Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questo protocollo di dissezione cerebrale di Drosophila è quello di ottenere cervelli intatti da moscerini adulti che possono essere utilizzati in un'ampia gamma di applicazioni, come l'immunofluorescenza, la localizzazione di proteine marcate con GFP ed esperimenti di coltura ex-vivo. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo e delle neuroscienze, come i ruoli di proteine specifiche e le vie di segnalazione e la definizione di modelli di connettività neuronale durante lo sviluppo del cervello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, una volta padroneggiata, fornisce un metodo rapido ed efficace per identificare immunologicamente i difetti morfologici in specifiche regioni del cervello adulto.

Questa procedura può essere difficile da imparare, perché la rimozione dell'esoscheletro dalla testa della mosca può richiedere molta cura e pratica. I tuoi movimenti devono essere lenti e deliberati e le braccia del dissettore devono essere ben supportate per rimanere ferme. È una buona idea esercitarsi sulle mosche con gli occhi rossi e poi sulle mosche dagli occhi bianchi prima di sezionare effettivamente i genotipi di interesse per gli esperimenti reali.

Per prepararsi alla dissezione, posizionare le mosche anestetizzate di interesse su un cuscinetto di metallo freddo o in una capsula di Petri seduta sul ghiaccio. In alternativa, utilizzare un cuscinetto antimosche che emette anidride carbonica. Quindi, posiziona una piccola quantità di PTN al centro della capsula di dissezione per creare una bolla di PTN.

Quindi, sotto uno stereomicroscopio, riempire il campo visivo con la bolla PTN in condizioni di illuminazione uniforme. Ora, manipola le mosche in modo che siano a pancia in su e trasferiscine una dall'addome nel PTN. Immergere completamente l'animale nel PTN ed eseguire l'intera dissezione immersa nel PTN.

Con un secondo paio di pinze, afferrare la proboscide e staccare la testa dal corpo. Occasionalmente, la proboscide verrà rimossa, ma la testa rimarrà attaccata al corpo. In tal caso, afferrare il bordo mediale di una retina e applicare una forza laterale per rimuovere la testa.

Scartare l'addome e il torace. È fondamentale mantenere la testa nel PTN durante questa fase. Le connessioni dal cervello centrale al VNC chiaramente non possono essere analizzate con questo metodo.

Quindi, afferra il bordo mediale della retina sinistra sul bordo del foro centrale nella cuticola e allontana lentamente le pinze direttamente l'una dall'altra per evitare la lacerazione del lobo ottico, che è la struttura opaca ricoperta da trachea bianca e filamentosa. Man mano che la retina si dissocia, ci sarà una leggera diminuzione della tensione. Al fine di evitare che il cervello si strappi, è di fondamentale importanza afferrare il bordo mediale di ciascun occhio e separare molto lentamente le pinze.

Muoversi troppo velocemente può causare un'alterazione della morfologia cerebrale o danni al tessuto cerebrale. Come mostrato qui, afferra la cuticola con ogni paio di pinze e tirale molto lentamente in direzioni opposte. Se fatto correttamente, la cuticola dovrebbe separarsi dal tessuto cerebrale, lasciando intatto il cervello.

Per questo passaggio sono necessarie pinze molto affilate. Quindi, rimuovere con cura la cuticola circostante pezzo per pezzo. Durante la rimozione della cuticola ostinatamente attaccata, può aiutare a fissare il cervello afferrando il VNC rimanente per evitare di schiacciare il cervello.

Infine, utilizzare una pipetta P200 per trasferire i cervelli sezionati in un pozzetto di una piastra riempita con PTN per la fissazione e l'immunocolorazione. Al microscopio, utilizzare una pipetta P200 per trasferire da 10 a 15 cervelli sezionati dello stesso genotipo in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri riempita con paraformaldeide al 4% diluita in PTN. Quindi, incubare il cervello per 20 minuti con un lento dondolio a temperatura ambiente.

Dopo la fissazione, lasciare che il cervello si depositi sul fondo del tubo, quindi rimuovere il fissativo. Successivamente, eseguire due lavaggi rapidi con 500 microlitri di PTN per lavaggio. Scambia il PTN non appena il cervello si deposita nel tubo.

Successivamente, eseguire tre lunghi lavaggi con PTN agitando delicatamente a temperatura ambiente. Dopo questi lavaggi, il cervello può essere conservato durante la notte a quattro gradi Celsius in PTN. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio con PTN, incubare il cervello in 0,5 millilitri di soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente e con una leggera agitazione.

Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi primari diluiti nella soluzione bloccante e incubare il cervello a quattro gradi Celsius per due giorni con una leggera agitazione. Rimuovere l'anticorpo primario utilizzando il regime di lavaggio PTN a cinque lavaggi. E poi, applicare gli anticorpi secondari.

Lasciare che questi anticorpi incubino con i tessuti per tre ore a temperatura ambiente mentre sono protetti dalla luce con l'oscillazione. Dopo aver incubato il cervello nella soluzione di anticorpi secondari, applicare il regime di lavaggio PTN. Coprire i campioni con un foglio dopo ogni lavaggio e terminare rimuovendo quanto più tampone possibile.

Quindi, aggiungere 75 microlitri di terreno di montaggio fluorescente anti-sbiadimento e far scorrere il cervello e il terreno dentro e fuori dalla punta della pipetta una sola volta. Il tubo può quindi essere avvolto in un foglio di alluminio e conservato a quattro gradi Celsius per diversi giorni, ma idealmente procedere direttamente con il montaggio. Per montare i cervelli, costruisci uno scivolo a ponte.

Posizionare due vetrini copri base a circa 1 centimetro di distanza l'uno dall'altro su un carrello caricato positivamente. Assicurarsi che il lato caricato positivamente sia rivolto verso l'alto. Quindi, far aderire i vetrini coprioggetto al vetrino con lo smalto per unghie e lasciare asciugare completamente lo smalto prima di procedere.

Quindi, posizionare il vetrino sotto uno stereomicroscopio e pipettare il cervello e il terreno nello spazio tra i vetrini. Assicurati di regolare l'illuminazione per migliorare la visualizzazione del cervello. Quindi, aspirare il supporto di montaggio extra dal vetrino, facendo attenzione a evitare il cervello.

Quindi, rimuovere il supporto di montaggio in eccesso rimanente. Ciò consentirà di posizionare il cervello in modo più preciso. Ora, usando il forcipe, orienta i cervelli in uno schema a griglia, con i lobi antennali rivolti verso l'alto.

Quindi, posiziona un vetrino coprioggetti sul cervello e usa lo smalto per unghie per sigillare i bordi del vetrino coprioggetto superiore che sono attaccati ai vetrini coprioggetto di base. A questo punto, caricare la cavità centrale con il nuovo supporto di montaggio in senso gocciolato, consentendo di aspirare il supporto sotto il vetrino coprioggetto per azione capillare. Quando la cavità è riempita, sigillarla completamente con uno smalto trasparente.

Il metodo descritto può essere utilizzato per visualizzare quasi tutte le strutture all'interno del cervello adulto, compresi i corpi dei funghi. Questa regione del cervello è necessaria per l'apprendimento e la memoria. I corpi dei funghi possono essere facilmente visualizzati utilizzando anticorpi che riconoscono la proteina della fascicolina 2.

Questa proteina è altamente espressa nei lobi alfa e beta, così come nel corpo ellissoide situato centralmente. Questa tecnica ha permesso l'identificazione di molteplici processi cellulari necessari per la corretta guida assonale dei neuroni del corpo dei funghi. L'interruzione di questi processi causa una vasta gamma di fenotipi mutanti, come la proiezione inappropriata degli assoni nella regione della linea mediana del cervello e la mancanza di lobi alfa.

Questi fenotipi mutanti sono spesso non completamente penetranti e, pertanto, richiedono l'esame di più cervelli. Al fine di esaminare il ruolo autonomo di una proteina nella ricerca del percorso degli assoni, la tecnica di Markham può anche essere utilizzata per visualizzare le decisioni di guida degli assoni di singoli neuroni mutanti positivi alla GFP o wild-type in uno sfondo wild-type non fluorescente. Il metodo qui descritto consente la visualizzazione affidabile e riproducibile di praticamente la regione del cervello adulto di Drosophila.

Qui, ci siamo concentrati sui neuroni del corpo a fungo. Nella versione testuale di questo protocollo, abbiamo anche dimostrato la visualizzazione dei lobi ottici. Altri studi hanno utilizzato tecniche simili per visualizzare la pars intercerebralis, i neuroni dell'orologio e i neuroni di proiezione del lobo antennale, tra molti altri.

Una volta padroneggiato, ogni cervello può essere sezionato in 3-5 minuti, se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di stabilizzare le braccia vicino al microscopio. È anche importante muoversi lentamente e rimuovere piccoli pezzi di cuticola uno alla volta.

Muoversi troppo rapidamente potrebbe causare danni indesiderati al tessuto cerebrale sottostante. Oltre a utilizzare cervelli sezionati per esperimenti di microscopia basati sull'immunofluorescenza, il tessuto cerebrale può essere utilizzato anche per ulteriori esperimenti.