Name: Istituzione di un Mimic prezioso del morbo di Alzheimer nel modello animale del ratto tramite iniezione di Intracerebroventricular di proteina Beta amiloide composte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri come mimare il morbo di Alzheimer nel ratto tramite iniezione intracerebroventricolare di Aβ25-35 con cloruro di alluminio e TGF-β1. Questo metodo consente di valutare l'impairment della memoria spaziale e le alterazioni neuronali per studiare meccanismi neurodegenerativi e testare farmaci.

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Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione Scienza naturale provinciale Hebei (No. C2009001007, H2014406048), l'amministrazione provinciale di Hebei della medicina tradizionale cinese (n. 05027) e il progetto di costruzione di tema chiave del Collegio Provinciale di Hebei, Cina.

Questa procedura era in conformità con i regolamenti di somministrazione sperimentale animale rilasciato dal comitato dello stato della scienza e della tecnologia della Cina il 31 ottobre 198811. Gli scienziati dovrebbero seguire le linee guida stabiliti ed approvati dalle loro organizzazioni istituzionali e nazionali di regolamentazione animale.
Nota: Animali e reggenti: quattro-mese-vecchio maschio topi Sprague Dawley (300-350 g) sono stati forniti per questo esperimento. Tutti i ratti sono stati alloggiati in gruppi (quattro o cinque per gabbia) ad una temperatura di 23 ± 1 ° C con un ciclo luce-buio di 12 h. Il cibo e l'acqua era disponibile ad libitum. I ratti sono stati acclimatati per le condizioni di alloggio per 7 giorni prima che la procedura è stata effettuata. Aβ25-35 è stato disciolto in soluzione salina di DMSO 1% a 1 mg/mL e sonicato per 5 min in un oscillatore ad ultrasuoni fino a completa dissoluzione. AlCl3 e RHTGF-β1 sono stati dissolti in una soluzione salina all'1% e 0,1 mg/mL, rispettivamente. Rosso Congo, nitrato d'argento e altri prodotti chimici erano di grado analitico e sono stati acquistati da fonti commerciali ordinarie.
1. intervento chirurgico
Nota: 20 ratti Sprague-Dawley maschi erano microiniettati con Aβ mescolati nel ventricolo laterale e nucleo thalamic anterodorsal e designati come il gruppo trattato con Aβ mescolato. Un altro 20 ratti sono stati sottoposti alla stessa operazione ma ricevuto microiniezione Salina di 0,1% DMSO e designato come il gruppo sham-operated.
<ol><li>Anestetizzare i ratti con 100% isoflurane per inalazione e quindi frenare su un apparato stereotassica del cervello.</li>
	<li>Radere il pelo sul vertice della testa con forbici chirurgiche e disinfettare con iodoforo. Poi, coprire asciugamano monouso chirurgico sulla testa.</li>
	<li>Fare un'incisione sulla pelle testa lungo la calvaria longitudinale mediana con forbici e bisturi chirurgici.</li>
	<li>Separare il tessuto sottocutaneo e la fascia, pulire il calvarium cranio con un cotone sterile asciutto per arrestare il sanguinamento e contrassegnare il bregma con un pennarello.</li>
	<li>Fare riferimento al ratto cervello stereotassiche mappa12; considerando il bregma come punto di origine, segnare i tre punti, nucleo thalamic anterodorsal (annuncio) (posteriore (P): 2,0 mm per il bregma; laterale (L): 1.4 mm alla linea mediana) per iniezione RHTGF-β1 e fissare una vite, il ventricolo laterale (LV) area ( posteriore (P): 0,8 mm per il bregma; laterale (L): 2,0 mm alla linea mediana) per l'iniezione Aβ25-35 e AlCl3 e il seconda posto di fissaggio a vite (anteriore (F): 2,0 mm per il bregma; laterale (L): 1,5 mm alla linea mediana).</li>
	<li>Delicatamente praticare tre fori di diametro di 1 mm con una punta di osso flessibile, designata a questi tre punti del cranio (1.5. passo). Non avvitare più necessario evitare pugnalare il tessuto cerebrale profonda.</li>
	<li>Fermare l'emorragia e pulire la superficie del cranio ripetutamente con cotone sterile asciutto.</li>
	<li>Inserire un ago collegato alla pompa di micro-iniezione, al cervello a 4,6 mm di profondità e delicatamente iniettare 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) nell'area di annuncio. Soggiorno dell'ago 2 min dopo l'iniezione e, lentamente, estrarre l'ago (Supplemental File 1).</li>
	<li>Fissare le due viti nel cranio, indicato nei punti di annuncio e la seconda vite che fissa il luogo del cranio (che sono stati designati a 1.5. passo) con un piccolo cacciavite. Non avvitare più necessario evitare pugnalare il tessuto cerebrale profonda.</li>
	<li>Assemblare il sistema di impianto di cannula (Supplemental File 2), inserire la cannula fittizia nella cannula guida dopo la disinfezione ad alta pressione.</li>
	<li>Inserire la cannula di guida in acciaio inox tubi al cervello a 4,6 mm nell'area di LV attraverso il foro del cranio (Supplemental File 3), con l'aiuto del titolare della cannula dell'apparecchiatura stereotassica dei ratti.</li>
	<li>Mescolare il materiale di base della protesi con protesi base acqua rapporto di 1,5 g / 1 mL, mettere la pasta per coprire il piedistallo in plastica del cannula di guida e due viti per immobilizzare la cannula di guida e fino a coprire l'incisione di tutta la pelle per evitare l'infezione della pelle.</li>
	<li>Il giorno 2 dell'operazione, anestetizzare i ratti con inalazione isoflurane utilizzando la macchina di anestesia animale piccolo. Estrarre la cannula fittizia, inserire la cannula interna nella cannula guida e avvitare la vite di fissaggio per immobilizzare la cannula interna.</li>
	<li>Impostata la cannula interna il tubo in polietilene che collega la pompa di microiniezione e regolare la velocità di iniezione da 1 μL/min. Microinject la Aβ25-35 o AlCl3 a LV.</li>
	<li>Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 al giorno per 14 giorni al mattino e 3 μL AlCl3 (1%) al giorno per 5 giorni nel pomeriggio sotto anestesia isoflurano.</li>
	<li>Attendere 5 minuti dopo aver terminato l'iniezione, delicatamente estrarre la cannula interna e inserire nuovamente la cannula fittizia nella cannula guida.</li>
	<li>Il giorno 15 dopo l'intervento chirurgico (che corrisponde all'ultimo giorno di iniezione di Aβ25-35) smantellare il sistema di impianto di cannula. Delicatamente rimuovere il solido materiale base della protesi dentaria con pinze e forbici chirurgiche, svitare le due viti, estrarre la cannula guida e disinfettare la ferita con betadine. Riempire il buco del cranio con cemento osseo e suturare la pelle con un metodo semplice sutura interrotti.</li>
	<li>Eseguire la stessa operazione con il gruppo di falsità-azionati e microinject soluzione fisiologica 0,1% DMSO.</li>
	<li>
Assistenza infermieristica postoperatoria
	<ol>
<li>Casa 2 ratti per gabbia dopo operazione e fornire cibo per 30 giorni. Nota: 18 ratti nel gruppo sham-operated sopravvissuto (90% tasso di successo dell'operazione) e 19 ratti nel composito-Aβ gruppo trattato sopravvissuto (tasso di successo del 95% di apertura).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. lo screening per la valutazione della memoria spaziale con Morris Water Maze e ratti di modello di successo
<ol><li>
Labirinto dell'acqua di Morris Nota: Il labirinto ad acqua di Morris è stato usato per valutare ratto memoria spaziale13. Labirinto dell'acqua di Morris è una vasca circolare in acciaio inox con diametro di 120 cm e 50 cm di profondità. Prova del labirinto dell'acqua è stata effettuata, basato sul paradigma del "gold standard" descritto in neuroscienze comportamentali da J. Nunez14.<ol>
<li>Annerire la piscina d'acqua con qualche goccia di colorante alimentare.</li>
		<li>Mantenere la profondità di acqua a 31,5 cm e la temperatura a 23 ° c ± 1 ° C.</li>
		<li>Impostare una piattaforma circolare in plexiglass trasparente 1,5 cm sotto la superficie dell'acqua.</li>
		<li>Sostengono che tutti i segnali spaziali intorno al labirinto di acqua sono invariabili durante i test del labirinto di acqua.</li>
		<li>Dividere la piscina in 4 quadranti uguali da linee immaginarie per raccolta dati descrittivi.</li>
		<li>Posizionare la piattaforma nascosta nel primo quadrante (Q1) del labirinto dell'acqua.</li>
		<li>Catturare il topo nuoto comportamenti (misurati dalla latenza, traiettoria o numero di attraversamento) attraverso una videocamera, sopra il labirinto di acqua collegato a un software di analisi grafica basata su computer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Screening per ratti di modello di successo per il gruppo trattato con Aβ composito
	<ol>
<li>Giorno 45 dell'intervento, eseguire il labirinto ad acqua di Morris formazione per 4 giorni consecutivi allo schermo per i ratti di modello di successo con danno di memoria e raccogliere il rapporto di proiezione (SR). Nota: Il SR è definito come la latenza media di ogni ratto composited Aβ-trattati e falsità-azionati gruppo di ratti per trovare la piattaforma nascosta sotto l'acqua in superficie il giorno 4 di acqua addestramento del labirinto. "A" è la latenza media di ogni ratto Aβ-trattati mescolato a trovare la piattaforma nascosta e "B" è la latenza media della falsità-azionati gruppo di ratti per trovare la piattaforma nascosta, il giorno 4 del labirinto dell'acqua di formazione, nella seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56157/56157eq1.jpg"> Quando SR era più grande di 0.2 per un composited Aβ-trattati del ratto, ratto era considerato come un ratto di modello di successo con la memoria alterata di composited Aβ-trattati ratto15. Le prestazioni di memoria intraday è stata calcolata il valore medio dei ratti per trovare la piattaforma nascosta ai dati di 2 studi. Il processo di prova del labirinto dell'acqua di Morris è stato progettato in modo tale che i ratti sono stati autorizzati a nuotare in acqua labirinto serbatoio e ricerca per la piattaforma nascosta entro 60 s. Se un ratto non scoprire la piattaforma nascosta all'interno di 60 s, poi il ratto è stato messo sulla piattaforma con la mano di sperimentatore. Quando un ratto raggiunto sulla piattaforma nascosta (in modo indipendente o assistita), il ratto era ha lasciato stare lì per 20 s. Quindi, il ratto è stato rimosso dal serbatoio e ha permesso un recupero fisico per 10 s fra le 2 prove.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. esame neurone
<ol><li>Il post chirurgia di giorno 86, nell'ambito dell'anestesia isoflurano, eutanasia i ratti per decapitazione (Figura 1).</li>
	<li>Mettere il cervello sul ghiaccio e separare delicatamente i due emisferi presso il Rafe. Prendere l'emisfero sinistro del chiasma ottico e fissarlo in formaldeide 4% per l'osservazione della luce microcopy di ematossilina di neurone ed eosina (HE), rosso Congo o nitrato d'argento macchia (Vedi sezioni 4-6). Difficoltà area dell'ippocampo CA1 di giusto emisfero in glutaraldeide al 2,5% per l'osservazione di elettrone microcopy (sezione 7).</li>
	<li>Elaborare il cervello per la preparazione del campione di microcopy di luce/elettroni, come descritto in precedenza16,17.</li>
</ol>4. neurone HE macchiatura
<ol><li>Deparaffinizzare ogni diapositiva (ogni 20 min.) con gradiente alcool (100%, 95%, 90%, 80% e 70%) distillare l'acqua in una cappa aspirante.</li>
	<li>Macchia per 3 min con ematossilina (0,5% p/v) e poi sciacquare con acqua corrente per rimuovere il colorante non legato da diapositive.</li>
	<li>Sciacquare con acido cloridrico 0,1% in alcool per 1 s per rimuovere il colore dei nuclei non colorati.</li>
	<li>Immergere in soluzione di ammoniaca 0,5% per 2 minuti fino a quando il luce blu si trasforma.</li>
	<li>Macchia per 1 min con eosina 1%.</li>
	<li>Disidratare per 5 min con gradiente (alcool di 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).</li>
	<li>Deselezionare in xilene e montare con mezzo di montaggio resinoso.</li>
	<li>Osservare e contare i neuroni viventi della macchia HE a 0,125 mm in mezzo CA1 dell'ippocampo e per 0,0352 mm2 nella corteccia cerebrale ad un ingrandimento di 400x con un microscopio ottico da una persona accecata per il disegno sperimentale.</li>
</ol>5. rosso Congo macchiatura per analizzante neurone Aβ onere
<ol><li>Deparaffinizzare ogni diapositiva (20 min) con gradiente alcool (100%, 95%, 90%, 80% e 70%) distillare l'acqua in una cappa aspirante.</li>
	<li>Macchia per 20 min con colore rosso di Congo soluzione (0,5 g rosso Congo, 80 mL di alcole metilico, glycerinum 20 mL) di lavoro.</li>
	<li>Sciacquare in acqua distillata per 5 min.</li>
	<li>Differenziare rapidamente con la soluzione alcalina (idrossido di potassio di 0,2 g alcool/100 mL) di alcool 80% per 3 s.</li>
	<li>Sciacquare due volte, ciascuna per 5 minuti con acqua distillata.</li>
	<li>Colorante di contrasto in ematossilina di Gill per 3 min.</li>
	<li>Sciacquare in acqua corrente per 2 min.</li>
	<li>Immergere in acqua ammoniacale (aggiungere poche gocce di idrossido di ammonio per acqua di rubinetto e mescolate bene) per 30 s o fino a quando le sezioni diventano blue.</li>
	<li>Sciacquare in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Disidratare con gradiente (alcool di 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).</li>
	<li>Deselezionare in xilene e montare con mezzo di montaggio resinoso.</li>
	<li>Osservare e contare le celle colorate con rosso Congo ad un ingrandimento di 400x, con un microscopio ottico da una persona accecata per il disegno sperimentale.</li>
</ol>6. colorazione per analizzante neurone NFT formazione di nitrato d'argento
<ol><li>Deparaffinizzare ogni diapositiva (20 min) con gradiente alcool (100%, 95%, 90%, 80% e 70%) distillare l'acqua in una cappa aspirante.</li>
	<li>Immergere in soluzione di nitrato d'argento di 20% e agente di tappatura per 20 min al buio.</li>
	<li>Lavare in acqua distillata due volte, 5 min per ogni volta.</li>
	<li>Immergere nella soluzione d'argento ammoniacale. Goccia di soluzione di ammoniaca in soluzione di nitrato d'argento 20% e aggiungere fino a quando la soluzione va da torbidità per chiarimenti. Contemporaneamente, agitare la soluzione con una bacchetta di vetro per 15 min e poi mettere nell'idrossido di ammonio 1% diluito per 2 min.</li>
	<li>Porre il vetrino nella soluzione lavoro in via di sviluppo per 3-7 minuti fino a quando il blocco nero nell'assone può essere osservato.</li>
	<li>Immergere nella soluzione di ammoniaca 0,1% diluito per 1 minuto e poi risciacquare con acqua per 1 min.</li>
	<li>Smaltire con tiosolfato di sodio 5% per 2 minuti e poi sciacquare con acqua per 5 minuti.</li>
	<li>Disidratare con gradiente (alcool di 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).</li>
	<li>Deselezionare in xilene e montare con mezzo di montaggio resinoso.</li>
	<li>Osservare e registrare la cella per la macchia di nitrato d'argento ad un ingrandimento di 400x con un microscopio ottico da una persona accecata per il disegno sperimentale.</li>
</ol>7. hippocampal Neuron ultrastruttura misura
<ol><li>Tagliare ippocampo del ratto CA1 in vari cubi (1 x 1 x 1 mm3) e inserire in glutaraldeide al 2,5% per 2 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Sciacquare i cubi con PBS tre volte (pH 7.2, 10 min per ogni volta).</li>
	<li>Difficoltà i cubi in 1% di acido osmico per 2 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Sciacquare i cubi in doppia acqua distillata 3 x (10 min per ogni volta).</li>
	<li>Disidratare con gradiente alcol 50%, 70% e 90% (10 min per ciascuno), 100% due volte (15 min per ogni volta).</li>
	<li>Sostituire l'ossido di propilene due volte (15 min per ogni volta), propilene ossido: resina 1:1 (60 min per ogni volta che a temperatura ambiente) e ossido di propilene: resina 1:4 (60 min per ogni volta che a temperatura ambiente). Mettere a bagno in resina (120 min, a temperatura ambiente).</li>
	<li>Incorporare nell'812 EPON e polimerizzare (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).</li>
	<li>Tagliare le sezioni semifini (1 µm), macchia di blu di metilene e localizzare sotto il microscopio.</li>
	<li>Macchia le sezioni ultrasottili (50 nm) con acetato di uranile-o e piombo citrato.</li>
	<li>Esaminare sotto un microscopio elettronico a JEM-1400 e raccogliere immagini.</li>
</ol>

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<li>Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SAMP8+mouse%3A+a+model+to+develop+therapeutic+interventions+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease.</a> Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).</li>
<li>Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+Alzheimer%27s+disease+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

È noto che la perdita della memoria e dell'apprendimento sono i principali sintomi clinici in pazienti AD2. La procedura qui descritta è un metodo in vivo per studiare AD; Abbiamo adattato un protocollo precedentemente pubblicato che testato un farmaco per alleviare i deficit di memoria e lesioni di un neurone in un modello di ratto4. Il nostro protocollo fornisce dettagli importanti per ottenere dati importanti, come pure un alto tasso di sopravvivenza degli animali che modellano con successo il funzionamento, i deficit di memoria, lesioni del neurone, onere Aβ e deposizione di NFT, per imitare l'annuncio (nell'esperimento attuale, il tasso di sopravvivenza e tasso di modello di successo dell'operazione sono più del 90%). Questi ratti di modello di successo sono stati usati per misurare la loro memoria spaziale con prova del labirinto dell'acqua di Morris. La prova di navigazione posizionamento ha trovato che la Aβ compositi può causare danno di acquisizione di ratto di memoria; la prova della sonda ha trovato che la Aβ compositi può ridurre la conservazione della memoria del ratto; e l'inversione prova abbiamo trovato che la Aβ compositi può provocare nel ratto ri-apprendimento danno. Questi dati di test del labirinto dell'acqua di Morris mostrano che la Aβ composto può indurre memoria spaziale del ratto. Nel complesso, l'iniezione intracerebroventricolare di ratti con Aβ25-35 in combinazione con AlCl3 e TGF-β1 creato un fattibile e credibile in vivo AD-come modello animale per il laboratorio.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che il volume del cervello nei pazienti dell'annuncio è del 10% inferiore a quella dei soggetti sani. Atrofie varie possono essere trovate nell'emisfero cerebrale di osservazione visiva. Il grado di atrofia corticale è positivamente correlato al danno memoria19. L'istologia, il gran numero di perdita del neurone e grave patologia morfologica disturba direttamente la funzione di memoria in pazienti AD20. Nello studio presente, osservazione al microscopio luce/elettronico trovato che i ratti microiniettati con Aβ composited visualizzato drammatici cambiamenti neuropathological, tra cui la perdita del neurone e la rottura della struttura di un neurone e subcellulare. Questo risultato conferma il disordine di memoria spaziale del ratto indotto da Aβ mescolati ed è simile allo stato dei pazienti dell'annuncio.
È noto che l'onere Aβ di cervello e aggregazione NFT sono considerati i più importanti tratti di histopathogenic in annuncio. Possono distruggere la struttura di un neurone, disturbare la segnalazione neurale, disturba la funzione neuronale e provocare demenza avanzata17. Il presente modello animale ha trovato onere Aβ e aggregazione NFT nel cervello, che sono d'accordo con lo stato di paziente AD. Di conseguenza, le lesioni del neurone presenti in ratti indotti da Aβ composited utilizzabile come modello per studiare la patologia neuronale e strategia di trattamento dell'annuncio.
I seguenti sono esempi di screening gli effetti della droga nei modelli del ratto AD: Zhao et al., ha riferito che entrambi i flavonoidi da Scutellaria steli e foglie (SSF) e Scutellaria barbata (SBF) può attenuare il danno di memoria di ratto e apoptosi indotta da composited Aβ8,9. Guo et al., inoltre ha segnalato che SBF può inibire l'aggregazione NFT e sovra-fosforilazione di proteina tau al fianco di Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 e Thr231 e diminuire l'espressione di mRNA e di proteina GSK-3beta, CDK5 e PKA in ratti trattati con Aβ compositi21 . Contemporaneamente, Shang et al., hanno anche riferito che SBF può sopprimere la proliferazione di astrociti e microglia e inferiore Aβ1-40, Aβ1-42, e β-site APP cleaving enzima 1 (BACE1) espressione del mRNA nel cervello di Aβ composited ratti22. Basato su risultati di cui sopra, il nostro modello animale è vantaggioso rispetto altri modello annuncio-come, che coinvolgono più funzione di un neurone e struttura disordine.
Per quanto riguarda altri modello annuncio-come, intracerebroventricular singola iniezione di Aβ ai ratti possa causare i deficit di memoria di ratto, perdita del neurone e la proliferazione di neurogliocyte, ma può o non può avere di deposizione di Aβ e NFT23. Ratti esposti ad alte dosi Al sembrano avere un alto tasso di successo e mimico AD un conveniente modello animale, con danno di memoria, perdita del neurone, proliferazione di neurogliocyte e placca senile (SP) e aggregazione NFT nel cervello. Tuttavia, la dose elevata di Al può causare lesioni del fegato del ratto e anoressia, accompagnata con diminuito peso24. Ratto invecchiato è un altro annuncio-come modello. I ratti invecchiati dimostrano i deficit di memoria, cambiamenti patologici di un neurone struttura/sottostruttura, deposizione di lipofuscin, ma senza onere Aβ e aggregazione di NFT. Ratti di più di 24 mesi di età sono considerati invecchiato per questo modello e pertanto richiede un periodo più lungo di alimentazione e quindi il costo è più elevato17,25. Topi transgenici SAMP8 e APP sono il mimic più vicino a questo annuncio e sono più i modelli ideali per lo studio di annuncio. Ma entrambi i modelli animali sono più costosi e sono limitati a utilizzare nel laboratorio26,27. Rispetto ai modelli animali di cui sopra, il nostro modello di composto modello animale Aβ-trattati ha un più a basso costo e ad alte prestazioni, che lo rende uno strumento ideale per lo studio di annuncio.
In conclusione, iniezione di intracerebroventricular di Aβ25-35 combinata con AlCl3 e TGF-β1 ai ratti offre un prezioso in vivo modello animale per capire meglio il danno di memoria spaziale, lesioni neuronali, onere Aβ e deposizione di NFT Annuncio sottostante. Questo modello fornisce una veloce e relativamente semplice protocollo sperimentale con un animale di alto sopravvivere tasso e tasso di successo di alta modello di funzionamento, nonché un alto tasso di duplicazione, che ha dimostrato di essere più economico. Il presente modello animale è un modello efficace di imitare AD e può convalidare ulteriormente da utilizzato per simulare varie altre malattie.

È noto che l'annuncio è una malattia neurodegenerativa cronica e progressiva, con perdita di memoria graduale come la sindrome clinica principale. In patologia generale, c'è l'atrofia del tessuto nervoso, neurone e perdita di sinapsi, come pure un neurone subcellulare disturbi, struttura e funzione, che sono tutti coinvolti nello sviluppo e nella manifestazione clinica di AD1,2. È stato riferito che quando gli animali erano intracerebroventricolare iniettato con Aβ, si verificano alcuni eventi neurotossici nel cervello che coinvolgono la perdita del neurone, perturbazione di omeostasi del calcio, neurone apoptosis e specie reattive dell'ossigeno sovrapproduzione3. Tuttavia, molteplici fattori sono coinvolti nella patogenesi dell'annuncio e quindi è essenziale per stabilire un modello migliore dell'annuncio.
Un protocollo dettagliato è descritto qui per stabilire un in vivo mimico AD modello attraverso l'iniezione di intracerebroventricular di Aβ25-35 e AlCl3, combinato con l'iniezione del nucleo thalamic di anterodorsal di RHTGF-β1 ai ratti. Questo ratto modelhighly imita la funzione neuronale umana e histopathogenesis dell'annuncio, tra cui disturbi della memoria, perdita del neurone e danni alla struttura, apoptosi, onere Aβ intracellulare e NFT aggregazione4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 impedisce la formazione di Aβ solubile della Aβ depositato, e la RHTGF-β1 può promuovere la produzione di Aβ depositato e facilitare AD occorrenza10. Questo attacco da diversi fattori per il neurone è in conformità con il multi-patogenesi dell'annuncio.
L'intero esperimento ha misurato 86 giorni: la figura 1 Mostra una sequenza temporale di disegno sperimentale, con il punto di tempo di chirurgia animale, modello animale screening, test di memoria spaziale degli animali e preparazione del campione. Il primo giorno di apertura, RHTGF-β1 era microiniettati in nucleo thalamic di anterodorsal. Il secondo giorno di apertura, Aβ25-35 e AlCl3 erano microiniettati nel ventricolo laterale al giorno per 14 giorni consecutivi al mattino e 5 giorni consecutivi nel pomeriggio, rispettivamente. Tutti i ratti sono stati ammessi a recuperare per 45 giorni dopo l'operazione. Labirinto dell'acqua di Morris è stato usato per lo screening per i ratti di modello di successo con danno di memoria e per valutare la memoria spaziale dei ratti. I ratti hanno subito 4 giorni consecutivi del labirinto dell'acqua di formazione con 2 prove al giorno, e il giorno 4 di formazione, i ratti sono stati valutati con la prestazione del labirinto dell'acqua di Morris per danno di memoria. Tutti i ratti hanno continuato a essere nutriti 37 giorni dopo la proiezione del modello animale. La memoria spaziale di ratti è stata testata nel labirinto dell'acqua di Morris oltre 7 giorni consecutivi, dal giorno 79 al giorno 85 dopo l'operazione. Tutti i ratti sono stati sacrificati per decapitazione giorno 86 per la preparazione di campioni di cervello.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56157/56157fig1.jpg"> Figura 1. Timeline del disegno sperimentale. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56157/56157fig1large.jpg">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sprague-Dawley rat</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, Cina</td><td>SCXK (Jing) 2012-0001</td><td>300– 350 g</td></tr><tr><td>Morris labirinto d'acqua</td><td>Accademia cinese delle scienze mediche e Istituto di ricerca medica dell'Unione di Pechino, Cina</td><td>Nessun</td><td></td></tr><tr><td>anestetico mobile per piccoli animali</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>R580</td><td></td></tr><tr><td>Brain Stereotaxic Apparatus</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Trapano per osso flessibile</td><td>Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. Cina</td><td>BW-sD908</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Japan Co., Ltd. Giappone</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di microiniezione a due canali</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>RWD202</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo EM</td><td>Hitachi Co., Ltd. Cina</td> Cannula fittizia <td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62001</td><td>0.D.0.64&amp;volte; Cannula guida I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html</td></tr><tr><td></td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62101</td><td>0.D.0.40mm/M3.5</td></tr><tr><td>Cannula interna</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62201</td><td>0.D.0.41&amp;volte; I.D.0.25mm/<img alt="Special" src="/files/ftp_upload/56157/special01.jpg">M3.5</td></tr><tr><td>Stringere il dado</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62501</td><td>0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5</td></tr><tr><td>Vite di fissaggio</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62514</td><td>M1.2&amp;volte; L2.0mm (100BAO)</td></tr> <tr><td>Il cacciavite</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62999</td><td>45 * 1mm</td></tr><tr><td>PE Tubing</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. Cina</td><td>62302</td><td></td></tr><tr><td>Amiloide-beta 25-35</td><td>Sigma Aldrich Co. USA</td><td>SCP0002-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano trasformante fattore di crescita -β 1</td><td>PeproTech Inc. USA</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Tricloruro di alluminio</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Cina</td><td>3011080</td><td></td></tr><tr><td>Congo rosso</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. Cina</td><td>3010016</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. Cina</td><td>20150720</td><td></td></tr><tr><td>Materiale di base per protesi</td> Shanghai <td>New Century Dental Materials Co., Ltd. Cina</td><td>20170609</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di un mimic prezioso del morbo di alzheimer nel modello animale del ratto tramite iniezione di intracerebroventricular di proteina beta amiloide composte

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Morbo di Alzheimer (annuncio) è una malattia irreversibile, progressiva del cervello che lentamente distrugge la memoria ed è accompagnata dal cambiamento di struttura e perdita del neurone. Con l'aumento dei pazienti dell'annuncio in tutto il mondo, la patologia ed il trattamento della malattia è diventato un fuoco nell'industria farmaceutica internazionale. Perciò, l'istituzione del modello animale per imitare AD in laboratorio è di grande importanza.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per stabilire un mimo di annuncio in un animale di ratto però modello intracerebroventricular iniezione di amiloide beta proteina 25-35 (Aβ25-35) combinato con tricloruro di alluminio (AlCl3) e nucleo thalamic anterodorsal iniezione di ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-β1 (RHTGF-β1) ai ratti. Sono stati misurati i marcatori correlati dell'annuncio, tra cui: memoria spaziale, struttura di un neurone e sottostruttura, Aβ neuronale e grovigli neurofibrillary (NFT) produzione. Questo modello di ratto dimostra la compromissione della memoria spaziale, struttura di un neurone e alterazioni patologiche di sottostruttura, onere Aβ intracellulare del neurone e aggregazione NFT e fornisce un mimic stretto del disordine struttura e funzione neuronale a quella di clinica Pazienti dell'annuncio. Così, il presentato AD ratto modelprovides uno strumento prezioso in vivo per esplorare la funzione di un neurone, patologia neuronale e lo screening di stupefacenti dell'annuncio.

Si tratta di un protocollo per imitare la malattia di Alzheimer in ratti dalla valutazione di danno di memoria spaziale, cambiamenti patologici di un neurone, un neurone amiloide beta proteina (Aβ) onere, e l'aggregazione di grovigli neurofibrillari, indotta tramite l'iniezione di Aβ25-35 combinato con tricloruro di alluminio e ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-β1.

Istituzione di un Mimic prezioso del morbo di Alzheimer nel modello animale del ratto tramite iniezione di Intracerebroventricular di proteina Beta amiloide composte

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie neurodegenerative, come la malattia di Alzheimer. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel riprodurre la malattia di Alzheimer in un modello animale ratto mediante iniezione intracerebroventricolare di A-beta 25-35, in combinazione con cloruro di alluminio e fattore di crescita trasformante beta umano ricombinante uno. Inoltre, fornisce un protocollo sperimentale rapido e relativamente semplice, con un'elevata percentuale di sopravvivenza degli animali, un alto tasso di successo del modello e un'elevata riproducibilità, il che si è dimostrato più economico.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla valutazione dell'efficacia di farmaci contro l'AD, poiché questo modello animale presenta deficit di memoria e alterazioni neuronali simili a quelli osservati nei pazienti affetti da AD. A dimostrare la procedura sarà Cheng Jianjun, un tecnico del mio laboratorio. Su un ratto anestetizzato, iniziare tagliando i peli sulla sommità del cranio con forbici chirurgiche e disinfettare con iodopovidone.Successivamente, praticare un'incisione sulla cute della testa lungo la calotta cranica longitudinale mediana utilizzando bisturi e forbici chirurgici. Separare il tessuto sottocutaneo e la fascia, pulire la calotta cranica con perossido di idrogeno allo 0,3% e marcare il bregma con un pennarello. Successivamente, segnare tre punti: il nucleo talamico anterodorsale per l'iniezione di RHTGF beta uno e il fissaggio di una vite, l'area del ventricolo laterale, o LV, per l'iniezione di A-beta 25-35 e AICI3, e infine il punto per il fissaggio della seconda vite.Praticare delicatamente tre fori di un millimetro di diametro con un trapano osseo flessibile nei tre punti segnati sul cranio. Arrestare l'emorragia e pulire ripetutamente la superficie cranica con cotone sterile e asciutto. Successivamente, inserire un ago collegato a una pompa di microinfusione nel cervello a una profondità di 4,2 millimetri ed iniettare delicatamente un microlitro di RHTGF beta uno nell'area ad. Mantenere la microiniezione per due minuti dopo l'iniezione. Successivamente, estrarla lentamente. Fissare le due viti nel cranio, nei punti precedentemente segnati, utilizzando un piccolo cacciavite.Dopo il posizionamento delle viti, assemblare il sistema di impianto della cannula inserendo innanzitutto la cannula fittizia nella cannula guida dopo la disinfezione mediante immersione in alcol al 75% per 24 ore. Successivamente, inserire la cannula guida in acciaio inossidabile nel cervello fino a 4,6 millimetri nell'area del LV attraverso il foro nel cranio, avvalendosi di un supporto per cannula sull'apparato stereotassico del ratto. Poi, mescolare il materiale per basi di protesi con l'acqua per basi di protesi in un rapporto di 1,5 grammi ogni millilitro.Mettere la pasta in modo da coprire il supporto in plastica della cannula guida e le due viti per immobilizzare la cannula guida. Coprire l'intera incisione cutanea per evitare infezioni della pelle. Il giorno successivo, rimuovere la cannula finta ed inserire la cannula interna nella cannula guida.Serrare la vite di fissaggio per immobilizzare la cannula interna. Collegare il tubo di polietilene che unisce la pompa di microinfusione alla cannula interna e regolare la velocità di iniezione a un microlitro al minuto. Microinfondere l'A-beta 25-35 nel ventricolo laterale (LV). Attendere cinque minuti al termine dell'iniezione, quindi estrarre delicatamente la cannula interna.Quindi, reinserire nuovamente la cannula fittizia nella cannula guida. Al giorno 15 dal post-operatorio, smontare il sistema di impianto della cannula rimuovendo con forbici chirurgiche e pinze il materiale della base per protesi orale solidificato e disinfettare la ferita con iodoforo. Infine, riempire il foro del cranio con cemento osseo e suturare la pelle con un metodo di sutura semplice interrotto.Iniziare a rendere nera l'acqua della piscina con un po' di colorante alimentare nero. Mantenere la profondità dell'acqua a 31,5 centimetri e la temperatura a 23 più o meno un grado Celsius. Quindi, posizionare una piattaforma circolare trasparente in plexiglass di 1,5 centimetri al di sotto della superficie dell'acqua.Successivamente, dividere il bacino in quattro quadranti uguali mediante linee immaginarie per la raccolta descrittiva dei dati. Posizionare la piattaforma nascosta nel primo quadrante, o Q1, del labirinto acquatico. Infine, registrare i comportamenti natatori del ratto mediante una videocamera posizionata sopra il labirinto acquatico, collegata a un software analitico grafico basato su computer.Questi risultati indicano che il gruppo di ratti sottoposti a intervento fittizio ha sempre nuotato liberamente, mentre i ratti del gruppo trattato con A-beta composito hanno sempre nuotato lungo il perimetro della vasca in un nuoto adattativo nel labirinto acquatico di Morris. Durante i quattro giorni di screening per i ratti modello con deficit di memoria, tutti i ratti hanno mostrato un tempo progressivamente decrescente per trovare la piattaforma nascosta. Inoltre, le latenze del gruppo trattato con A-beta composito nel trovare la piattaforma nascosta sono state significativamente più lunghe rispetto a quelle del gruppo sottoposto a intervento fittizio, dimostrando che l'A-beta composito può aumentare il deficit di riapprendimento della memoria nei ratti.Nella prova di mantenimento della memoria a un giorno, il gruppo trattato con A-beta composito ha impiegato meno tempo a nuotare, ha percorso una distanza minore e ha effettuato un numero ridotto di attraversamenti entro 60 secondi, rispetto al gruppo sottoposto a intervento fittizio. Infine, oltre ai cambiamenti patologici, il numero di neuroni è risultato significativamente ridotto nell'ippocampo e nella corteccia cerebrale nel gruppo trattato con A-beta composito rispetto al gruppo sottoposto a intervento fittizio. Una volta acquisita, questa tecnica può essere completata in 20-30 minuti se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di evitare che la cannula guidata si stacchi dalla vite cerebrale. Dopo questa procedura, altri metodi come il test del labirinto possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio se il modello di AD mimetizzato sia stato efficace. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare le malattie neurodegenerative in vivo.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allestire modelli animali di mimica della malattia di Alzheimer mediante iniezione intracerebroventricolare di A-beta 25-35 in combinazione con cloruro di alluminio e fattore di crescita trasformante beta umano ricombinante in ratti. Non dimenticare che lavorare con metilmetacrilato può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di maschere e guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Qui, presentiamo un protocollo per l'infusione diretta stereotassica cerebrale di amiloide-beta. Questa metodologia fornisce un modello murino alternativo in vivo per affrontare gli effetti a breve termine dell'amiloide-beta sui neuroni cerebrali.

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L'amiloide-β (Ap) -injected modello animale consente la somministrazione di una quantità e specie di frammenti Ap definiti e riduce le differenze individuali all'interno di ciascun gruppo di studio. Questo protocollo descrive la intracerebroventricolare (ICV) iniezione di Ap senza strumenti stereotassica, consentendo la produzione di anomalie comportamentali Alzheimer-like nei topi normali.

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Per studiare gli effetti di Aβo in vivo, abbiamo sviluppato un modello basato su infusioni ippocampali ripetute di Aβo solubile accoppiate con infusione continua di anticorpi Aβo (6E10) nell'ippocampo utilizzando pompe osmotiche per contrastare l'effetto neurotossico di Aβo.

Neurodegenerazione in un modello animale di cronica amiloide-beta Oligomer infusione viene neutralizzata da anticorpi trattamento infuso con pompe osmotiche

Abbiamo sviluppato una metodologia per il 3D quantitativa in silico di modellazione (q3DISM) di cerebrale amiloide-β (Ap) fagocitosi da parte dei fagociti mononucleari in modelli di roditori della malattia di Alzheimer. Questo metodo può essere generalizzato per la quantificazione di praticamente qualsiasi evento fagocitaria in vivo.

3D Quantitative In Silico Modeling (q3DISM) di cerebrale amiloide-beta fagocitosi in roditori modelli di malattia di Alzheimer

Questo protocollo descrive la sintesi, la caratterizzazione e l'iniezione dei peptidi monomerici amiloide-β42 per la generazione di tossicità dell'amiloide in zebrafish adulto per stabilire un modello di malattia di Alzheimer, seguito da analisi istologiche e rilevazione di aggregazioni.

Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish

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Istituzione di un Mimic prezioso del morbo di Alzheimer nel modello animale del ratto tramite iniezione di Intracerebroventricular di proteina Beta amiloide composte (Video) | JoVE Journal

Istituzione di un Mimic prezioso del morbo di Alzheimer nel modello animale del ratto tramite iniezione di Intracerebroventricular di proteina Beta amiloide composte

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