Basato su Fourier analisi di diffrazione di Live Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale di questa analisi di diffrazione basata su Fourier è quello di caratterizzare la locomozione di C elegans in tempo reale mentre la specie si muove liberamente in uno spazio tridimensionale. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia descrivendo le risposte delle specie a diverse densità di soluzione o mutanti locomotori. Questo metodo serve come linea di base per l'analisi di Fourier di specie microscopiche.

Ha il vantaggio che ogni specie microscopica avrà il suo spettro di Fourier unico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla locomozione di C elegans, può essere applicato anche ad altri microrganismi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché trovare il nematode nella cuvetta, sotto il raggio laser, può essere difficile.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta nel tentativo di conoscere il comportamento del nuoto dal segnale di diffrazione temporale, esso stesso, un segnale rumoroso. Per iniziare, fissa un laser al neon all'elio vicino all'angolo posteriore sinistro del banco ottico e collegalo a una fonte di alimentazione. Posizionare un filtro a densità neutra tra il laser e la posizione del campione, in modo che il raggio laser viaggi attraverso il filtro prima di raggiungere il campione.

Utilizzando due specchietti retrovisori anteriori in alluminio, costruire un periscopio fissando il primo specchio dopo il filtro a densità neutra. Quindi, fissare il secondo specchio a circa 10 centimetri sotto il primo specchio per dare spazio per orientare il raggio laser. Inserire una cuvetta tra gli specchi e allineare il raggio laser e la cuvetta in modo che il raggio laser viaggi verticalmente attraverso la cuvetta.

Quindi, fissare il fotodiodo direttamente di fronte al secondo specchio in modo che il suo sensore sia rivolto verso lo specchio. Quindi, posizionare una cuvetta piena d'acqua su un supporto. Regolare l'altezza del supporto e gli angoli degli specchi uno e due in modo che il raggio laser viaggi attraverso la cuvetta e sia diretto vicino ma non direttamente al fotodiodo.

Utilizzare una leva per assicurarsi che il supporto formi una superficie piana per la cuvetta. Se il supporto non è in piano, effettuare le regolazioni appropriate fino a quando non è livellato. Infine, collegare il fotodiodo all'oscilloscopio digitale utilizzando il cavo USB in dotazione e collegarlo al computer.

Caricare il software dell'oscilloscopio e impostare la frequenza di campionamento ad almeno otto hertz per risolvere sufficientemente il ciclo di cestinamento del verme. Utilizzare un plettro sottile e appiattito in filo di platino per trasferire quattro nematodi adulti in una piastra di Petri fresca riempita di agar NGM. Quindi, rimuovi una cuvetta di plastica usa e getta dalla confezione, facendo attenzione a toccare la cuvetta solo sui lati increspati.

Quindi, utilizzare una micropipetta per pipettare l'acqua distillata in una cuvetta fino a riempire la cuvetta per circa l'80% con acqua distillata. Posizionare la capsula di Petri contenente i C elegans sotto un cannocchiale da dissezione. Quindi, usa il plettro di platino per rimuovere un C elegans maturo dalla capsula di Petri e immergere il plettro nella cuvetta.

Muovi il plettro in cerchio per rimuovere il nematode, se necessario. Maneggiare delicatamente i nematodi e non agitare la cuvetta. Scuotere la cuvetta può causare la mancata risposta dei vermi.

Per evitare la formazione di bolle nella cuvetta, riempire la cuvetta con acqua distillata fino a quando non si sposta leggermente sopra la parte superiore della cuvetta. Quindi, riempi il tappo con acqua e metti rapidamente il tappo sulla cuvetta. Utilizzando la carta per lenti, rimuovere eventuali gocce d'acqua che potrebbero essersi riversate sulla cuvetta.

Inoltre, utilizzare la carta per lenti per rimuovere eventuali piccole goccioline rimanenti. Accendi il laser al neon all'elio e regola l'impostazione della frequenza in modo che produca un raggio rosso. Quindi, accendi il sensore.

Tenere la cuvetta sui lati increspati e inclinarla delicatamente fino a quando il nematode non si trova approssimativamente al centro della cuvetta. Quindi, posizionare la cuvetta sul supporto nel sistema ottico, centrando la vite senza fine all'interno del raggio laser che viaggia dallo specchio uno allo specchio due. Quindi, posizionare il fotodiodo nel modello di diffrazione in modo che la posizione del fotodiodo e il massimo centrale del modello di diffrazione non coincidano.

Quindi, ruotare i filtri a densità neutra in modo che vi sia una notevole tensione di uscita dal fotodiodo. Assicurarsi di limitare la luce utilizzando il filtro a densità neutra, per evitare la saturazione del fotodiodo. Una linea piatta indica una saturazione eccessiva o una mancanza di intensità.

Una volta che il modello di diffrazione in movimento è visibile, raccogli i dati con il fotodiodo facendo clic sul pulsante di avvio del software, controllando l'oscilloscopio e monitorando il movimento del verme. Continuare a effettuare le misurazioni fino a quando il verme non si sposta fuori dal raggio laser e il modello di diffrazione scompare. Se la cuvetta è graffiata, smaltirla insieme al verme e ricominciare.

Dopo circa 20 secondi, interrompere il processo di raccolta dei dati facendo clic sul pulsante di arresto sul software dell'oscilloscopio. Salva i dati di ogni prova in formato testo o con valori separati da virgole. Raccogli almeno 50 set di dati per ogni fenotipo e utilizza da otto a 10 animali per prova.

Di seguito sono mostrati esempi di movimenti sequenziali del verme modellati e dei corrispondenti modelli di diffrazione. I modelli di diffrazione modellati assomigliano qualitativamente ai modelli sperimentali e indicano che la simulazione ha modellato con successo il nematode. Inoltre, la firma di diffrazione temporale del rullo e dei c elegan wild-type può essere mostrata quantitativamente.

Come si vede qui, ogni nematode si agita a velocità e ampiezze diverse. Le trasformate di Fourier digitali medie consentono di identificare il nematode in base all'ampiezza del loro spettro di frequenza di diffrazione. Lo spettro del vite senza fine di tipo selvatico è dominato da frequenze più basse rispetto allo spettro del movimento del rullo.

Ecco un esempio dell'oscillazione w che può essere pensata come due moti opposti del mare. Al contrario, il rullo formerà per lo più una c su un lato e apparirà così. Nell'esaminare le frequenze, il movimento w è più complesso, rivelando più basse frequenze secondarie rispetto al movimento c.

Una volta padroneggiato, un set di dati può essere raccolto in circa due minuti se la tecnica viene eseguita correttamente. Ci vogliono circa 20-30 minuti per impostare l'ottica per una serie di set di dati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare i C elegans con cura, in modo da preservare l'integrità della loro locomozione.

Seguendo questa procedura, possiamo applicare altri metodi come la ricostruzione del trattore e l'analisi non lineare per saperne di più sul moto del C elegans. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in neurobiologia per studiare più a fondo i mutanti locomotori in C elegans. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare modelli di diffrazione per nematodi vivi e di come analizzarli.

Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e prendere precauzioni come non far viaggiare i laser all'altezza degli occhi, durante l'esecuzione della procedura.