Name: Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Impara la dissezione e la macchiatura immunofluorescente del cervello adulto di Drosophila melanogaster per studiare i neuroni del corpo di fungo e i fotoricettori. Questo metodo consente di analizzare la connettività neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare Changhui Pak e Alysia Vrailas Mortimer per inizialmente insegnamento SMK la tecnica di dissezione del cervello. Ringraziamo anche i membri del gruppo di Ken Moberg lab, soprattutto Chris turni, per leggere criticamente il manoscritto. Anticorpi che riconoscono Fas2 (1 4) e chaoptin (24B10) sono stati ottenuti da Developmental Studies Hybridoma Bank. Anticorpo 24B10 è stato depositato per il DSHB da Seymour Benzer e Nansi Colley24,60,61, anticorpo 1 4 è stato depositato per il DSHB da Corey Goodman 22,23,56. Stock di volare sono stati ottenuti dal centro di Stock di Bloomington. Desideriamo anche ringraziare l'Ohio Agricultural Research e Development Center (OARDC) Classifica MCIC Imaging Center per l'utilizzo del microscopio confocale all'immagine i cervelli in figura 4A e B. SMK è sostenuta da una sovvenzione NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il metodo di dissezione e visualizzazione sopra descritto può essere utilizzato in un'ampia varietà di immunostaining e vive applicazioni di imaging. Ci hanno delineato un protocollo di immunostaining generale e hanno messo in evidenza un modo in cui MARCM può essere utilizzato per visualizzare axonal morfologia dei neuroni individuali del corpo del fungo. Inoltre, queste procedure generali possono essere utilizzate anche per altre regioni del cervello in fissa di imaging o adulto appena dissecata cervelli48,65. Formazione immagine diretta può fornire un approccio più efficiente quando si analizzano i modelli di espressione di enhancer trap, geni reporter o MiMIC linee66, ad esempio. Per evitare che cattura artefatti dalla morte delle cellule durante la formazione immagine diretta di GFP in tessuto unfixed, cervelli dovrebbero essere sezionati in 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) o HL3 media48, montati su slitte di ponte in 1X PBS (o HL3) e fotografati in meno di 15-20 min cura Occorre inoltre di rimuovere tanto trachea come possibile dal cervello dissecato prima di formazione immagine, poiché può interferire con la visualizzazione della fluorescenza di GFP.
Mentre colorazione condizioni per valutare la morfologia dei neuroni del fotoricettore e corpo del fungo sono relativamente ben consolidata24,61,67, la localizzazione di una proteina specifica di interesse in queste cellule tipi possono richiedere ottimizzazione e risoluzione dei problemi completa. In particolare, diversi passaggi critici, tra cui la diluizione dell'anticorpo, blocco buffer componente concentrazione e la fissazione, dovrebbero essere ottimizzati per generare risultati più riproducibili e affidabili. In primo luogo, deve essere determinata la concentrazione ottimale di anticorpo primario. Anche se commercialmente disponibili anticorpi hanno spesso una diluizione consigliata (e spesso inizialmente iniziamo utilizzando quella concentrazione), questi valori sono raramente determinati empiricamente sui tessuti della drosofila . Di conseguenza, testare una serie di diluizioni di anticorpo primario che gamma sopra e sotto suggerimento iniziale del produttore spesso si traduce in colorazione più specifica. Mentre la diluizione di anticorpo primario può avere un effetto significativo sulla macchiatura di precisione e deve essere determinata con precisione, i cervelli di tempo vengono incubati in anticorpo primario contenente soluzioni possono variare notevolmente con scarso effetto sul risultato complessivo. Ad esempio, abbiamo osservato risultati simili quando incubando sezionati cervelli con l'anticorpo primario di anticorpo Fas2 per due, tre o anche quattro giorni a 4 ° C. Anche se si consiglia di almeno due notti, abbiamo anche incubate cervelli in soluzione di anticorpo primario per una sola notte e ottenuto macchiatura riproducibile. D'importanza, limitando la quantità di tempo cervelli sono incubati nell'anticorpo secondario a 3 h a temperatura ambiente (o una notte a 4 ° C) aiuta il legame non specifico limite di anticorpi secondari al tessuto cerebrale.
In secondo luogo, può essere necessario utilizzare altri reagenti "blocchi" per eliminare il segnale di fondo indesiderato. Le opzioni includono l'aumento della concentrazione di NGS a ~ 10%, l'aggiunta di 1-10% dell'albumina di siero bovino (BSA) per le soluzioni Anticorpo bloccante sia primario e secondario, o pre-adsorbimento di anticorpi primari durante la notte a 4 ° C con embrioni della drosofila (Vedi riferimento68, punto 2.9, passaggio 3).
Mentre abbiamo scritto il protocollo sopra utilizzando PTN del buffer suggerito per tutti i fissazione, lavaggio e fasi di incubazione dell'anticorpo, fissazione del tessuto in altri buffer (ad esempio PLP e PEM, elencati nella Tabella materiali) può provocare profonde differenze in potenza del segnale. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che la ciclina E è inosservabile in dischi immaginali larvale quando i tessuti sono stati corretti nel tradizionale paraformaldeide 4%, diluito in PBS, ma è chiaramente visibile quando i tessuti sono stati corretti nel buffer di PLP (Ken Moberg, personali comunicazione e riferimento69). Oltre alle modifiche nel buffer componenti, alterare il tempo e la temperatura per il fissaggio del tessuto possa anche significativamente influenzare immunofluorescente macchiatura e può essere determinate empiricamente se necessario. In generale, tempo di fissazione deve essere sufficientemente lungo per consentire sufficiente reticolazione delle componenti cellulari e manutenzione a lungo termine della morfologia cellulare globale pur essendo limitato abbastanza per impedire over-reticolazione e "seppellire" degli epitopi della proteina. Pertanto, quando inizialmente ottimizzazione delle condizioni di colorazione per un anticorpo primario appena acquisita, di solito limitare il tempo di fissazione a circa 20 min e spesso risolvono i tessuti alle temperature più fredde.
Diversi controlli dovrebbero essere incluso in qualsiasi esperimento di immunofluorescenza per studiare la specificità degli anticorpi primari e secondari così come l'effetto di transgeni/genetico sul fenotipo osservato. Per accertare se l'anticorpo primario utilizzato specificamente riconosce la proteina d'interesse, tessuto da mosche carenti questa proteina e/o tessuto che overexpressing la proteina dovrebbe essere incluso come controlli. L'aggiunta di proteine in eccesso di antigene purificato può anche essere incluso per determinare se l'anticorpo primario riconosce altri epitopi nel cervello volo. Infine, qualsiasi segnale fluorescente presente quando gli anticorpi primari vengono omessi rappresenta il livello di legame non specifico dagli anticorpi secondari selezionati.
Diversi controlli importanti dovrebbero essere inclusi anche per valutare il contributo del background genetico o la presenza di transgeni per intensità di colorazione o morfologia neuronale. Ad esempio, le mosche utilizzate nell'esperimento MARCM nella Figura 5 contengono transgeni multipli (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, vasca &#62; GAL80 e OK107-GAL4), ognuno dei quali dovrebbe essere analizzato separatamente per gli effetti sulla morfologia del corpo del fungo. A una morfologia molto minimo, fungo corpo di mosche che contiene OK107-GAL4 sia UAS-CD8-GFP dovrebbero essere analizzati. Può anche essere necessario valutare l'effetto di scossa di calore e produzione ricombinasi Flp sullo sviluppo del corpo del fungo analizzando Vola contenente sia hsFLP e FRT82B. Anche se MARCM può fornire la comprensione significativa in se una data proteina controlla autonomamente axonal di orientamento, il numero di controlli necessari per rendere con precisione questa conclusione può essere un limite minore di questa tecnica. Meno complicati esperimenti, controlli simili sono altresì applicabili. Ad esempio, prendere un esperimento dove il sistema GAL4/UAS viene utilizzato in combinazione con un transgene di RNAi per atterramento espressione di una proteina di interesse in tutti i neuroni. In questo esperimento, almeno due transgeni sarà presente: un pan-neuronale GAL4 driver, ad esempio di Elav-GAL4 e il transgene UAS-RNAi . La morfologia dei neuroni del corpo del fungo in mosche contenenti ciascuno di questi transgeni da solo dovrebbe essere studiata oltre alla condizione sperimentale dove mosche harbor sia transgeni al volo stesso.
Infine, per determinare se la proteina di interesse è espresso nei neuroni di corpo del fungo è solitamente necessario cervelli co-macchia con gli anticorpi al Fas2. In alternativa, le proteine fluorescenti come GFP, RFP o la membrana associato CD8-GFP possono anche essere espressa utilizzando il sistema GAL4/UAS e utilizzato in combinazione con anticorpi che riconoscono la proteina di interesse. Poiché Fas2 riconosce solo gli assoni scanditi che formano i lobi α e β del corpo del fungo, l'uso di GAL4-driven, membrana-limita CD8-GFP è stato particolarmente utile per la marcatura di neuroni del corpo del fungo.
Difetti di axonal guida spesso non sono 100% con liquidi penetranti e anche cervello dello stesso genotipo potrebbe mostrare qualche variabilità. Pertanto, quando l'analisi appena generato alleli mutanti per difetti nel corpo del fungo o path-finding del fotoricettore, dovrebbe essere utilizzata una combinazione di alleli differenti e approcci. Maggior parte degli studi nella letteratura utilizzare vari metodi per indagare se una proteina svolge un ruolo delle cellule-autonoma nel controllo Guida assonale: i) analisi di pathfinding difetti in omozigoti mosche null (preferibilmente utilizzando diversi nugli alleli ll), ii) analisi di pathfinding difetti nelle mosche manca la proteina di interesse solo in neuroni (di solito tramite RNAi), iii) analisi MARCM dei difetti di path-finding e iv) esperimenti dove il gene è riespresso nei neuroni null omozigotica di salvataggio mosche. Idealmente, dovrebbero essere analizzati diversi dozzina cervelli al genotipo per difetti nella morfologia neuronale.
Sebbene il protocollo qui descritto si concentra principalmente su immunofluorescente localizzazione delle proteine all'interno del tessuto fisso, diverse applicazioni future di questa tecnica sono state sviluppate immagine dal vivo al tessuto di cervello. Una volta cervelli vengono sezionati (solitamente in terreno di coltura delle cellule), quindi possono essere coltivate per diversi giorni a 25 ° C. Questi metodi di coltura ex vivo stanno sviluppandi per studiare una vasta gamma di processi biologici, quali attività di proteina che promuove la rigenerazione assonale dopo lesione70,71, intracellulare segnalazione dinamica72e lo sviluppo neuronale73.

Anche se il sistema nervoso di Drosophila è inferiore a quello degli esseri umani e roditori, la sua complessità fornisce un modello potente, socievole per comprendere meglio i suoi omologhi dei vertebrati. In molti casi, i genomi di vertebrati e mosche codificano proteine molto simili che dettano i meccanismi di sviluppo del sistema nervoso. Infatti, molti dei geni necessari per lo sviluppo neuronale nei vertebrati sono ortologhi in mosche, compresi quelli coinvolti in vie di segnalazione che controllo patterning, neurogenesi e orientamento axonal1,2,3 ,4,5. Ad esempio, netrina è un ligando necessario per una guida assonale in mammiferi e d. melanogaster6,7,8. Mentre netrina era originariamente isolato da pulcino embrionali cervello tessuto6, studi successivi hanno rivelato che netrina svolge un ruolo conservato durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) in Drosophila8. Altri studi hanno utilizzato schermi genetici nell'embrionale della drosofila CNS per identificare conservati ligandi e recettori necessari per path-finding in Drosophila e vertebrati9.
Mentre la Mosca embrionale CNS è stata utilizzata ampiamente in passato per identificare ligandi, i recettori e proteine di segnalazione intracellulare necessarie per orientamento axonal8,9, lavoro recente ha studiato i modi in cui molte delle Queste proteine controllano anche decisioni di path-finding durante le fasi successive di sviluppo. In particolare, indagine del corpo del fungo (MB) e sviluppo di neurone dei fotorecettori retinici (Figura 1) ha fornito la comprensione nei meccanismi che path-finding controllo, formazione della sinapsi, potatura dell'assone e molti altri aspetti di un neurone sviluppo10,11,12,13,14,15,16,17. I neuroni del fotoricettore connettersi retina Vola in regioni del cervello adulto chiamato lamina e midollo e sono critico per l'inoltro di informazioni visive al cervello (Recensito da18,19), mentre i neuroni del corpo del fungo sono centralmente situato nel cervello volo e sono necessari per apprendimento e memoria20,21. Sia i neuroni del fotoricettore e i neuroni intrinseci dei corpi del fungo, chiamati cellule di Kenyon, utilizzano meccanismi di evolutivamente conservati Consiglio axonal diffusibile e contatto-dipendente per trovare loro obiettivi post-sinaptiche. Oltre ad essere visibile in mosche adulte, del fotoricettore e MB neuroni possono anche essere direttamente visualizzati in larve e pupe con anticorpi o geni reporter22,23,24,25. La possibilità di visualizzare facilmente questi due insiemi di neuroni in diversi momenti dello sviluppo ha promosso il loro uso come modelli superbe per molti aspetti dello sviluppo neuronale.
Oltre ad essere utilizzato come un modello per capire i meccanismi dello sviluppo normale del sistema nervoso, studi recenti hanno dimostrato che le mosche possono anche servire come modelli accurati di un'ampia varietà di malattie umane, compreso la sindrome di X Fragile (FXS)26 , Disabilità intellettuale (ID)27,28,29,30,31e gli altri32. Ad esempio, per studiare la funzione molecolare di ZC3H14, un gene recentemente collegato alla disabilità intellettuale umano, abbiamo creato un modello fly di ID utilizzando un allele nullo della Mosca dell'ortologo di ZC3H14, chiamato Nab230. Manca Nab2 mosche hanno memoria gravi menomazioni ed estesa code di poli (a), ricapitolare quello che si osserva in pazienti umani o paziente derivato cellula linee33,34. D'importanza, mosche carente Nab2 anche visualizzare severa del cervello morfologia difetti nei loro corpi fungo adulto34, simile a ciò che si osserva nelle mosche privi del gene di sindrome FXS, FMR135. Così, mosche possono servire come un importante organismo modello per studiare lo sviluppo normale del cervello e malattie che interrompono.
Infine, l'accessibilità dei metodi ad alto rendimento per monitorare il comportamento, combinato con la vasta gamma di strumenti genetici disponibili, rendono Drosophila organismo modello di scelta per l'identificazione di regioni del cervello che controllano i comportamenti complessi, come apprendimento e memoria, sonno, corteggiamento, sete e altri36,37,38,39. Uno strumento particolarmente utile che è al centro di «strumenti» di un genetista volare è il sistema GAL4/UAS (Figura 2). Questo sistema40,41 utilizza espressione specifica del tessuto dell'attivatore trascrizionale Gal4 per aumentare l'espressione di geni o transgeni a valle di una sequenza di attivazione a Monte (UAS). Le modifiche di questo sistema hanno permesso che i ricercatori, ad esempio, controllare con precisione l'eccitabilità dei neuroni specifici42,43, iperesprimere o colpo specifici geni di interesse44, 45, l'analisi del calcio in tempo reale dinamica nel vivo46ed esprimere geni reporter per contrassegnare un neurone lignaggi41. La combinazione del sistema GAL4/UAS con ricombinazione mitotica anche permesso la creazione di analisi del mosaico con un indicatore di cella reprensibile (MARCM) sistema12,47. MARCM è stato usato estesamente nell'analisi di singoli neuroni per identificare i componenti di segnalazione cellulari necessari per orientamento axonal12,47. Anche se queste e altre tecniche hanno fornito un numero di preziose informazioni sui meccanismi cellulari necessari per il funzionamento del sistema nervoso, la maggior parte richiedono che il cervello di Drosophila in primo luogo essere sezionato; rimozione accurata del cervello è necessario per mantenere corrette cervello modelli di morfologia e connessione tra regioni del cervello. Il seguente protocollo utilizza fungo neuroni del fotoricettore e corpo comepopolazioni neuronali di esempio come si guida l'utente attraverso la dissezione e cervello di Drosophila immunofluorescenza colorazione dell'adulto.

<table><tbody><tr><td>Pinze/pinzette per microdissezione</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Sylgard</td><td>Sistemi viventi Strumentazione</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Disponibile presso amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antibody</td><td>Aves Laboratorio</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 capra anti-topo anticorpo secondario</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 capra anti-pollo anticorpo secondario</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 capra anti-topo anticorpo secondario</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldeide</td><td>Microscopio elettronico Servizi</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Vetrini</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na fosfato Tampone monobasico</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na fosfato Tampone bibasico</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>smalto per unghie</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscopio</td><td>Leica S6D con sorgente</td><td></td><td></td>luminosa a LED KL300</tr><tr><td>piatto a 9 pozzetti (piastra spot)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutatore/bilanciere</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 o 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>piatto da 35 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Potenziali tamponi di fissaggio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0,1 M NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, tipicamente compongono 0,5 L di tampone NaPhosphate 0,1 M e aliquote 50 ml alla volta secondo necessità tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>PLP</td><td>2% paraformaldeide, 0,01 M NaI04, 0,075 M Lisina, 0,037 M NaPO4, pH 7,2, Sciogliere 0,36 g di lisina in 10 ml di H2O + 7,5 ml 0,1 M NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M Na2HPO4 su ghiaccio. Immediatamente prima dell'uso, mescolare 15 ml di questa soluzione di lisina tamponata con 50 mg di NaIO4 (periodato di sodio) + 2 ml di paraformaldeide di alta qualità (EMS) al 20% + 3 ml di tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>H2O PEM</td><td>0,1 M TUBI pH 7,0, 2 mM MgS04, 1 mM EGTA, Questo tampone può essere convenientemente preparato come 2x stock e diluito con l'8% di paraformaldeide (PFA) per ottenere una concentrazione finale del 4% di PFA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly Stock disponibili da Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Driver GAL4 pan-neuronale</td></tr><tr><td>w*;;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>driver GAL4 per tutti i neuroni del corpo a fungo (l'inserzione di OK107-GAL4 è sul 4° cromosoma)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>driver GAL4 per i lobi alfa e beta (sul 2° cromosoma)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>driver GAL4 per i lobi alfa e beta, contiene anche UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>Driver GAL4 principalmente per i lobi gamma del corpo del fungo (sul 2° cromosoma)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>Driver GAL4 per lobi gamma del corpo del fungo, contiene anche UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM stock, contiene il sito FRT e GAL80 sul 2° cromosoma</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM stock, contiene hsFLP, GAL4 pan-neuronale e CD8-GFP sul cromosoma X</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>Stock MARCM per il flipping del 3° cromosoma</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Tub>GAL80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>calcio MARCM per il flipping del 2° cromosoma</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>Calcio MARCM per il flipping del cromosoma X</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP marca la superficie cellulare (CD8 è una proteina transmembrana)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM stock, contiene il sito FRT e CD8-GFP sul 2° cromosoma</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM stock, contiene hsFLP e CD8-GFP sul cromosoma X</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM stock, contiene il sito FRT e GAL80 sul 2° cromosoma</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM stock, contiene il sito FRT e GAL80 sul 3° cromosoma</td></tr></tbody></table>

dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto drosophila melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Sviluppo del sistema nervoso comporta una serie sequenziale di eventi che sono coordinati da diverse vie di segnalazione e reti di regolazione. Molte delle proteine coinvolte in queste vie sono evolutivamente conservate tra mammiferi e altri eucarioti, come moscerino della frutta Drosophila melanogaster, suggerendo l'esistano di principi organizzativi simili durante lo sviluppo di questi organismi. D'importanza, Drosophila è stato usato estesamente per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano processi che sono necessari nei mammiferi, compresa la neurogenesi, differenziazione, orientamento assonale e sinaptogenesi. Mosche sono anche stati utilizzati con successo per modellare una varietà di malattie umane neurodevelopmental. Qui descriviamo un protocollo per la microdissezione passo dopo passo, fissazione e immunofluorescente localizzazione delle proteine all'interno del cervello di Drosophila adulto. Questo protocollo si concentra su due popolazioni neuronali di esempio, i neuroni del corpo del fungo e fotorecettori retinici e include passaggi facoltativi per la traccia di neuroni individuali corpo fungo usando analisi di mosaico con una tecnica di reprensibile Cell Marker (MARCM). Dati di esempio da cervelli wild-type e mutanti sono mostrati insieme con una breve descrizione di un criterio di punteggio per orientamento axonal difetti. Mentre questo protocollo mette in evidenza due anticorpi ben consolidati per indagare la morfologia del corpo del fungo e i neuroni del fotoricettore, altre regioni del cervello di Drosophila e la localizzazione delle proteine all'interno di altre regioni del cervello può anche essere studiato usando questo protocollo.

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di dissezione del cervello di Drosophila è ottenere cervelli integri da moscerini adulti che possono essere utilizzati in una vasta gamma di applicazioni, come l'immunofluorescenza, la localizzazione di proteine marcate con GFP e esperimenti di coltura ex-vivo. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia dello sviluppo e delle neuroscienze, come il ruolo di proteine specifiche e delle vie di segnalazione, e l'individuazione dei modelli di connettività neuronale durante lo sviluppo del cervello. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, una volta padroneggiata, fornisce un metodo rapido ed efficace per identificare immunologicamente difetti morfologici in regioni specifiche del cervello adulto.Questa procedura può essere difficile da apprendere, poiché rimuovere l'esoscheletro dalla testa della mosca richiede molta attenzione e pratica. I movimenti devono essere lenti e precisi, e le braccia del dissezionatore devono essere ben supportate per mantenere la stabilità. È consigliabile esercitarsi prima su mosche dagli occhi rossi e successivamente su mosche dagli occhi bianchi, prima di procedere effettivamente alla dissezione di genotipi di interesse per esperimenti reali.Per prepararsi alla dissezione, posizionare le mosche d'interesse anestetizzate su un supporto metallico freddo o in una piastra di Petri posta sul ghiaccio. In alternativa, utilizzare un supporto per mosche che emetta anidride carbonica. Successivamente, collocare una piccola quantità di PTN al centro della piastra per dissezioni, creando una bolla di PTN.Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, riempire il campo visivo con la bolla di PTN sotto un'illuminazione uniforme. Ora, manipolare i moscerini in modo che si trovino a pancia in su e trasferirne uno per l'addome nel PTN. Immergere completamente l'animale nel PTN ed eseguire l'intera dissezione completamente immersi nel PTN.Con una seconda coppia di pinzette, afferrare il rostro e staccare la testa dal corpo. A volte il rostro viene rimosso, ma la testa rimane attaccata al corpo. In tal caso, afferrare il margine mediale di una retina ed esercitare una forza laterale per rimuovere la testa.Scartare l'addome e il torace. È fondamentale mantenere la testa nel PTN durante questo passaggio. Le connessioni dal cervello centrale alla corda nervosa ventrale non possono essere analizzate chiaramente mediante questo metodo.Successivamente, afferrare il margine mediale della retina sinistra al bordo del foro centrale nella cuticola e tirare lentamente le pinzette direttamente in direzioni opposte per evitare lo strappo del lobo ottico, che è la struttura opaca ricoperta da trachee bianche e filamentose. Mentre la retina si dissocia, si verificherà una leggera diminuzione della tensione. Per evitare che il cervello si laceri, è fondamentale afferrare il margine mediale di ciascun occhio e separare molto lentamente le pinzette.Un movimento troppo rapido può provocare alterazioni nella morfologia cerebrale o danni al tessuto cerebrale. Come mostrato qui, afferrare la cuticola con ciascuna coppia di pinzette e tirare molto lentamente in direzioni opposte. Se eseguito correttamente, la cuticola si dovrebbe separare dal tessuto cerebrale, lasciando il cervello intatto.Sono necessarie pinzette molto affilate per questo passaggio. Successivamente, rimuovere con attenzione il cuticolo circostante pezzo per pezzo. Durante la rimozione del cuticolo fortemente aderente, può essere utile fissare il cervello afferrando il VNC rimanente per evitare di schiacciarlo.Infine, utilizzare una pipetta P200 per trasferire i cervelli dissettati in una pozzetta di una piastra riempita con PTN per la fissazione e l'immunomarcatura. Al microscopio, utilizzare una pipetta P200 per trasferire da 10 a 15 cervelli dissettati dello stesso genotipo in un tubo microcentrifuga da 0,5 millilitri riempito con paraformaldeide al 4% diluita in PTN. Successivamente, incubare i cervelli per 20 minuti con movimento lento oscillante a temperatura ambiente.Dopo la fissazione, lasciare depositare i cervelli sul fondo del tubo, quindi rimuovere il fissativo. Successivamente, eseguire due lavaggi rapidi con 500 microlitri di PTN per ogni lavaggio. Cambiare il PTN non appena i cervelli si sono depositati nel tubo.Successivamente, eseguire tre lavaggi lunghi con PTN utilizzando un'agitazione delicata a temperatura ambiente. Dopo questi lavaggi, i cervelli possono essere conservati tutta la notte a quattro gradi Celsius in PTN. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio con PTN, incubare i cervelli in 0,5 millilitri di soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente, con agitazione delicata.Dopo aver rimosso la soluzione di blocco, aggiungere gli anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco e incubare i cervelli a quattro gradi Celsius per due giorni con agitazione delicata. Rimuovere l'anticorpo primario utilizzando il protocollo di lavaggio PTN con cinque lavaggi. Quindi, applicare gli anticorpi secondari.Lasciare incubare questi anticorpi con i tessuti per tre ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce e con agitazione. Dopo l'incubazione dei cervelli nella soluzione di anticorpo secondario, applicare la serie di lavaggi con PTN. Coprire i campioni con pellicola d'alluminio dopo ogni lavaggio ed eseguire un'aspirazione finale per rimuovere il più possibile il tampone.Successivamente, aggiungere 75 microlitri di mezzo di montaggio antiossidante fluorescente e aspirare e rilasciare i cervelli e il mezzo all'interno della punta della pipetta una sola volta. Il tubo può quindi essere avvolto nella pellicola di alluminio e conservato a quattro gradi Celsius per diversi giorni, ma idealmente procedere immediatamente con il montaggio. Per montare i cervelli, costruire un vetrino a ponte.Posizionare due coprioggetti di base a circa 1 centimetro di distanza su un vetrino carico positivamente. Assicurarsi che il lato con carica positiva sia rivolto verso l'alto. Successivamente, fissare i coprioggetti al vetrino con smalto per unghie e lasciare asciugare completamente lo smalto prima di proseguire.Successivamente, posizionare il vetrino sotto un microscopio stereoscopico ed eseguire la pipettaggio dei cervelli e del mezzo nello spazio tra i coprioggetti. Accertarsi di regolare l'illuminazione per migliorare la visualizzazione dei cervelli. Successivamente, aspirare il mezzo di montaggio in eccesso dal vetrino, avendo cura di non danneggiare i cervelli.Quindi, asportare con una stecca l'eccesso rimanente di mezzo di montaggio. Questo permetterà di posizionare i cervelli con maggiore precisione. Ora, utilizzando pinzette, disporre i cervelli in un modello a griglia, con i loro lobi antennali rivolti verso l'alto.Quindi, posizionare un coprioggetto sui cervelli e utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i bordi del coprioggetto superiore che sono uniti ai coprioggetti di base. Ora, caricare la cavità centrale con un mezzo di montaggio fresco, aggiungendolo goccia a goccia in modo che il mezzo venga aspirato sotto il coprioggetto per azione capillare. Quando la cavità è piena, sigillarla completamente utilizzando dello smalto trasparente per unghie.Il metodo descritto può essere utilizzato per visualizzare quasi ogni struttura all'interno del cervello adulto, inclusi i corpi fungiformi. Questa regione del cervello è necessaria per l'apprendimento e la memoria. I corpi fungiformi possono essere facilmente visualizzati utilizzando anticorpi che riconoscono la proteina fasciculina 2.Questa proteina è fortemente espressa nei lobi alfa e beta, nonché nel corpo ellissoide situato in posizione centrale. Questa tecnica ha permesso l'identificazione di numerosi processi cellulari necessari per un corretto indirizzamento degli assoni dei neuroni del corpo peduncolato. L'alterazione di questi processi provoca una serie diversificata di fenotipi mutanti, come la proiezione inappropriata degli assoni attraverso la regione mediana del cervello e l'assenza dei lobi alfa.Questi fenotipi mutanti sono spesso incompletamente penetranti e, pertanto, richiedono l'esame di più cervelli. Per esaminare il ruolo autonomo di una proteina nella navigazione assiale, la tecnica di Markham può essere utilizzata anche per visualizzare le decisioni di guida degli assoni di singoli neuroni mutanti o di tipo selvaggio positivi per GFP in un contesto di tipo selvaggio non fluorescente. Il metodo descritto qui consente la visualizzazione affidabile e riproducibile di praticamente qualsiasi regione del cervello adulto di Drosophila.In questo studio, ci siamo concentrati sui neuroni del corpo peduncolato. Nella versione testuale di questo protocollo, abbiamo inoltre dimostrato la visualizzazione dei lobi ottici. Altri studi hanno utilizzato tecniche simili per visualizzare la pars intercerebralis, i neuroni orologio e i neuroni proiettivi del lobo antennale, tra molti altri.Una volta acquisita padronanza, ogni cervello può essere dissezionato in 3-5 minuti, se l'operazione viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di stabilizzare le braccia vicino al microscopio. È inoltre fondamentale muoversi lentamente e rimuovere piccoli frammenti di cuticola uno alla volta.Un movimento troppo rapido potrebbe causare danni indesiderati al tessuto cerebrale sottostante. Oltre all'utilizzo di cervelli dissezionati per esperimenti di microscopia basati sull'immunofluorescenza, il tessuto cerebrale può essere impiegato anche per ulteriori esperimenti.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo articolo mostriamo come di sezionare il sistema nervoso centrale da terze larve instar Drosophila.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

Questo video descrive un metodo per montare cervelli intatti da mosche adulte sotto un scivolo da ponte e mostra il protocollo eseguito su cervelli immunocolorati per la microscopia fluorescente.

Montaggio di cervelli di Drosophila adulta: un metodo per preparare vetrini per l'imaging confocale

Questo video descrive come sezionare e isolare il cervello adulto di Drosophila, una procedura necessaria per visualizzare l'organo, che altrimenti è oscurato dalla cuticola, dall'occhio e dal tessuto tracheale. Il protocollo di esempio mostra una dimostrazione dettagliata che produce preparati di alta qualità che possono essere utilizzati per l'immunocolorazione e i metodi di imaging nella neurobiologia della Drosophila.

drosofila Dissezione cerebrale adulta: un metodo nella neurobiologia delle mosche

Questo video dimostra un protocollo dettagliato di immunocolorazione per visualizzare i difetti fenotipici nei corpi dei funghi dei cervelli mutanti di Drosophila. Il protocollo prevede l'utilizzo di anticorpi contro Fas2, una proteina coinvolta nella guida assonale che facilita il corretto sviluppo morfologico e funzionale del corpo del fungo.

Visualizzazione dei neuroni del corpo a fungo nel cervello di Drosophila tramite immunocolorazione

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

L'adulto Drosophila cervello è un sistema utile per studiare circuiti neuronali, le funzioni cerebrali superiori, e malattie complesse. Un metodo efficace per sezionare intero tessuto cerebrale dalla testa piccola mosca faciliterà gli studi del cervello-based. Qui si descrive un semplice, one-step protocollo dissezione del cervello adulto con ben conservato morfologia.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Qui, forniamo protocolli per eseguire tre semplici saggi di degenerazione degli assoni indotta da lesioni (morte assonale) in Drosophila melanogaster per valutare la conservazione morfologica e funzionale degli assoni recisi e delle loro sinapsi.

Valutazione morfologica e funzionale degli assoni e delle loro sinapsi durante la morte di Axon in Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive tre fasi per preparare i lobi ottici larvali e adulti di Drosophila per l'imaging: 1) dissezioni cerebrali, 2) immunoistochimica e 3) montaggio. L'accento è posto sul passaggio 3, poiché sono necessari orientamenti di montaggio distinti per visualizzare specifiche strutture del lobo ottico.

dissezione, immunoistochimica e montaggio di cervelli larvali e adulti di Drosophila per la visualizzazione del lobo ottico

Questo studio presenta un protocollo semplificato per l'elaborazione dei tessuti che coinvolge la decapitazione, la fissazione, la criosezione, la colorazione a fluorescenza, l'immunocolorazione e l'imaging, che può essere esteso all'imaging confocale e multifotonico. Il metodo mantiene un'efficacia paragonabile alle dissezioni complesse, bypassando la necessità di capacità motorie avanzate. L'analisi quantitativa delle immagini offre un ampio potenziale di indagine.

Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Impara la dissezione e la macchiatura immunofluorescente del cervello adulto di Drosophila melanogaster per studiare i neuroni del corpo di fungo e i fotoricettori. Questo metodo consente di analizzare la connettività neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Esplora altri video