Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Un protocollo dettagliato di un modello murino per enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) colonizzazione tramite bioluminescenza-identificati batteri è presentato. La rilevazione di questi batteri bioluminescenti di un non-invasiva in vivo imaging sistema animali vivi può avanzare la nostra comprensione corrente della colonizzazione di EHEC.

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare la colonizzazione enteroemorragica di E.coli nei topi utilizzando un sistema di imaging in vivo non invasivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenicità di E.coli enteroemorragica come la colonizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la colonizzazione EHEC può essere rilevata negli animali vivi senza sacrificare l'animale.

Per iniziare, applicare una serie negativa di 80 gradi Celsius di batteri E.coli O157:H7 EDL933 che ospitano un plasmide luciferasi su una piastra di agar LB con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina. Fai crescere i batteri per 16-18 ore a 37 gradi Celsius. Prelevare una singola colonia dalla piastra notturna e inoculare tre millilitri di terreno LB con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina.

Quindi, incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 220 giri/min per 16-18 ore. Il giorno seguente, preparare due millilitri di una diluizione da uno a 100 della coltura notturna e inocularla in 200 millilitri di LB con kanamicina. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 2,5-3 ore o fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge tra 0,9 e uno.

Successivamente, centrifugare i batteri ricoltivati a 8000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet e lavare i batteri con 100 millilitri di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% agitando delicatamente. Dopo il lavaggio, centrifugare nuovamente la coltura batterica ed eliminare delicatamente il surnatante.

Quindi, utilizzare soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per concentrare il pellet 100 volte. Dopo aver trattato i topi con acqua di streptomicina per 24 ore secondo il protocollo di testo, riempire una siringa con 100 microlitri di batteri EHEC. Solleva delicatamente l'animale e posizionalo con cura sulla parte superiore della gabbia.

Quindi, afferra con cura il topo per la coda in modo che l'animale si aggrappi alla parte superiore della gabbia e tenti di scappare. Trattenere delicatamente il mouse usando il pollice e l'indice per afferrare la pelle flaccida del collo e della schiena dell'animale per evitare che la testa si muova. Quindi, tieni il mouse in posizione verticale e assicurati che la testa del mouse sia immobilizzata in questa posizione.

Inserire l'ago della sonda gastrica nella bocca dell'animale seguendo il palato e scendere nell'esofago verso lo stomaco. Quando l'ago inserito si trova a metà o due terzi del percorso nel topo, iniettare i 100 microlitri di batteri EHEC che ne contengono circa 10 al nono CFU di cellule. Dopo aver visualizzato le celle bioluminescenti secondo il protocollo di testo, aprire il Pannello di Controllo Acquisizione del software.

Seleziona Luminescente, Fotografia e Sovrapposizione. Impostare il tempo di esposizione su auto. Quindi imposta il binning su medio.

Impostare l'F/stop su uno per la luminescenza e otto per la fotografia. F/stop controlla la quantità di luce ricevuta dal rilevatore CCD. Una volta che i campioni di topi sono pronti per l'imaging, fare clic su Acquisisci per l'acquisizione dell'immagine.

Aprire i dati dell'immagine acquisiti, quindi aprire il pannello della tavolozza degli strumenti. Seleziona gli strumenti ROI come il cerchio per definire l'area bioluminescente sulle immagini. Quindi, utilizzando l'icona a forma di matita, fare clic su misura ROI per misurare l'intensità della bioluminescenza superficiale.

Appariranno il pannello di misurazione del ROI e i valori di quantificazione. Quindi, nell'angolo sinistro del pannello Misurazioni ROI, utilizza configura misurazione per selezionare i valori/le informazioni necessarie. In caso contrario, fare clic su Esporta per esportare questa tabella di dati e salvarla come file csv.

Infine utilizzare i valori della colonna p/s del flusso totale come quantificazione dell'intensità della bioluminescenza nel file csv. Come dimostrato in questa immagine, un forte segnale di bioluminescenza è stato osservato nei topi esposti a sonda orale con inoculazione EHEC marcata con bioluminescenza. In questa figura, i topi inoculati con bioluminescenza marcata con EHEC EDL933 wild-type hanno mostrato intensi segnali bioluminescenti anche a due giorni dopo l'infezione, suggerendo che EHEC ha colonizzato gli ospiti entro due giorni.

Tuttavia, i topi infettati da un E.coli mutante con difetti nei lipopolisaccaridi non mostrano bioluminescenza, suggerendo che un numero ridotto o nessun batterio abbia colonizzato questi topi. Per localizzare i batteri marcati con bioluminescenza, gli intestini degli animali sacrificati sono stati riprodotti ex vivo. Gli organi di topi infettati con EHEC marcato con bioluminescenza hanno mostrato un significativo segnale di bioluminescenza nel cieco e nel colon, indicando la colonizzazione in questi organi.

Al contrario, i topi infettati con un mutante LPS hanno mostrato una diminuzione della bioluminescenza nel tessuto intestinale, che è coerente con l'immagine in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre l'esperimento utilizzando il sistema IV per monitorare la colonizzazione EHEC nei topi.