bastoncino di platino per rimuovere un C elegans maturo dalla piastra di Petri e immergere il bastoncino nella cuvetta.Spostare il puntale in cerchi per staccare il nematode, se necessario. Manipolare i nematodi delicatamente e non agitare la cuvetta. L’agitazione della cuvetta può rendere i vermi non reattivi.Per evitare la formazione di bolle nella cuvetta, riempire la cuvetta con acqua distillata fino a quando l'acqua non supera leggermente il bordo superiore della cuvetta. Successivamente, riempire il tappo con acqua e posizionarlo rapidamente sulla cuvetta. Utilizzando carta per lenti, rimuovere eventuali gocce d'acqua che potrebbero essersi versate sulla superficie della cuvetta.Inoltre, utilizzare carta per lenti per rimuovere eventuali piccole gocce residue. Accendere il laser a elio-neon e regolare l'impostazione della frequenza in modo che produca un raggio rosso. Successivamente, accendere il sensore.Tenere la cuvetta sui lati scanalati e inclinarla delicatamente fino a quando il nematode si trova approssimativamente al centro della cuvetta. Successivamente, posizionare la cuvetta sul supporto del sistema ottico, centrando il verme all'interno del fascio laser che viaggia dallo specchio uno allo specchio due. Poi, posizionare il fotodiodo sul pattern di diffrazione in modo che la posizione del fotodiodo e il massimo centrale del pattern di diffrazione non coincidano.Quindi, ruotare i filtri neutri in modo da ottenere un segnale di tensione evidente dal fotodiodo. Assicurarsi di limitare la luce mediante il filtro neutro, per evitare la saturazione del fotodiodo. Una linea piatta indica sovrasaturazione o mancanza di intensità.Una volta visibile il modello di diffrazione in movimento, acquisire i dati con il fotodiodo facendo clic sul pulsante di avvio nel software, controllando l'oscilloscopio mentre si osserva il movimento del verme. Continuare a effettuare le misurazioni finché il verme non esce dal fascio laser e il modello di diffrazione scompare. Se la cuvetta è graffiata, smaltirla insieme al verme e ricominciare da capo.Dopo circa 20 secondi, interrompere il processo di acquisizione dei dati facendo clic sul pulsante di arresto nel software dell'oscilloscopio. Salvare i dati di ogni prova in formato di valori separati da virgola o in formato testo. Raccogliere almeno 50 set di dati per ogni fenotipo e utilizzare da otto a dieci animali per ogni prova.Ecco esempi di movimento sequenziale del verme modellato e dei corrispondenti schemi di diffrazione. Gli schemi di diffrazione modellati sono qualitativamente simili agli schemi sperimentali e indicano che la simulazione ha modellato con successo il nematode. Inoltre, la firma temporale di diffrazione del ceppo roller e del ceppo selvatico di c elegans può essere mostrata in modo quantitativo.Come mostrato qui, ciascun nematode si agita con diverse frequenze e ampiezze. Le trasformate digitali medie di Fourier permettono di identificare il nematode in base all'ampiezza del suo spettro di frequenza di diffrazione. Lo spettro del verme di tipo selvatico è dominato da frequenze più basse rispetto allo spettro del movimento a rullo.Ecco un esempio dell'oscillazione w, che può essere considerata come due movimenti marini opposti. Al contrario, il movimento a rullo si formerà principalmente in un c da un lato e appare così. Esaminando le frequenze, il movimento w è più complesso, rivelando più frequenze secondarie basse rispetto al movimento c.Una volta acquisita padronanza, un set di dati può essere raccolto in circa due minuti se la tecnica viene eseguita correttamente. Occorrono circa da 20 a 30 minuti per configurare l'ottica per una serie di set di dati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare i C elegans con attenzione, al fine di preservare l'integrità della loro locomozione.Seguendo questa procedura, possiamo applicare altri metodi come la ricostruzione del trattrice e l'analisi non lineare per approfondire il movimento di C elegans. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in neurobiologia per studiare più a fondo i mutanti locomotori in C elegans. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come generare schemi di diffrazione per nematodi vivi e di come analizzarli.Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come evitare che i raggi laser viaggino a livello degli occhi, durante l'esecuzione della procedura.

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