Name: Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Scopri un protocollo efficiente per derivare linee di cellule staminali embrionali da blastocisti di topo utilizzando fibroblasti umani come cellule feeder. Questo metodo semplificato offre elevate efficienze di derivazione per la ricerca in medicina rigenerativa.

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Ringraziamo Jonatan Lucas per la sua assistenza tecnica con coltura cellulare alimentatore, Servei Estabulari de la UAB per cura degli animali e Domènec Martín per la registrazione del video. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R e Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC è beneficiario di una borsa di studio di PIF-UAB.

l'uso degli animali descritti nelle sezioni riportate di seguito è stato approvato dal comitato di etica animale e umana ricerca della Universitat Autònoma de Barcelona e dalla Departament d' &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ho Alimentació della Generalitat de Catalunya (protocollo #8741).
 1. inattivazione delle cellule feeder e deposito Nota: fibroblasti umani del prepuzio (HFF-1) precedentemente sono stati congelati in 1 mL di soluzione di congelamento composto da 90% siero bovino fetale (FBS) e 10% dimetil solfossido ( DMSO) e conservati in azoto liquido fino uso.
<ol><li>Scongelare una fiala criogenica di HFF-1 (1 mL) immergendo il flaconcino in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere lo scongelati contenuto del flaconcino criogenico a Dulbecco pre-riscaldato &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) completati con 10% FBS per rendere un 01:10 diluizione.</li>
	<li>Le cellule diluite (10 mL) di semi in una boccetta di T75 e loro coltura a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Il giorno successivo, cambiare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 10 mL di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.</li>
	<li>Cultura il HFFs e cambiare il mezzo ogni 48 h fino a quando la cultura raggiunge la fase confluente. L'operazione potrebbe richiedere circa 7-10 gg.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di inattivazione, diluire mitomicina C in DMEM supplementato con 10% FBS ad una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Incubare le cellule con la soluzione di inattivazione per 3 h a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di inattivazione e sciacquare le cellule tre volte con 2 mL di Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) per eliminare i resti di mitomycin C.</li>
	<li>Per staccare le cellule inattivate, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA pre-riscaldato e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Osservare le cellule al microscopio invertito per assicurare sono scollegati (obiettivo 10x con 0,3 apertura numerica o NA). Se non lo sono, li Incubare per un paio di minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare le cellule sotto il microscopio invertito.</li>
	<li>Pipetta la soluzione con una pipetta Pasteur al fine di dissociare i grumi di cellule.</li>
	<li>Neutralizzare la soluzione enzimatica aggiungendo 4 mL di DMEM completati con 10% FBS e risospendere.</li>
	<li>Prendere un'aliquota della sospensione cellulare e fare una diluizione 1: 100 in HBSS. Per determinare il numero di celle, è necessario caricare 10 µ l della diluizione in un Neubauer &#39; camera di s. Contare le celle che si trova in una delle piazze più grandi della camera sotto un microscopio invertito (obiettivo x 20 con un NA 0,45).
	<ol><li>Ripetere il conteggio in un totale di quattro grandi piazze. Calcolare il numero totale di cellule (N) n = numero medio di cellule contate x volume totale x diluizione x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugare il resto del campione per 5 min a 200 x g. gettare il surnatante e risospendere il sedimento con congelamento soluzione ad una concentrazione di 10 6 cellule per mL.</li>
	<li>Aliquota della sospensione in fiale criogeniche con 10 6 cellule (1 mL) ogni. Posizionare le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento e congelare a -80 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, conservare i flaconi criogenici in azoto liquido.</li>
</ol> 2. Coltura cellulare alimentatore <ol><li>da uno a quattro giorni prima di iniziare il processo di derivazione, disgelo criogenico flaconcino contenente 1 x 10 6 inattivato HFF-1 cellule in un bagno di acqua a 37 ° C.</li>
	<li>Fare una diluizione di 1:6 di HFF-1 scongelati nel pre-riscaldati DMEM completati con 10% FBS e mantenere la temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Riempire ogni pozzetto di una piastra a 4 pozzetti con 500 µ l di pre-riscaldato 0,2% gelatina da pelle porcina e tenere la piastra a 37 ° C per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere i 500 µ l di gelatina dai pozzetti e aggiungere 500 µ l della diluizione HFFs. Scuotere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme del HFFs sul fondo dei pozzetti. Evitare movimenti circolari, in caso contrario si concentreranno le cellule al centro del pozzo.</li>
	<li>Incubare la piastra almeno 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 per ottenere un monostrato di HFFs inattivato in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio invertito (obiettivo 10x con NA 0,3) e verifica che siano collegati e distribuiti in modo omogeneo. Modificare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 µ l di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.</li>
</ol> 3. Raccolta degli embrioni e cultura <ol><li>quattro giorni prima della raccolta degli embrioni, amministrare 5 IU della cavalla incinta &#39; gonadotropina del siero di s tramite l'iniezione intraperitoneale di topi femmina 6-12 settimane vecchio. 
	Nota: Abbiamo usato le femmine da 129S2 o B6CFAF1 ceppi, anche se le femmine da altri ceppi del mouse possono essere utilizzate. Tuttavia, quando mezzo di lavoro con le femmine da ceppi non permissivi (ad es. CBA), dovrebbe essere completato con 2i come indicato al punto 4.2.</li>
	<li>Dopo 48 h, amministrare 5 UI di gonadotropina corionica umana tramite l'iniezione intraperitoneale e accoppiare le femmine con i maschi, almeno 8 settimane di vita, con un rapporto 1:1. Separare le femmine dai maschi il giorno successivo.</li>
	<li>Il giorno prima della raccolta degli embrioni, preparare una coltura cellulare di 35 mm di Petri con alcune gocce di 40 µ l di KSOMaag supplementato con 4 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e riempire il piatto con olio minerale per coprire completamente le gocce. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO 2 per equilibrare il medium.</li>
	<li>Per preparare pipette di manipolazione dell'embrione, scaldate la parte più sottile di un vetro con punta lunga pipetta Pasteur utilizzando un bruciatore di Bunsen. Una volta morbido, ritirarlo dal fuoco e separare le due estremità. Romperlo fino alla lunghezza desiderata. Il diametro interno alla punta dovrebbe essere 100-150 µm.</li>
	<li>Eutanasia i topi femminili di dislocazione cervicale 45-48 h coitum dell'alberino (p.c.).</li>
	<li>Sezionare i topi per esporre la cavità addominale tagliando la pelle con forbici affilate lisce curve ed il peritoneum con forbici affilate dritto. Afferrare un utero con una pinza, tagliare l'ovidotto utilizzando delle forbici affilate dritto e inserirlo nella tamponata Hepes CZB medio (HCZB) 13 a 37 ° C. Ripetere la procedura per rimuovere altri ovidotto.</li>
	<li>Flush ovidotti con una siringa da 1 mL caricati con HCZB tenuto da forcipe orologiaio per raccogliere gli embrioni 2-cell. 
	Nota: Per preparare il lavaggio dell'ago prendere un ago ipodermico 30g, tagliare l'estremità e a terra su una punta smussata su una pietra abrasiva.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta di bocca, prendere gli embrioni, lavarli in HCZB e loro cultura nella piastra di coltura degli embrioni precedentemente preparato a 37 ° C e 5% CO 2 fino allo stadio di blastocisti. Fino a 50 embrioni possono essere coltivati in ogni goccia di 40 µ l. Monitorare lo sviluppo dell'embrione ogni 24 h sotto uno stereomicroscopio. 
	Nota: In alternativa, gli embrioni possono essere raccolti allo stadio di blastocisti per abbreviare in vitro coltura embrionale. In questo caso, eutanasia le femmine al giorno p.c. 3,5-4,5, sezionare l'utero. e lavare con HCZB.</li>
</ol> 4. Derivazione di cellule staminali <ol><li>preparazione delle piastre derivazione <ol><li>il giorno di embrione semina, preparare il supporto di derivazione arricchendo terreno DMEM con 100 µM 2-β mercaptoetanolo, 1 x gli aminoacidi Non essenziali , 20% di siero sostituzione e 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Se lo si desidera, aggiungere anche 1 µM dell'inibitore MEK PD0325901 e 3 µM dell'inibitore GSK3 CHIR99021 per ottenere un mezzo di 2i.</li>
		<li>Prendere la piastra a 4 pozzetti con il monostrato di HFFs inattivato (punto 2.6) dalla incubatrice. Rimuovere il mezzo e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato a ciascun pozzetto. Riporre la piastra nell'incubatore.</li>
	</ol></li> <li>Pellucide rimozione ed embrione semina <ol><li>preparare una coltura cellulare 35mm Petri con gocce tre 30 µ l di acido Tyrode &#39; s soluzione 14 e tre 30 µ l gocce di mezzo di derivazione. Coprire le gocce con olio minerale e mantenere il piatto a 37 ° C.</li>
		<li>Prendere la piastra di coltura dell'embrione dall'incubatrice. Uno per uno, trasferire le blastocisti dalle gocce di cultura a un'acida Tyrode &#39; goccia di soluzione di s usando una pipetta di manipolazione dell'embrione. Se possibile, selezionare solo le blastocisti espanse per avviare il processo di derivazione.</li>
		<li>Monitor la zona pellucida Digestione sotto lo stereomicroscopio. Appena scompare la zona pellucida, trasferire le blastocisti ad un calo medio di derivazione per lavare fuori il Tyrode acide &#39; soluzione di s.</li>
		<li>Prendere la piastra 4 pozzetti derivazione da incubatrice e seme uno privi di zona blastocisti nell'alimentatore di cellule in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Ritorno la piastra 4 pozzetti derivazione in incubatrice e coltura a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Modificare la crescita delle cellule staminali di monitoraggio e medie <ol><li>monitorare le culture ogni 24 h sotto un microscopio invertito (obiettivo X 20 con 0,45 NA). È importante notare se ci sono segni di differenziazione delle cellule staminali, quali le cellule refrattiva gonfiate che circondano l'escrescenza o anche spingendo l'alimentatore cellule da parte.</li>
		<li>Ogni altro giorno, cambiare il mezzo della cultura. Prendere la piastra a 4 pozzetti dall'incubatrice, rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato completato con LIF e 2i, se utilizzato. Mantenere la cultura fino a escrescenze sono osservati (6-8 giorni).</li>
	</ol></li></ol> 5. Coltura della cellula formativa e manutenzione <ol><li>preparare Kolle-come maniglie e pipette di manipolazione di cellule staminali. Seguire il passo 3.4 preparare pipette di manipolazione di cellule staminali con un diametro interno sulla punta di 250-300 µm. utilizzare l'altra parte della pipetta Pasteur tirata per preparare la maniglia Kolle-come. Calore e modellarlo fino ad ottenere un hook.</li>
	<li>Prendere la piastra di coltura 4 pozzetti fuori l'incubatrice e individuare l'escrescenza sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare il quadratino per spingere via le cellule differenziate e gli alimentatori che circondano l'escrescenza. 
	Nota: Per evitare eventuale differenziazione della conseguenza, è importante rimuovere tutte le cellule differenziate dal bordo dell'escrescenza.</li>
	<li>Aspirare l'escrescenza con una pipetta di manipolazione di cellule staminali e posizionarlo in un nuovo piatto in una goccia di tripsina-EDTA 50 µ l.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi per tagliare la conseguenza in più parti al fine di disaggregare esso sia meccanicamente che enzimaticamente.</li>
	<li>Subito, trasferire i frammenti di conseguenza in una fresca goccia di mezzo di derivazione per neutralizzare l'azione della tripsina.</li>
	<li>Trasferire i frammenti di conseguenza una nuova piastra a 4 pozzetti con un monostrato di alimentatori. Trasferimento fino a 10 frammenti per pozzetto e cultura li con il mezzo di derivazione a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Mantenere le colture delle cellule staminali per almeno sei settimane prima di considerare la linea mESC stabilita. Modificare il mezzo ogni altro giorno e sottocultura li una volta a settimana.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se mESC linea derivazione è una procedura ben nota ordinariamente utilizzata in molti laboratori, sua efficienza non è sempre più in alto come previsto a causa di molteplici fattori che possono disturbare la pluripotenza manutenzione. Nel presente articolo abbiamo illustrato, passo dopo passo, come stabilire linee mESC con alta efficienza utilizzando un protocollo semplice e affidabile. Queste efficienze sono simili a quelli segnalati nella letteratura.
Per garantire la massima efficienz...

Cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule pluripotenti derivate da embrioni preimpianto, che mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare sotto condizioni specifiche1. Basato su queste proprietà, ESC sono diventati uno strumento utile per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e di studi ingegneria del tessuto2.
ESC sono stati derivati per la prima volta da embrioni di topo preimpianto, originari del mouse ESC (mESC) linee con successo basso3,4. Per anni, l'efficienza di derivazione è rimasta bassa a causa della difficoltà di mantenere la pluripotenza in vitro. Inoltre la presenza di alimentatore cellule5, che migliorano l'efficienza di derivazione, promuovere allegato di Colonia e migliorare stabilità karyotypic6, diverse modifiche del protocollo piombo ad un miglioramento nella manutenzione di pluripotenza. Le più importanti furono l'aggiunta di fattore inibitorio di leucemia (LIF) a mESC coltura7,8, l'uso di embrioni dal 129S2 sfondo permissiva9 e la cultura della mescita con supplementato con definita siero, privo di potenziali fattori di differenziazione10. Più recentemente, una prova convincente ha dimostrato che l'aggiunta di un cocktail di due piccole molecole modulatori delle vie di segnalazione al terreno di coltura mESC (noto come 2i) non consiglia di mantenere la pluripotenza. La 2i cocktail è costituito da una combinazione dell'inibitore MEK PD0325901, che riduce i segnali di differenziazione inibendo la chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), e l'inibitore di GSK3β CHIR99021, che migliora la sopravvivenza delle cellule a bassa densità attivando la via di Wnt11.
Nel presente articolo, descriviamo un semplice protocollo per derivare in modo efficiente mESC linee da blastocisti di topo. Seguiamo le procedure standard, la coltura di embrioni da ceppi permissive su cellule di alimentatore in medium di derivazione completate con LIF e un siero sostituzione12. Seguendo questo protocollo, mESC linee può essere derivato con efficienze equivalenti a quelli ottenuti in mezzo 2i. Nonostante ciò, 2i possono essere aggiunti per evitare possibili problemi con pluripotenza manutenzione o quando si lavora con ceppi non permissivi.

<table><tbody><tr><td>1 ml di sryringe</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione acida di Tyrode&nbsp;</td>Vedi ricetta <td>fatta</td><td></td><td>in casa in Nagy et al, 2003. Per la conservazione a breve termine (fino a 1 mese) mantenerla a 4&ordm;C. In alternativa, per la conservazione a lungo termine mantenerla a -20&ordm;C. Se l'efficienza della soluzione diminuisce, dovrebbe essere acidificata con l'aggiunta di una piccola goccia di HCl 1M.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-Topo IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Sonde Molecolari - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>diluizione 1:500. Anticorpo secondario per gli anticorpi di topo Oct4, Tuj1, &alpha;SMA e AFP.</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>Ricostituire con 2,15 ml di DMSO per ogni mg di polvere, per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Aliquotare al volume desiderato e conservare a -20&ordm;C. Evitare cicli di gelo e disgelo.</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc 3754518</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inattivarlo prima dell'uso riscaldandolo per 30 minuti a 56&ordm;C. Aliquotare e conservare a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Ago di lavaggio</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>Tagliare l'estremità dell'ago e macinare fino a ottenere una punta smussata su una pietra abrasiva</td></tr><tr><td>Gelatina di pelle suina</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Diluire allo 0,2% in acqua distillata e sterilizzare in autoclave. Ogni diluizione può essere utilizzata per un mese.</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra, sonde molecolari Alexa Fluor 594</td><td>- Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>diluizione 1:500. Anticorpo secondario per l'anticorpo di coniglio Sox2.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>CZB&nbsp tamponato con Hepes;</td><td>Fatto in</td><td></td> casa <td>Vedi composizione in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Diluire in NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotarlo in 1 ml e conservare a -20&ordm; C per un massimo di due mesi. Una volta scongelato, non congelare di nuovo.</td></tr><tr><td>Fibroblasti del prepuzio umano</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Per la conservazione a lungo termine si consiglia di conservarli in azoto liquido.</td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita di sostituzione del siero knockout</td><td></td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>Fotosensibile. Si consiglia di aliquotarlo in piccoli volumi come 10 ml e conservarlo a -20&ordm; C (controllare la data di scadenza). Evitare cicli di gelo e disgelo. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Integratore con 4 mg/ml di BSA. Equilibrare a 37&ordm; C e 5% di CO2 un giorno prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>Si consiglia di utilizzare topi di un ceppo permissivo in termini di derivazione mESC (come 129S2 o C57BL). Tuttavia, i ceppi di consanguineità sono meno efficienti nella produzione di embrioni. Pertanto, si consiglia di utilizzare un ceppo ibrido, come 129S2 x C57BL o B6CBAF1 per sfruttare il vigore dell'ibrido.</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embrione testato. Fotosensibile.</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Ricostituire la polvere con acqua MilliQ a 0,5 mg/ml. Conservare a 4&ordm; C protetto dalla luce. Attenzione, è dannoso e sospettato di causare il cancro.</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulina &; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 diluizione</td></tr><tr><td>Monoclonale di Topo anti-&alfa;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Monoclonale di Topo anti-AFP</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Topo monoclonale anti Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali Life</td><td>Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Ricostituire con 2,08 ml di DMSO per ogni mg di polvere, per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Aliquotare al volume desiderato e conservare a -20&ordm;C. Evitare cicli di gelo e disgelo.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavalla gravida gonadotropina</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Diluire in NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotare in 1 ml e conservare a -20&ordm; C per un massimo di due mesi. Una volta scongelato, non congelare di nuovo.</td></tr><tr><td>Coniglio policlonale anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>T75 falco</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Diluire 1:10 in HBSS per ottenere una soluzione 1x</td></tr></tbody></table>

derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di preimplantation mouse

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse sulle cellule staminali embrionali (mESC) derivazione è il processo da cui pluripotenti vengono stabilite linee cellulari da embrioni preimpianto. Queste linee mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare in condizioni specifiche. Grazie a queste proprietà, mESC sono uno strumento utile in medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e gli studi di ingegneria tissutale. Questo articolo viene descritto un semplice protocollo per ottenere linee mESC con efficienze di derivazione alta (60-80%) coltivando blastocisti da diversi ceppi di topi permissiva su cellule di alimentatore in medium definito completati con fattore inibitorio di leucemia. Il protocollo può anche applicarsi per derivare in modo efficiente mESC linee da diversi ceppi di topi non permissivi, per semplice aggiunta di un cocktail di due piccole molecole inibitori al medium di derivazione (2i medio). Procedure dettagliate sulla preparazione e sulla coltura di cellule di alimentatore, raccolta e cultura d'embrioni di topo e derivazione e mESC linee sono fornite. Questo protocollo non richiede attrezzature specializzate e può essere effettuato in qualsiasi laboratorio con competenze di cultura di base su cellule di mammifero.

A seguito di questo protocollo, oltre il 95% della formazione di conseguenza dovrebbe avvenire dopo la prima settimana della cultura (Figura 1A). Creazione di linee di mESC dopo sei passaggi è variabile tra repliche sperimentali, con una media di successo del 60-80%. L'aggiunta di 2i non migliora significativamente i risultati quando si lavora con diversi ceppi di topi permissiva, come quelli con un background di 129S2, ma è necessario quando si lavora con ce...

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Le cellule staminali sono cellule pluripotenti e specializzate caratterizzate dal loro autorinnovamento a lungo termine e dalla capacità di generare cellule differenziate provenienti dai tre strati germinativi in determinate condizioni. Grazie a queste proprietà, le cellule staminali presentano un notevole potenziale nella medicina rigenerativa, nella modellizzazione delle malattie e nell'ingegneria animale. Per anni, le linee cellulari staminali embrionali destinate alla ricerca sono state ottenute principalmente da embrioni di topo, ma in generale le efficienze di derivazione raggiunte sono state basse.In questo video, mostriamo un semplice protocollo per ottenere linee cellulari di cellule staminali embrionali di topo utilizzando condizioni standard che garantiscono efficienze di derivazione ragionevolmente elevate, paragonabili a quelle ottenute usando modulatori delle vie di segnalazione, come il 2i. In questo protocollo, utilizzeremo fibroblasti di foreskin umano come cellule di supporto per la derivazione e la coltura delle ESC. Prima di iniziare il processo di derivazione delle ESC, è necessario inattivare le cellule di supporto.Prelevare innanzitutto una provetta criogenica contenente fibroblasti del prepuzio umano conservati in azoto liquido e scongelarla immergendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi C. Una volta scongelata, diluire il contenuto in DMEM integrato con siero fetale bovino. Seminare la diluizione in una fiala Falcon e coltivare fino a raggiungere lo stadio di confluenza. Successivamente, per inattivare i fibroblasti, diluire la mitomicina C in DMEM integrato con siero fetale bovino e incubare le cellule per tre ore in questa soluzione di inattivazione.Quindi, rimuovere la soluzione di inattivazione e lavare le cellule tre volte con soluzione salina equilibrata di Hanks per eliminare i residui di mitomicina C. Per staccare le cellule feeder inattivate, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-EDTA e incubare le cellule per cinque minuti. Successivamente, osservare le cellule al microscopio invertito per assicurarsi che siano state staccate dalla fiasca di coltura.Quindi, pipettare le cellule con una pipetta di Pasteur per dissociare gli aggregati cellulari e neutralizzare la soluzione enzimatica aggiungendo quattro millilitri di DMEM integrato con siero fetale bovino. Prelevare un piccolo aliquota, diluirlo in soluzione salina e determinare il numero di cellule utilizzando una camera di Neubauer. In parallelo, centrifugare il resto del campione.Eliminare il soprannatante e diluire il pellet nella soluzione crioprotettiva a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro. Aliquotare la sospensione in provette criogeniche. Infine, posizionare le provette criogeniche in un contenitore per congelamento e conservarle a meno 80 gradi C. Il giorno successivo, trasferirle in azoto liquido.Da uno a quattro giorni prima di iniziare il processo di derivazione, prelevare un criotubo contenente cellule feeder inattivate conservate in azoto liquido e scongelarlo in un bagno d'acqua a 37 gradi C. Successivamente, diluire le cellule in DMEM preriscaldato integrato con siero bovino fetale e pipettare delicatamente per assicurare una miscela omogenea. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di gelatina preriscaldata in ogni pozzetto di una piastra a quattro pozzetti e mantenere a 37 gradi C per 10 minuti. Immediatamente dopo, rimuovere la gelatina da ciascun pozzetto.Aggiungere 500 microlitri della diluizione di cellule feeder in ciascun pozzetto ed agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule feeder sul fondo dei pozzetti. Evitare movimenti circolari, poiché ciò causerebbe l’accumulo delle cellule al centro del pozzetto. Successivamente, posizionare la piastra nell’incubatrice a 37 gradi e 5% di anidride carbonica per almeno 24 ore.Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio invertito e verificare che siano attaccate e ben distribuite. Infine, sostituire il mezzo delle cellule feeder con DMEM preriscaldato integrato con siero fetale bovino per rimuovere i residui di DMSO. Prima della raccolta degli embrioni, indurre la superovulazione nella femmina di topo mediante iniezione intraperitoneale di cinque unità internazionali di gonadotropina di siero di puledra gravida e gonadotropina corionica umana, con un intervallo di 48 ore.Accoppiare le femmine con i maschi e separarli dopo 24 ore. Per raccogliere gli embrioni allo stadio a due cellule, sopprimere le femmine 48 ore dopo il coito, dissezionare i topi femmina per ottenere le ovidutti e una breve porzione delle corna uterine, e posizionarli in una piastra contenente mezzo CZB tamponato con HEPES. Successivamente, sotto microscopio stereoscopico, lavare singolarmente le ovidutti con mezzo CZB tamponato con HEPES per raccogliere gli embrioni.Trasferire gli embrioni a due cellule in una piastra da coltura preparata il giorno precedente con diverse gocce di mezzo di coltura per embrioni ricoperte di olio minerale. Mantenere gli embrioni nell'incubatore fino alla fase di blastocisti. Monitorare lo sviluppo degli embrioni ogni 24 ore.Ci si aspetta che gli embrioni raggiungano la fase di blastocisti 48 ore dopo l'inizio della coltura in vitro. Se possibile, selezionare solo blastocisti espansi per avviare il processo di derivazione. Nel giorno della semina degli embrioni, preparare il mezzo per la derivazione delle cellule staminali.Aggiungere il fattore inibitore della leucemia, o LIF, al DMEM integrato con 2-beta-mercaptoetanolo, aminoacidi non essenziali e sostituto del siero KnockOut. Se desiderato, aggiungere un inibitore della MAPK e un inibitore della GSK-3 per ottenere un mezzo 2i. Prelevare la piastra a quattro pozzetti con il monolayer di cellule feeder dall'incubatore.Rimuovere il mezzo e aggiungere 800 microlitri di mezzo di derivazione appena preparato. Prima di seminare i blastocisti sulle cellule di supporto, è necessario rimuovere la zona pellucida. A tale scopo, trasferire un embrione dalla piastra di coltura in una goccia di soluzione acida di Tyrode e mantenerlo in tale posizione fino a quando la zona pellucida non viene digerita.Assicurarsi che la zona pellucida sia stata completamente rimossa regolando la messa a fuoco e il contrasto del microscopio stereoscopico. Quindi, risciacquare l'embrione privo di zona in diverse gocce di mezzo di derivazione e seminare su un monostrato di cellule feeder. Ripetere il processo con i restanti embrioni.Coltivare la piastra a 37 gradi C e 5% di anidride carbonica. Monitorare le colture ogni 24 ore al microscopio invertito per valutarne la crescita e identificare eventuali segni precoci di differenziamento, come cellule rigonfie e rifrangenti che circondano l'espansione o che addirittura spingono da parte le cellule di supporto. Cambiare il mezzo di coltura ogni due giorni.A tal fine, prelevare la piastra a quattro pozzetti dall'incubatore, rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e aggiungere 800 microlitri di mezzo di derivazione pre-riscaldato, integrato con LIF e 2i se utilizzati. Reintrodurre le piastre nell'incubatore e mantenere la coltura fino all'osservazione di espansioni cellulari. Da sei a otto giorni dopo la semina dei blastocisti, dovrebbe essere visibile un'espansione cellulare, che deve essere sottoculturata.Per questa procedura, sono necessari pipetti con manici simili a quelli per scannellatura e pipette per la manipolazione delle cellule staminali. Per realizzarli, prendere una pipetta di Pasteur con punta lunga e riscaldarne la parte più sottile utilizzando un becco di Bunsen. Una volta ammorbidita, rimuovere la pipetta dalla fiamma e tirare i due estremi in direzioni opposte finché non si separano.Utilizzare la parte più spessa come pipetta per la manipolazione delle cellule staminali. Riscaldare la punta della parte più sottile e modellarla fino a ottenere un gancio per preparare un manico simile a un coltello. Per il sottocoltura dell'espansione cellulare, localizzarla sotto il microscopio stereoscopico.Con l'aiuto della maniglia, allontanare le cellule differenziate che circondano l'espansione. Per evitare una eventuale differenziazione, è fondamentale essere rigorosi nel rimuovere le cellule differenziate dal margine dell'espansione. Utilizzando una pipetta per la manipolazione di cellule staminali, aspirare l'espansione e posizionarla in una goccia di soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata.Con l'aiuto di un bisturi, tagliare l'espansione in diversi pezzi per disgregarla meccanicamente ed enzimaticamente. Recuperare i frammenti di espansione e posizionarli in una goccia di mezzo di derivazione preriscaldato per neutralizzare l'azione della tripsina. Infine, seminare i frammenti di espansione in una piastra a quattro pozzetti con uno strato monocellulare di cellule feeder e coltivarli in un mezzo di derivazione a 37 gradi C e 5% di anidride carbonica.Le colture di tipo stamminale devono essere mantenute per almeno sei settimane prima che una linea di cellule staminali embrionali possa essere considerata stabilita. Durante questo periodo, è necessario cambiare il mezzo ogni due giorni e sottocolturarle una volta alla settimana. Con l'aumentare del numero di passaggi, la morfologia delle colonie cambia progressivamente da una forma a cupola a una morfologia più allungata e appiattita.Dopo sei passaggi, le linee di ESC murine esprimono costitutivamente marcatori di pluripotenza, come Oct 4 e Sox 2. Inoltre, dopo aver indotto la differenziazione in vitro delle ESC coltivandole in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e in assenza di cellule di supporto, è possibile rilevare mediante immunofluorescenza marcatori rappresentativi dei tre strati germinativi. Qui mostriamo il rilevamento della proteina anti-tubulina beta-3 come marcatore per l'ectoderma, dell'actina alfa-smooth muscle per il mesoderma e dell'alfa-fetoproteina per l'endoderma.Seguendo questa semplice procedura, le cellule staminali embrionali possono essere derivate da blastocisti di topo con efficienze comprese tra il 60% e il 78%. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante controllare le cellule quotidianamente o ogni due giorni, poiché i tempi indicati qui sono puramente indicativi. Se le colonie di cellule staminali embrionali crescono eccessivamente, diventano più scure a causa dell'accumulo cellulare e tendono a differenziarsi più facilmente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della derivazione e della coltura delle cellule staminali embrionali di topo utilizzando condizioni standard.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

La capacità di cellule germinali embrionali di differenziarsi in cellule germinali primordiali durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 embrioni giorni post coitum mouse.

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In questo video, dimostriamo l'isolamento di blastocisti mouse e la derivazione di cellule staminali trofoblasto da blastocisti. Abbiamo anche descrivere le condizioni per il mantenimento della proprietà delle cellule staminali e l'induzione della differenziazione nella cultura.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

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Un metodo semplice per ottenere e mantenere spermatogoni staminali e linee di cellule progenitrici da topi adulti è presentato qui. Il metodo utilizza cellule di alimentazione provenienti dal compartimento delle cellule somatiche del testicolo di topo adulto. Questa tecnica è applicabile ai ceppi di topi comuni, tra cui transgenici, knock-out e knock-nei topi.

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Negli ultimi anni la formazione di cellule germinali utilizzando metodi in coltura in vitro è stata dimostrata utilizzando diversi tipi di cellule staminali somatiche. Questo articolo presenta visivamente la differenziazione delle cellule staminali derivate topo neonato per primi cellule ovocita-like.

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Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l'imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini sono descritte.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

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Scopri un protocollo efficiente per derivare linee di cellule staminali embrionali da blastocisti di topo utilizzando fibroblasti umani come cellule feeder. Questo metodo semplificato offre elevate efficienze di derivazione per la ricerca in medicina rigenerativa.

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