In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.

processi neovascolari sono un tratto caratteristico di diverse patologie oculari prevalenti. In particolare, la degenerazione maculare senile essudativa o AMD umida per la retinopatia diabetica breve e proliferativa e la retinopatia del prematuro. Insieme, questi disturbi rappresentano la maggior parte dei casi di cecità legale in tutto il mondo e sono associati a ulteriori complicanze oculari, come l'emorragia vitreale e il glaucoma neovascolare.

Tuttavia, nonostante la loro prevalenza, le opzioni terapeutiche per i disturbi neovascolari oculari sono limitate. L'attuale standard di cura per la neovascolarizzazione associata all'AMD e alla retinopatia diabetica proliferativa è l'iniezione intravitreale di anticorpi umanizzati diretti contro un mediatore critico dell'angiogenesi e della neovascolarizzazione, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare o VEGF. Tuttavia, nonostante l'efficacia nell'arrestare la progressione della malattia e nel migliorare la visione funzionale, le iniezioni intravitreali sono costose e lungi dall'essere prive di rischi.

Le complicanze possono includere infezioni, endoftalmite, distacco di retina ed emorragia oculare. Pertanto, c'è un urgente bisogno di sviluppare nuove opzioni di trattamento che siano efficaci, sicure e meno costose. Al fine di far progredire lo sviluppo di farmaci per i disturbi neovascolari, i modelli di piccoli animali sono di fondamentale importanza.

Tali modelli devono essere riproducibili, avere letture ed endpoint stabiliti e convalidati e, idealmente, utilizzare un composto di riferimento clinicamente rilevante per fungere da controllo positivo. In questo protocollo, presenteremo la neovascolarizzazione coroideale di topo, o modello CNV, che è uno dei modelli più comunemente impiegati sia per lo studio dei meccanismi fisiopatologici che contribuiscono alla CNV sia per lo sviluppo di nuovi agenti anti-neovascolari. Nel modello CNV, la membrana di Bruch viene rotta utilizzando un laser ad argon.

Avviando così i processi neovascolari originati dalla coroide. L'impiego dell'imaging longitudinale in vivo mediante tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, o SD-OCT in breve, e angiografia con fluoresceina, fornisce un mezzo per seguire la proliferazione e la regressione della CNV. E quindi, per valutare l'efficacia e il decorso temporale di nuovi interventi farmaceutici.

I recenti progressi nell'elaborazione delle immagini consentono inoltre la segmentazione automatizzata per la misurazione dello spessore retinico, fornendo una metodologia priva di pregiudizi da parte dello sperimentatore per valutare la presenza di edema. In questo articolo, discuteremo l'utilità del nuovo software InVivoVue Diver di Leica Microsystems per la segmentazione automatizzata degli strati retinici nel modello CNV murino. Infine, discuteremo come l'analisi istologica delle montature retiniche intere possa integrare l'imaging longitudinale in vivo in questo modello.

Una singola goccia di tropicamide viene applicata su ciascun occhio per la dilatazione pupillare. Successivamente, l'animale viene posizionato delicatamente nella fase di allineamento dei roditori. Il mouse è regolato per esporre l'occhio e fissato utilizzando il supporto per il naso e un pezzo di nastro adesivo da laboratorio posizionato delicatamente sul retro.

Successivamente, una goccia di lubrificante viene applicata sull'occhio per idratare e il liquido in eccesso viene accuratamente rimosso utilizzando tamponi di carta da filtro. Infine, il tavolino è allineato davanti al dispositivo OCT per l'imaging OCT di base. L'imaging con tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale in vivo viene eseguito al basale, prima dell'applicazione laser, al fine di verificare l'assenza di anomalie retiniche.

Rimuovere delicatamente il mouse dal supporto. Metti una goccia di Viscotears Gel su un vetrino coprioggetti per applare la cornea. Orientare il topo con la testa del nervo ottico al centro e focalizzare il raggio laser sull'epitelio pigmentato retinico.

Effettua tre colpi laser evitando i vasi sanguigni retinici a ore quattro, otto e 12 intorno al nervo ottico. Ispezionare la fermezza dell'occhio dopo tutti i colpi laser per l'assenza di sanguinamento retinico. Come in precedenza, allineare il mouse nel supporto ed eseguire l'angiografia con fluoresceina e l'imaging OCT per confermare il danno alla membrana di Bruch.

Per l'angiografia con fluoresceina, mettere a fuoco prima le aree di ustione laser utilizzando la modalità di riflettanza infrarossa, che consente di visualizzare i siti in cui è stato somministrato il laser. Iniettare con cautela 0,1 millilitri di sale sodico al 5% di fluoresceina, per circa 20 grammi di peso corporeo del topo senza modificare la posizione dell'occhio del topo. Iniziare a prendere immagini angiografiche con fluoresceina a livello della coroide e a livello della retina, circa ogni 30 secondi.

Allineare l'occhio per l'imaging OCT come prima e iniziare l'imaging. La media del segnale SD-OCT aiuta a visualizzare meglio la morfologia retinica dettagliata, come mostrato in questa sequenza. Una volta eseguito l'imaging SD-OCT, rimuovere con cautela il mouse dal supporto.

Applicare lubrificante per entrambi gli occhi. A questo punto, si può scegliere di invertire l'anestesia mediante iniezione sottocutanea dell'antagonista alfa-2 per medetomidina, atipamezolo o attendere il recupero dell'animale dall'anestesia. Ripetere l'imaging SD-OCT e FA in vivo negli animali anestetizzati nei giorni di follow-up cinque, 10 e 14.

Utilizza la funzione di segmentazione automatica del software InVivoVue Diver per le misurazioni dello spessore della retina. Per la retina sana, lo spessore totale della retina è considerato come lo spessore di tutti gli strati, dallo strato di fibre nervose all'RPE. Nella retina sana, la segmentazione automatizzata può rilevare con precisione i singoli strati retinici, come si può vedere in questo esempio.

È degno di nota ricordare che nei luoghi in cui è presente la CNV, la misurazione manuale dello spessore retinico deve essere eseguita separatamente per ciascun sito della lesione CNV. Dallo strato di fibre nervose a una linea immaginaria che passa attraverso lo strato di RPE. Questa sequenza mostra il flusso di lavoro per le misure manuali dello spessore nei siti in cui sono presenti lesioni CNV.

Lo strato di fibre nervose si trova nella parte superiore, la coroide nella parte inferiore dell'immagine. Utilizzando il mouse o il touchpad, i bordi dello strato di fibre nervose e della coroide vengono determinati manualmente e il software calcola automaticamente lo spessore totale della retina in base a queste coordinate. Questa figura mostra le immagini seriali scattate ogni 20 secondi a livello coroideale.

La prima immagine è stata acquisita in modalità di riflettanza infrarossa. Mentre gli altri, dopo iniezione intraperitoneale di fluoresceina. Le frecce bianche nell'immagine uno puntano ai siti laserati, che mostrano una perdita di fluoresceina in punti temporali successivi, evidenziati dalle frecce bianche nell'immagine 18.

Questa immagine mostra l'imaging seriale FA acquisito a livello retinico. La freccia bianca nell'immagine 18 indica un sito laserato, che mostra una perdita di fluoresceina che appare più velocemente delle altre due, delineate in cerchi nell'immagine 18. Questa figura di riepilogo mostra l'andamento temporale delle immagini SD-OCT.

Al basale, subito dopo il lasering, e i punti temporali di follow-up nei giorni cinque, 10 e 14. In sintesi, il protocollo per l'imaging longitudinale in vivo delle lesioni CNV utilizzando l'imaging SD-OCT e FA consente la classificazione rapida, multimodale e affidabile della patologia CNV e della presenza di edema retinico. Grazie per il vostro interesse.