Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare librerie di piccole molecole per agenti che promuovono la differenziazione astrogliale nelle cellule staminali del glioblastoma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali tumorali, come ad esempio quali sono le vie di segnalazione necessarie per mantenere le cellule staminali del glioblastoma nello stato indifferenziato. La corretta esecuzione di questa tecnica consente l'identificazione diretta di piccole molecole che promuovono la differenziazione delle cellule staminali del glioblastoma.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per il glioblastoma di Ehlers-Danlos perché la riduzione della percentuale di cellule staminali del glioblastoma può diminuire la probabilità di recidiva. Questo metodo può essere applicato anche per impostare la differenziazione in altre linee cellulari utilizzando altri costrutti reporter. Il nostro rapporto è il primo a stabilire un approccio ad alto rendimento per lo screening degli agenti che costringono le cellule staminali del glioma a differenziarsi.

Lavorare con particelle di lentivirus nelle cellule tumorali derivate dai pazienti può essere estremamente pericoloso. Pertanto, è necessario seguire sempre la procedura standard per lavorare con agenti patogeni trasmessi per via ematica. Per iniziare, semina un milione di cellule staminali di glioblastoma o GSC in due millilitri di terreno di crescita completo di cellule staminali neurali in una piastra a sei pozzetti.

Successivamente, trasdurre le cellule con il lentivirus reporter ad una molteplicità di infezioni pari a cinque. Alla miscela di cellule e virus, aggiungere due microlitri di polibrene in modo che la concentrazione finale sia di otto microgrammi per millilitro e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 durante la notte. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno di coltura per rimuovere il virus non legato.

E centrifugare le celle a 360 volte G per cinque minuti. Quindi aspirare con cura il terreno e riposizionare le cellule in una piastra a sei pozzetti. E continuare a incubare le cellule per 24 ore.

Raccogliere 0,5 millilitri del volume totale di coltura. Celle a pellet per centrifugazione a 360 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in un terreno di crescita di cellule staminali neurali fresche da 0,5 millilitri.

Riposizionare la piastra nell'incubatrice per consentire l'espansione per almeno 72 ore. Aggiungere 200 microlitri di reagente di dissociazione e incubare per cinque minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Dissociare le cellule picchiettando su e giù delicatamente.

Alle cellule dissociate aggiungere 800 microlitri di HBSS per garantire un attacco o un'aggregazione cellulare minima. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Determinare la percentuale di cellule che esprimono la proteina fluorescente verde mediante citometria a flusso.

Registrare almeno 10.000 cellule vitali in ogni acquisizione. In tutte le analisi citofluorimetriche, utilizzare cellule parentali non trasdotte o cellule non fluorescenti trasdotte da vettori per stabilire la fluorescenza di base. Per selezionare ed espandere i singoli subcloni, seminare cellule a una densità di 0,7 cellule per pozzetto in 100 microlitri di terreno di cellule staminali neurali in una piastra a 96 pozzetti.

Mantenere questi cloni in coltura per 11 giorni. Fai attenzione alle neurosfere con un diametro superiore a 100 micron. Abbiamo precedentemente stabilito questa dimensione limite per determinare retrospettivamente se la neuorsfera è stata originata da una cellula staminale di glioblastoma auto-rinnovante.

Questa dimensione di cutoff potrebbe richiedere un'ottimizzazione quando si lavora con diversi modelli di cellule di glioblastoma. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza dotato di filtro FITC e contrassegnare i pozzetti che contengono una singola neurosfera in cui circa l'1-5% delle cellule è positivo alla GFP. Dopo la marcatura, espandere i singoli cloni fino a quando non è disponibile un numero sufficiente di cellule per l'analisi della citometria a flusso.

Supponendo che i cloni reporter contengano dall'1% al 5% di cellule GFP-positive, raccogliere 0,5 millilitri da ciascun clone insieme a una quantità uguale di cellule di controllo non trasdotte per determinare l'esatta percentuale di cellule GFP-positive. Dopo aver pellettato le celle a 360 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante. Aggiungere 200 microlitri di reagente di dissociazione a ciascun pellet e incubare le provette in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, triturare le cellule circa 20-30 volte per ottenere una sospensione di una singola cellula. Quindi aggiungere 800 microlitri di HBSS per garantire un attacco o un'aggregazione cellulare minima. Trasferire ora 200 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a 96 multipozzetti.

Infine, eseguire la citometria a flusso, registrando almeno 10.000 cellule vitali in ogni acquisizione. Per valutare la capacità clonogenica, preparare sospensioni di singole cellule di subcloni reporter di differenziazione triturando le cellule circa 20-30 volte. Quindi piastra queste cellule in 100 microlitri di terreno di crescita completo di cellule staminali neurali a una densità di circa 5-500 cellule per pozzetto in piastre da 96 multipozzetti.

Mantenere queste cellule in coltura per 9-11 giorni. Cerca le neurosfere al microscopio ottico. Un pozzetto contenente almeno una singola grande neurosfera è considerato positivo.

Considerando le cellule parentali non trasdotte e le cellule trasdotte dal lentivirus GFP-positive come controlli, inserire i pozzetti totali analizzati e il numero di cellule positive sull'interfaccia online ELDA. Per iniziare lo screening, piastra 5000 cellule in 99 microlitri di terreno di crescita completo di cellule staminali neurali in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, con un pipettatore a 12 canali, trattare le cellule con due micromolari di concentrazione finale di composti di libreria diluiti o con il controllo DMSO.

Incubare le cellule per 72 ore. Ora aggiungere 150 microlitri di reagente di dissociazione cellulare utilizzando un pipettatore a 12 canali in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi triturare delicatamente le cellule in ciascun pozzetto circa 20-30 volte utilizzando un pipettatore a 12 canali fino a ottenere una sospensione di una singola cellula.

Ora esegui la citometria a flusso e determina la percentuale di cellule che esprimono il reporter GFAP:GFP. Per prima cosa determinare la dimensione e la vitalità delle cellule dagli scatter in avanti e lateralmente e bloccare la popolazione di cellule vitali. Quindi determinare le cellule GFP-positive all'interno della popolazione cellulare vitale.

Un aumento della percentuale di cellule GFP-positive di tre deviazioni standard rispetto ai controlli è considerato un risultato positivo che può essere regolato per soddisfare le preferenze di rigore dell'utente. Vengono mostrate immagini rappresentative dei subcloni HSR-GBM1 GSC che esprimono livelli bassi e alti di GFAP:GFP. I subcloni positivi per l'espressione di GFAP:GFP sono stati selezionati mediante citometria a flusso per la linea della neurosfera derivata dal paziente.

Qui, GFAP:GFP bassa indica che meno del 5% delle cellule del clone sono GFP-positive, mentre GFAP:GFP alta indica che più del 75% delle cellule del clone sono GFP-positive. Questi risultati mostrano che la capacità di auto-rinnovamento in vitro dei subcloni GFAP-low è superiore a quella delle loro controparti GFAP-high come determinato da ELDA. Pertanto, i subcloni GH sono più differenziati dei sottocloni GL.

Infine, sono state esaminate librerie di farmaci per identificare agenti in grado di indurre la differenziazione astrogliale nelle GSC. È stato riscontrato che 12 farmaci aumentano significativamente la percentuale di cellule che esprimono il reporter GFAP:GFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche settimane se eseguita correttamente.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il saggio alamarBlue, il saggio clonogenico in terreni semisolidi, l'iniezione di xenografo sul fianco o intracranica per rispondere a ulteriori domande come l'effetto di farmaci selettivi sulla proliferazione cellulare e la clonogenicità in vitro e la tumorigenicità in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i composti in grado di indurre la differenziazione astrogliale nelle cellule staminali del glioblastoma.