Name: Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Impara a rilevare la colonizzazione di Escherichia coli enteroemorragica nei topi utilizzando un sistema di imaging bioluminescente non invasivo in vivo. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale senza sacrificare gli animali.

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Riconosciamo Chi-Chung Chen dal dipartimento di ricerca medica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) per l'aiuto nel topo di infezione e il supporto dal centro laboratorio animale della National Cheng Kung University. Questo lavoro è sostenuto dal Ministro della scienza e tecnologia (MOST) concede (più 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) a CC.

Attenzione: EHEC O157: H7 è un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) agente patogeno secondo i Centers for Disease Control and Prevention (CDC) istruzioni di sicurezza biologica (https://www.cdc.gov/). Di conseguenza, tutte le procedure sperimentali che coinvolgono EHEC devono essere effettuate in una struttura di BSL-2. Indossare guanti e camici da laboratorio quando si effettua l'esperimento. Lavorare in una certificato di biosicurezza (BSC). Disinfettare il banco sperimentale prima e dopo la procedura sperimentale con etanolo al 70%. Tutti gli strumenti o attrezzature che EHEC contatto (o potenzialmente contatto) deve essere disinfettata con etanolo al 70% o candeggina. Rifiuti contaminati (o potenzialmente contaminati) dovrebbero essere accuratamente sigillati e sterilizzati in autoclave. Indossare una maschera, occhiali protettivi, guanti doppio o una tuta, se necessario. I topi femminili C57BL/6 di 6-settimana-vecchio sono stati acquistati e mantenuti presso il laboratorio animale Center del National Cheng Kung University (NCKU). Esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di NCKU (numero di omologazione 104-039).
1. generazione di batteri EHEC Bioluciferase-etichettato
<ol><li>Mix 50 ng dell'acido deossiribonucleico (DNA), 1 μL ogni 10 μm avanti e indietro primer, 2 μL 2,5 mM deossinucleotidi (dNTP), 2 μL 10 x buffer, 0,2 μL DNA polimerasi e acqua bidistillata sterile (ddH2O) ad un volume finale di 20 μL per amplificare il Cassetta anti-kanamicina, nptII gene24. Il modello di DNA è da pBSL18024, che è stato acquistato da progetto nazionale di BioResource (NBRP). Le condizioni PCR sono elencate nella tabella 1 e sequenza del primer è disponibile nella tabella 2.</li>
	<li>Legare i prodotti di PCR in un vettore di clonazione commerciale seguendo il kit protocollo (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Asportare il frammento del gene nptII dal vettore di clonazione da NsiI e SmaI e clonare in pBBR1MCS4, che viene digerito dal NsiI e ScaI da pAKlux29 per creare il plasmide resistente kanamicina, pWF27813.</li>
	<li>Asportare l'operone luxCDABE , dalla luciferasi esprimendo plasmide9, pAKlux2, di SpeI-HF e ScaI e clone SpeI-HF e SmaI digerito pWF278 per generare kanamicina resistente e luciferasi esprimendo plasmide, pWF27913. Nota: Per le estrazioni di plasmide e le purificazioni di frammento asportato, utilizzare l'estrazione commerciale plasmide e il kit di estrazione del gel, rispettivamente. Per digestione degli enzimi, mescolare 100 ng DNA, 1 μL 10 x buffer, 1 μL di ogni selezionato degli enzimi di limitazione e sterile ddH2O ad un volume totale di 10 μL e incubare a 37 ° C per 2,5-3 ore.</li>
	<li>Trasformare il plasmide pWF279 in cellule competenti di Escherichia coli O157: H7 EDL933 mediante elettroporazione con 2.500 V per 4 ms.</li>
	<li>Incubare le cellule di batteri trasformati in 1 mL di terreno di Luria-Bertani (LB) a 37 ° C per 1 h.</li>
	<li>Piastra i batteri su una piastra di agar LB completati con 50 µ g/mL di kanamicina a 37 ° C per 16-18 h.</li>
	<li>Controllare il segnale bioluminescente della piastra da uno in vivo imaging macchina il giorno successivo. Scegli una singola Colonia dalla piastra e cultura esso in 3 mL di LB completati con 50 kanamicina µ g/mL a 37 ° C per 16-18 h.</li>
	<li>Preparare il supporto di stock batterico diluendo 100% glicerolo sterile ddH2O per rendere la soluzione di glicerolo di 30%.</li>
	<li>La kanamicina resistente al gelo e. coli O157: H7 EDL933 batteri che harboring il plasmide luciferasi come azione batterica in un tappo a vite cryovial come un rapporto di 1:1 di soluzione di glicerolo cultura e 30% di batteri a-80 ° C. La concentrazione finale del glicerolo è del 15%.</li>
</ol>2. preparazione di batteri EHEC bioluminescenti per inoculazione orale
Nota: Il diagramma di flusso di timeline delle procedure sperimentali per la preparazione di EHEC e sonda gastrica orale del mouse è presentato nella Figura 1 per aiutare nella preparazione sperimentale.
<ol><li>Striscia e. coli O157: H7 EDL933 batteri che harboring plasmide luciferasi su una piastra di agar LB con 50 kanamicina µ g/mL a magazzino di-80 ° C. Crescere i batteri per 16-18 h a 37 ° C.</li>
	<li>Scegliere una singola Colonia dalla piastra durante la notte e la cultura in 3 mL LB medium con 50 kanamicina µ g/mL per 16-18 h in un incubatore a 37 ° C a 220 giri/min.</li>
	<li>Sottocultura i batteri (diluizione 1: 100) in kanamicina (50 µ g/mL) contenenti brodo LB per 2.5-3 h in un incubatore a 37 ° C a 200 giri/min. (Per esempio, aggiungere 2 mL coltivato durante la notte i batteri per mL 200 LB supplementato con kanamicina (50 µ g/mL)).</li>
	<li>Incubare i batteri per 2.5-3 h e misurare il valore di densità ottica a 600 nm (OD600) fino a quando il valore è compreso tra 0,9 a 1. Il numero di cellule batteriche è una densità di8 di circa 10 con unità formanti colonie (CFU) / mL.</li>
	<li>Centrifugare i batteri ri-colti a 8.000 x g per 30 min, 4 ° C.</li>
	<li>Scartare il supernatante senza agitare il pellet di batteri e lavare la pallina con 100 mL 0,9% normale soluzione salina sterile di movimentazione delicata.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.5 e 2.6 una volta.</li>
	<li>Dopo il lavaggio, centrifugare la coltura batterica a 8.000 x g per 30 min, 4 ° C e scartare il surnatante delicatamente.</li>
	<li>Condensa il pellet a 100 volte con soluzione salina sterile 0,9%. Per esempio, se sono centrifugati batteri 200 mL, aggiungere 2 mL di normale soluzione salina per sospendere il pellet.</li>
	<li>Confermare i batteri CFU (dovrebbe essere circa 109 CFU/100 μL dopo condensazione in salino normale) i batteri concentrati attraverso una diluizione seriale 10 volte25di placcatura.</li>
</ol>3. Mouse Gavage orale di EHEC
<ol><li>Trattare 6-settimana-vecchi topi C57BL/6 femminili con acqua di streptomicina (5 g/L) per 24 h.</li>
	<li>Dopo 24 h, passare alla normale acqua potabile per un altro 24 h prima sonda gastrica. Dopo il trattamento con acqua normale per 24 h, i topi sono pronti per sonda gastrica orale di EHEC.</li>
	<li>Riempire la siringa con 100 batteri EHEC di μL tirando indietro lo stantuffo. Assicurarsi che non siano bolle d'aria nella siringa. Rimuovere le bolle schioccando la siringa con le dita.</li>
	<li>Sollevare delicatamente l'animale e posizionarlo sulla parte superiore gabbia con cura.</li>
	<li>Afferrare il mouse per la coda con attenzione, e l'animale verrà presa nella parte superiore della gabbia e tentare di allontanare.</li>
	<li>Frenare dolcemente il mouse afferrando la pelle flaccida del collo e sul retro l'animale con pollice e indice per impedire che la testa del mouse in movimento.</li>
	<li>Tenere premuto il mouse in posizione verticale per inserire l'ago sonda gastrica e garantire che la testa del mouse è immobilizzato e verticale.</li>
	<li>Inserire l'ago sonda gastrica in bocca del mouse seguendo il tetto della bocca e spostare verso il basso nell'esofago e verso lo stomaco.</li>
	<li>Quando l'ago inserito è metà o due terzi lunghezza nel topo, iniettare 100 batteri EHEC μL, che contengono circa 10 celle di9 CFU.</li>
</ol>4. visualizzazione
<ol><li>Dopo l'alimentazione mediante sonda gastrica orale, rilevare i segnali bioluminescenti nei giorni 1 e 2.</li>
	<li>Prima di esaminare i segnali bioluminescenti di animali, li anestetizzare inserendole in una camera di 2,5% isoflurane con 1,5 L/min di ossigeno.</li>
	<li>Attendere 2-5 min fino a quando tutti i topi diventano inconscio e si fermano. Gli animali sono pronti per la rilevazione in vivo della bioluminescenza.</li>
	<li>Rilevare e immagine bioluminescenti segnali di animali da uno in vivo imaging system. Vedi sezione 5 "Acquisizione dati" per il funzionamento del software. Durante il processo di imaging, tutti gli animali sono sotto una fornitura continua di 2,5% isoflurane con 1,5 L/min di ossigeno.<ol>
<li>Fare clic su file > dal vivo e manualmente si concentrerà sul mouse.</li>
		<li>Selezionare l'intensità di laser e tempo di esposizione.</li>
		<li>Fare clic su acquisire > catturare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per l'ex vivo imaging, eutanasia i topi di dislocazione cervicale e rimuovere l'intero intestino dei topi infettati. Posizionare l'intestino in una capsula di Petri e immagine a 9 cm dal in vivo imaging sistema. L'impostazione è la stessa come l'in vivo imaging tranne il campo di vista è impostato come A/B. Per dettagli, vedere sezione 5 "Acquisizione dati". Nota: Il metodo per dislocazione cervicale: frenare i topi sulla parte superiore gabbia afferrando la coda con una mano in modo che gli animali afferrare la gabbia. Posizionare un pennarello o il pollice e l'indice di altra mano contro la parte posteriore del collo alla base del cranio. Spingere in avanti con la mano o un oggetto mentre tratteneva la testa e tirare all'indietro con la mano che tiene la coda rapidamente. Controllare molto attentamente per confermare l'arresto respiratorio e nessun battito cardiaco.</li>
</ol>5. acquisizione dati
Nota: Il software utilizzato per l'acquisizione dati è elencato nella Tabella materiali.
<ol><li>Per acquisizione di immagini, aprire il pannello di controllo di acquisizione del software (Figura 2).</li>
	<li>Selezionare "Luminescente", "fotografare" e "Overlay".</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione come "Auto". Impostare Binning come "Medio".</li>
	<li>Impostare ƒ/stop come 1 per luminescenti e 8 per fotografia. Ƒ/stop controlli la quantità di luce ricevuta dal sensore CCD.</li>
	<li>Impostare il campo visivo basato sul campo delle immagini che sono di interesse per l'acquisizione. Opzione "D" può montare cinque 6-settimana-vecchi topi e loro immagine tutto in un momento. "C" potete immagine tre 6-settimana-vecchi topi in un campo.</li>
	<li>Una volta che i topi/campioni sono pronti per l'imaging, fare clic su "Acquire" per acquisizione di immagini.</li>
	<li>Aprire i dati di immagine che è stati acquistati.</li>
	<li>Aprire il pannello tavolozza degli strumenti (Figura 3).</li>
	<li>Selezionare strumenti di ROI. Si consiglia il cerchio (quello più a sinistra) alla gamma della zona bioluminescente sulle immagini (Figura 4).</li>
	<li>Fare clic su "Misura ROIs" (icona di matita) per misurare l'intensità bioluminescente superficie (Figura 3). Il pannello di ROI misurazioni e i valori di quantificazione appaiono (Figura 5).</li>
	<li>Utilizzare la misurazione configurare nell'angolo sinistro del pannello misure ROI per selezionare i valori/informazioni necessarie (Figura 6), in caso contrario fare clic su "Esporta" per esportare questa tabella di dati e salvare come file CSV (Figura 5).</li>
	<li>Utilizzare i valori della colonna "Flusso totale (p/s)" come la quantificazione bioluminescenti intensità nel file CSV.</li>
</ol>

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<li>Frangioni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
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<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

È stato segnalato che EHEC trasformati con il plasmide luciferasi è stato utilizzato per esaminare la localizzazione nel host o espressione genica in vivo8,11,12. Il modello murino dimostrato qui è stato segnalato anche per rilevare i tempi di EHEC colonizzato e localizzazione in host murino8. Tuttavia, forniamo il protocollo di dettaglio di come amministrare l'inoculazione di EHEC ai topi intrag...

EHEC O157: H7 è un patogeno che causa diarrea1, HS2, HUS3e anche insufficienza renale4 attraverso cibo o acqua contaminato. EHEC è un patogeno enterobacterium e colonizza il tratto gastrointestinale di esseri umani1. Quando EHEC prima aderire all'epitelio intestinale host, iniettano i fattori di colonizzazione nelle cellule ospiti attraverso il sistema di secrezione di III tipo (T3SS) che funziona come una siringa molecolare che induce un fissaggio e cancellando (A/E) lesione successivamente per imporre adesione (colonizzazione)5. Questi geni coinvolti nella formazione della lesione A/E codificati per il locus dell'enterocita (LEE) il effacement patogenicità isola5.
Bioluminescenza è una reazione chimica produzione di luce, in cui luciferasi catalizza la luciferina di substrato per generare luce visibile6. Questo processo enzimatico richiede spesso la presenza di ossigeno o l'adenosina trifosfato (ATP)6. Bioluminescenza imaging (BLI) permette ai ricercatori la visualizzazione e la quantizzazione delle interazioni ospite-patogeno in animali vivi7. BLI possono caratterizzare il ciclo di infezione batterica in animali vivi seguendo i batteri bioluminescenti come migrare e invadere i tessuti differenti7; Questo rivela una progressione dinamica dell'infezione. Inoltre, la carica batterica negli animali è relativo al segnale bioluminescenti8; così, è un comodo indicatore per stimare le condizioni patologiche degli animali da esperimento in modo semplice e diretto.
Il plasmide usato qui contenute l'operone luciferasi, luxCDABE, che è il batterio Photorhabdus luminescens che codifica la propria luciferasi substrato7,9. Trasformando questo plasmide esprimendo la luciferasi in batteri, i processi di colonizzazione e l'infezione possono essere monitorati osservando questi batteri bioluminescenti animali vivi. Nel complesso, BLI e bioluminescenza-identificati batteri permettono ai ricercatori di monitorare i numeri batterici e la posizione, la vitalità batterica con antibiotici/terapia trattamento ed espressione genica batterica infezione/colonizzazione6, 7. sono stati segnalati numerosi batteri patogeni che esprimono l'operone luxCDABE per esaminare la loro espressione di ciclo e/o gene di infezione nell'infezione. Questi batteri, tra cui uropathogenic Escherichia coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogeni e. coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, e Vibrio cholerae20, sono stati documentati.
Parecchi modelli sperimentali sono stati sviluppati per facilitare lo studio di EHEC colonizzazione in vitro e in vivo21,22,23. Tuttavia, c'è una mancanza di adeguati modelli animali per studiare l'EHEC colonizzazione in vivoe quindi una conseguente scarsità di dettagli. Per facilitare lo studio di EHEC colonizzazione meccanismo in vivo, è prezioso per costruire modelli animali per osservare e quantificare la colonizzazione di EHEC animali vivi in un metodo non-invasivo.
Questo manoscritto descrive un modello di colonizzazione del mouse-EHEC che utilizza un sistema di espressione bioluminescente per monitorare la colonizzazione di EHEC nel tempo in soggiorno ospiti. Topi intragastrically vengono inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC e viene rilevato il segnale bioluminescente in topi con un non-invasiva in vivo imaging sistema13. I topi infettati con bioluminescenza-labeled EHEC hanno mostrato significativi segnali bioluminescenti in loro intestino dopo 2 giorni dopo l'infezione, che ha suggerito che tali batteri colonizzarono nell'intestino ospite dopo 2 giorni dopo l'infezione. Ex vivo immagine dati hanno mostrato che questa colonizzazione è specificamente nell'intestino cieco e del colon dei topi. Utilizzando questo modello di mouse-EHEC, la colonizzazione di EHEC bioluminescente può essere rilevata nell'ospite vivente da uno in vivo imaging system, per studiare i meccanismi dettagliati della colonizzazione di batteri enterici, che possono promuovere ulteriore comprensione in Cambiamenti fisiologici e patologici indotti da EHEC.

<table><tbody><tr><td>Incubatrice con agitatore</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>incubazione batterica&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubatore con agitazione orbitale</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>per incubazione di batteri&nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>fonte del gene nptII</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>fonte di luxCDABE operone</td></tr><tr><td>T& Un kit di clonazione</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>da utilizzare per la clonazione TA&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>uso per il clonaggio di plasmidi&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>uso per la clonazione di plasmidi&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>uso per il clonaggio di plasmidi&nbsp;</td></tr><tr><td>Sma I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>uso per la clonazione di plasmidi&nbsp;</td></tr><tr><td>T4 ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>uso per il clonaggio di plasmidi&nbsp;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>uso per l'amplificazione PCR</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>uso per l'amplificazione PCR</td></tr><tr><td>dNTP Miscela&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>uso per l'amplificazione PCR</td></tr><tr><td>PCR</td><td>macchina applicata Biosistema&nbsp;</td><td>2720 termociclatore&nbsp;</td><td>&nbsp; per l'amplificazione della PCR</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>uso per la soluzione di stoccaggio dei batteri</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>prodotto chimico per la produzione di LB medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>prodotto chimico per la produzione di LB medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Estratto di lievito in polvere</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>prodotto chimico per la produzione di LB medium, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>prodotto chimico per la produzione di LB agar</td></tr><tr><td>kanamicina&nbsp;</td><td>Antibiotici Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>, uso per</td></tr><tr><td>la streptomicina</td> da selecitoneGli antibiotici <td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>, eliminano il microbiota nei topi</td></tr><tr><td>EDL933 cellula competente</td><td>Il metodo fatto in casa</td><td></td><td>è su documento supplementare.</td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>per elettroporazione</td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>per elettroporazione</td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>uso per la centrifugazione di batteri&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>utilizzato per la centrifugazione di batteri&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>uso per la centrifugazione dei batteri&nbsp;</td></tr><tr><td>bottiglie da centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>utilizzare per centrifugare i batteri&nbsp;</td></tr><tr><td>flaconi da centrifuga</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>uso per la centrifugazione dei batteri&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Biofotometro Plus&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>per la misurazione del valore OD600 dei</td></tr><tr><td>batteri C57BL/6 topi</td><td>Camice da laboratorio Laboratory Animal Center di NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, guanti</td><td></td><td></td><td>per la protezione del personale&nbsp;</td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Panion & BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>per anestesia dei topi, siringa da 1ml di grado farmaceutico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>utilizzare per la sonda orale dei topi Ago</td></tr> <tr><td></td><td>per l'alimentazione riutilizzabile da 22 G con punta a sfera</td><td>&phi; 0,9 mm X L 50 mm</td><td>uso per sonda orale di topi</td></tr><tr><td>chirurgici &nbsp; forbici &nbsp;</td><td></td><td></td><td>utilizzare per l'esperimento sui topi</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Xenogen IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Spettro IVIS</td><td>utilizzare per l'acquisizione di immagini bioluminescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Software di immagine vivente</td><td>Perkin Elmer</td><td>versione 4.1</td><td>per quantificare i dati dell'immagine</td></tr></tbody></table>

rilevamento della colonizzazione di escherichia coli enteroemorragica in murino host di sistema non invasivo in vivo bioluminescenza

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) O157: H7, che è un agente patogeno portato dagli alimenti che causesdiarrhea, colite emorragica (HS), e la sindrome uremica emolitica (HUS), colonizzare il tratto intestinale degli esseri umani. Per studiare il meccanismo dettagliato della EHEC colonizzazione in vivo, è essenziale disporre di modelli animali per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC. Dimostriamo qui un modello di colonizzazione del mouse-EHEC trasformando il plasmide di espressione bioluminescente per EHEC per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC in soggiorno ospiti. Animali inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC mostrano segnali bioluminescenti intensi in topi tramite rilevazione con un non-invasiva in vivo imaging sistema. Dopo 1 e 2 giorni dopo l'infezione, bioluminescenti segnali potrebbero essere ancora presente in animali infettati, che suggerisce che EHEC colonizzare in padroni di casa per almeno 2 giorni. Inoltre dimostriamo che questi EHEC bioluminescenti individuare all'intestino del mouse, specificamente nell'intestino cieco e del colon, da immagini di ex vivo . Questo modello di colonizzazione del mouse-EHEC può servire come strumento per far progredire la conoscenza corrente del meccanismo di colonizzazione di EHEC.

Abbiamo amministrato la bioluminescenza-labeled EHEC (~ 109 cellule batteriche) ai topi C57BL/6 femminili 6 - settimana-vecchi mediante sonda gastrica orale. Dopo la somministrazione orale di EHEC ai topi all'interno di 1h, gli animali sono stati esaminati per segnale bioluminescenti secondo il sistema di imaging in vivo come mostrato nella Figura 7. I risultati hanno mostrato un forte segnale bioluminescente in topi di sonda gastrica con ...

Un protocollo dettagliato di un modello murino per enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) colonizzazione tramite bioluminescenza-identificati batteri è presentato. La rilevazione di questi batteri bioluminescenti di un non-invasiva in vivo imaging sistema animali vivi può avanzare la nostra comprensione corrente della colonizzazione di EHEC.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare la colonizzazione da parte di E.coli enteremorragici nei topi mediante un sistema di imaging non invasivo in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della patogenicità degli E.coli enteremorragici, come ad esempio la colonizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la colonizzazione da EHEC può essere rilevata in animali vivi senza dover sacrificare l'animale.Per iniziare, effettuare un’isolazione su piastra di agar LB contenente 50 microgrammi per millilitro di kanamicina partendo da una coltura di E.coli O157:H7 EDL933 a -80 gradi Celsius che ospita un plasmide luciferasico. Far crescere i batteri per 16-18 ore a 37 gradi Celsius. Scegliere una singola colonia dalla piastra ottenuta dopo la coltura notturna e inoculare 3 millilitri di terreno LB contenente 50 microgrammi per millilitro di kanamicina.Quindi, incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 220 giri al minuto per 16-18 ore. Il giorno seguente, preparare due millilitri di una diluizione 1:100 della coltura notturna e inocularla in 200 millilitri di LB con kanamicina. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 2,5-3 ore o fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge un valore compreso tra 0,9 e 1.Successivamente, centrifugare i batteri ricoltivati a 8000 volte la forza di gravità e a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Scartare il soprannatante senza disturbare il pellet e lavare i batteri con 100 millilitri di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% mediante agitazione delicata. Dopo il lavaggio, centrifugare nuovamente la coltura batterica e scartare con cura il soprannatante.Quindi, utilizzare soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per concentrare il pellet di 100 volte. Dopo aver trattato i topi con acqua contenente streptomicina per 24 ore secondo il protocollo descritto nel testo, riempire una siringa con 100 microlitri di batteri EHEC. Sollevare delicatamente l'animale e posizionarlo con attenzione sulla parte superiore della gabbia.Quindi, afferrare con attenzione il topo per la coda in modo che l'animale si aggrappi alla sommità della gabbia e tenti di allontanarsi. Trattenere delicatamente il topo utilizzando pollice e indice per afferrare la pelle molle del collo e della schiena dell'animale, impedendo così il movimento della testa. Successivamente, mantenere il topo in posizione verticale e assicurarsi che la testa rimanga immobilizzata in questa posizione.Inserire l'ago da gavaggio nella bocca dell'animale seguendo il palato e proseguire lungo l'esofago in direzione dello stomaco. Quando l'ago inserito ha percorso circa metà o due terzi del tragitto nel topo, iniettare i 100 microlitri di batteri EHEC che contengono circa 10 alla nona UFC di cellule. Dopo aver visualizzato le cellule bioluminescenti secondo il protocollo descritto nel testo, aprire il Pannello di Controllo dell'Acquisizione del software.Selezionare luminescenza, fotografia e sovrapposizione. Impostare il tempo di esposizione su automatico. Quindi impostare il binning su medio.Impostare il diaframma su uno per la luminiscenza e su otto per la fotografia. Il diaframma regola la quantità di luce ricevuta dal rilevatore CCD. Una volta che i campioni di topo sono pronti per l'acquisizione delle immagini, fare clic su acquisisci per iniziare l'acquisizione dell'immagine.Aprire i dati dell'immagine acquisiti, quindi aprire il pannello della tavolozza degli strumenti. Selezionare gli strumenti di area di interesse (ROI), come il cerchio, per definire l'area bioluminescente nelle immagini. Successivamente, utilizzando l'icona della matita, fare clic su "measure ROI's" per misurare l'intensità della bioluminescenza superficiale.Apparirà il pannello di misurazione delle aree di interesse (ROI) e i relativi valori di quantificazione. Quindi, nell'angolo in alto a sinistra del pannello delle misurazioni ROI, utilizzare l'opzione "Configura misurazione" per selezionare i valori/le informazioni necessari. In alternativa, fare clic su "Esporta" per esportare questa tabella dati e salvarla come file csv.Utilizzare infine i valori della colonna flusso totale p/s come quantificazione dell'intensità della bioluminescenza nel file csv. Come mostrato in questa immagine, un segnale di bioluminescenza intenso è stato osservato nei topi sottoposti a somministrazione orale mediante cannuccia con inoculo di EHEC marcato con bioluminescenza. In questa figura, i topi inoculati con EHEC selvaggio marcato con bioluminescenza EDL933 hanno mostrato segnali bioluminescenti intensi già a due giorni dall'infezione, suggerendo che l'EHEC aveva colonizzato l'ospite entro due giorni.Tuttavia, i topi infettati con un ceppo mutante di E.coli con difetti nei lipopolisaccaridi non mostrano bioluminescenza, suggerendo che un numero ridotto oppure nessun batterio abbia colonizzato questi animali. Per localizzare i batteri marcati con bioluminescenza, gli intestini di animali sacrificati sono stati analizzati ex vivo. Gli organi di topi infettati con EHEC marcato con bioluminescenza hanno mostrato un segnale bioluminescente significativo nel cieco e nel colon, indicando una colonizzazione in questi organi.Al contrario, i topi infettati con un mutante LPS hanno mostrato una riduzione della bioluminescenza nel tessuto intestinale, risultato in accordo con l'immagine ottenuta in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'esperimento utilizzando il sistema IV per monitorare la colonizzazione da EHEC nei topi.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Questo articolo descrive la somministrazione...

Bioluminescent Imaging batterica<em&gt; In Vivo</em

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Monitoraggio delle dinamiche dell'infezione batterica in un topo utilizzando la bioluminescenza

Fonte: Kuo, C., et al. Rilevamento della colonizzazione enteroemorragica di Escherichia coli nell'ospite murino mediante sistema di bioluminescenza in vivo non invasivo. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra la preparazione di una sospensione enteroemorragica di Escherichia coli che esprime luciferasi da stock congelato per l'uso come inoculo orale in modelli animali. Ciò consente il monitoraggio bioluminescente in tempo reale della colonizzazione intestinale durante gli studi di infezione in...

Preparazione dell'inoculo di Escherichia coli enteroemorragico bioluminescente

Fonte: de Vries, C. R., et al., Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica da ferita da Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Esp. (2020).Questo video mostra una tecnica di imaging bioluminescente per monitorare la progressione dell'infezione batterica in un modello murino vivo. I batteri patogeni ingegnerizzati con il sistema di segnalazione luxABCDE emettono luce nel sito di infezione, permettendo la visualizzazione dei batteri metabolicamente attivi. Attraverso l'imaging del topo...

Imaging bioluminescente delle infezioni batteriche nei topi

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Modellazione dell'infezione nei topi neonatali utilizzando batteri bioluminescenti incapsulati

Fonte: Valentine, M. E., et al., Generazione di mutanti di delezione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello murino di infezione. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'uso di un approccio di imaging basato sulla bioluminescenza per monitorare l'infezione batterica in un modello topino vivo. L'imaging bioluminescente e a raggi X sequenziale consente la visualizzazione in tempo reale e la localizzazione anatomica...

Imaging in tempo reale dell'infezione batterica in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

Fonte: Luyts, N., et al. Follow-up longitudinale delle infezioni delle vie urinarie e il loro trattamento nei topi tramite imaging bioluminescenze. J. Vis. Esp. (2021).Questo video dimostra l'induzione e il tracciamento dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando E. coli bioluminescente iniettate nella vescica, dove avvengono l'adesione, l'invasione e la replicazione intracellulare batterica. La luce emessa dall'operone bioluminescente funge da indicatore in tempo reale...

Visualizzazione dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

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4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

Questo manoscritto descrive la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni con un operone lux per indurre un'infezione del tratto urinario nei topi e la successiva analisi longitudinale in vivo della carica batterica utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

Follow-up longitudinale delle infezioni del tratto urinario e loro trattamento nei topi utilizzando l'imaging a bioluminescenza

Il parto pretermine (parto &lt; 37 settimane) è un problema urgente di salute globale con opzioni di prevenzione e trattamento non ottimali. Presentiamo un modello murino di parto pretermine indotto da infezione batterica vaginale ascendente e delineiamo come analizzare la morbilità e la mortalità neonatale risultanti.

Modellazione dell'infezione vaginale ascendente, della nascita pretermine e della morbilità neonatale nei topi

Impara a rilevare la colonizzazione di Escherichia coli enteroemorragica nei topi utilizzando un sistema di imaging bioluminescente non invasivo in vivo. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale senza sacrificare gli animali.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza (Video) | JoVE Journal

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

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