In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

I processi neovascolari sono una caratteristica distintiva di diverse patologie oculari comuni. Tra queste, in particolare, la degenerazione maculare legata all'età di tipo essudativo o AMD umida, la retinopatia diabetica proliferativa e la retinopatia della prematurità. Complessivamente, questi disturbi sono responsabili della maggior parte dei casi di cecità legale in tutto il mondo e sono associati ad altre complicanze oculari, come emorragia vitreale e glaucoma neovascolare.

Tuttavia, nonostante la loro diffusione, le opzioni terapeutiche per i disturbi neovascolari oculari sono limitate. L'attuale standard di cura per la neovascolarizzazione associata alla degenerazione maculare legata all'età (AMD) e alla retinopatia diabetica proliferativa è l'iniezione intravitreale di anticorpi umanizzati diretti contro un mediatore fondamentale dell'angiogenesi e della neovascolarizzazione, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare o VEGF. Tuttavia, nonostante l'efficacia nel fermare il decorso della malattia e nel migliorare la funzione visiva, le iniezioni intravitreali sono costose e lungi dall'essere prive di rischi.

Le complicazioni possono includere infezioni, endoftalmite, distacco della retina ed emorragia oculare. Pertanto, esiste un'urgente necessità di sviluppare nuove opzioni terapeutiche che siano efficaci, sicure e meno costose. Per favorire lo sviluppo di farmaci per i disturbi neovascolari, i modelli animali di piccola taglia rivestono un'importanza fondamentale.

Tali modelli devono essere riproducibili, avere letture e punti finali stabiliti e validati, e idealmente utilizzare un composto di riferimento clinicamente rilevante come controllo positivo. In questo protocollo, presenteremo il modello di neovascolarizzazione coroideale nel topo, o modello CNV, che è uno dei modelli più comunemente utilizzati sia per lo studio dei meccanismi fisiopatologici che contribuiscono alla CNV sia per lo sviluppo di nuovi agenti anti-neovascolari. Nel modello CNV, la membrana di Bruch viene rotta mediante un laser ad argon.

In tal modo si iniziano processi neovascolari che originano dal coroide. L'impiego di imaging longitudinale in vivo mediante tomografia a coerenza ottica a dominio spettrale, o SD-OCT per brevità, e angiografia con fluoresceina, fornisce un mezzo per seguire la proliferazione e la regressione della neovascolarizzazione coroideale (CNV). E, di conseguenza, per valutare l'efficacia e il decorso temporale di nuovi interventi farmacologici.

I recenti progressi nell'elaborazione delle immagini consentono inoltre la segmentazione automatizzata per la misurazione dello spessore retinico, fornendo una metodologia priva di bias dell'osservatore per valutare la presenza di edema. In questo articolo, discuteremo l'utilità del nuovo software InVivoVue Diver di Leica Microsystems per la segmentazione automatizzata dei livelli retinici nel modello di neovascolarizzazione coroideale del topo. Infine, illustreremo come l'analisi istologica di preparati interi della retina possa integrare l'imaging in vivo longitudinale in questo modello.

Una singola goccia di tropicamide viene applicata su ciascun occhio per la dilatazione della pupilla. Successivamente, l'animale viene posizionato delicatamente sulla piattaforma di allineamento per roditori. Il topo viene sistemato in modo da esporre l'occhio e fissato utilizzando il supporto per il muso e un pezzo di nastro adesivo da laboratorio posizionato delicatamente sulla parte posteriore.

Successivamente, viene applicata una goccia di lubrificante sull'occhio per idratarlo, e ogni liquido in eccesso viene accuratamente rimosso utilizzando tamponi di carta filtrante. Infine, lo stadio viene allineato davanti al dispositivo OCT per l'acquisizione dell'immagine OCT di base. L'acquisizione in vivo di tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale viene eseguita nel punto basale, prima dell'applicazione del laser, al fine di verificare l'assenza di eventuali anomalie retiniche.

Rimuovere delicatamente il topo dal supporto. Applicare una goccia di Viscotears Gel su un'ampolla per appiattire la cornea. Posizionare il topo in modo che la testa del nervo ottico sia al centro e focalizzare il raggio laser sull'epitelio pigmentato della retina.

Eseguire tre colpi laser evitando i vasi sanguigni retinici in corrispondenza delle posizioni alle quattro, otto e dodici ore attorno al nervo ottico. Verificare la rigidità dell'occhio dopo tutti i colpi laser per accertare l'assenza di emorragie retiniche. Come in precedenza, allineare il topo nel supporto ed eseguire angiografia con fluoresceina e imaging OCT per confermare il danno della membrana di Bruch.

Per l'angiografia con fluoresceina, focalizzare innanzitutto le aree di bruciatura laser utilizzando la modalità di riflettanza in infrarosso, che permette di visualizzare i siti in cui è stato applicato il laser. Iniettare con attenzione 0,1 millilitri di sale sodico di fluoresceina al 5%, per circa 20 grammi di peso corporeo del topo, senza modificare la posizione dell'occhio del topo. Iniziare ad acquisire immagini di angiografia con fluoresceina a livello della coroide e a livello della retina, approssimativamente ogni 30 secondi.

Allineare l'occhio per l'imaging OCT come in precedenza e avviare l'imaging. La media del segnale SD-OCT aiuta a visualizzare meglio la morfologia retinica dettagliata, come mostrato in questa sequenza. Al termine dell'imaging SD-OCT, rimuovere con attenzione il topo dal supporto.

Applicare un lubrificante in entrambi gli occhi. A questo punto, è possibile scegliere se invertire l'anestesia mediante iniezione sottocutanea dell'antagonista alfa-2 della medetomidina, l'atipamezolo, oppure attendere il risveglio naturale dell'animale dall'anestesia. Ripetere l'imaging in vivo mediante SD-OCT e FA negli animali anestetizzati nei giorni di follow-up 5, 10 e 14.

Utilizzare la funzione di segmentazione automatica del software InVivoVue Diver per le misurazioni dello spessore retinico. Per la retina sana, lo spessore retinico totale è considerato come lo spessore di tutti gli strati, dallo strato delle fibre nervose fino all'epitelio pigmentato retinico (RPE). Nella retina sana, la segmentazione automatica può rilevare con precisione i singoli strati retinici, come si può osservare in questo esempio.

È degno di nota che nei punti in cui è presente un'acne vascolare coroideale (CNV), la misurazione manuale dello spessore retinico deve essere eseguita separatamente per ciascun sito della lesione da CNV. Dalla strato delle fibre nervose fino a una linea immaginaria passante attraverso il livello dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa sequenza mostra il flusso di lavoro per le misurazioni manuali dello spessore nei siti in cui sono presenti lesioni da CNV.

Il livello delle fibre nervose si trova nella parte superiore, la coroide nella parte inferiore dell'immagine. Utilizzando il mouse o il touchpad, i bordi del livello delle fibre nervose e della coroide vengono determinati manualmente, e il software calcola automaticamente lo spessore totale della retina sulla base di queste coordinate. Questa figura mostra immagini seriali acquisite ogni 20 secondi a livello coroideale.

L'immagine uno è stata acquisita in modalità riflettanza nell'infrarosso. Le altre, invece, dopo iniezione intraperitoneale di fluoresceina. Le frecce bianche nell'immagine uno indicano i siti trattati con il laser, che mostrano fuoriuscita di fluoresceina in momenti successivi, evidenziata dalle frecce bianche nell'immagine 18.

Questa immagine mostra l'acquisizione seriale di FA a livello retinico. La freccia bianca nell'immagine 18 indica un sito trattato con laser, che mostra una fuoriuscita di fluoresceina più rapida rispetto alle altre due, delimitate da cerchi nell'immagine 18. Questa figura riassuntiva mostra l'andamento temporale delle immagini SD-OCT.

All'inizio, immediatamente dopo l'applicazione del laser e nei punti di controllo successivi ai giorni cinque, 10 e 14. In sintesi, il protocollo per l'imaging longitudinale in vivo delle lesioni da neovascolarizzazione coroideale mediante imaging con OCT a dominio spettrale e angiografia con fluoresceina consente una classificazione rapida, multimodale e affidabile della patologia da neovascolarizzazione coroideale e della presenza di edema retinico. Grazie per il vostro interesse.