Name: Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per lidentificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri un protocollo di screening per identificare piccole molecole che promuovono la differenziazione astrogliale nelle cellule staminali di glioblastoma. Questo metodo utilizza un reporter di differenziazione con eGFP.

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Nota: Astroglial e sistemi reporter lentivirus neuronale sono stati acquistati come preparazioni lentivirali pre-confezionati, concentrati. Conoscenza di base della tecnica di citometria a flusso è necessaria. Inoltre, per un utilizzo completo del presente protocollo, l'utente dovrà raggiungere un citometro a flusso con capacità di throughput elevato (accetta piastre da 96 pozzetti come origine di esempio).
1. sistema lentivirali trascrizionale Reporter
Nota: In tutte le analisi cytometric di flusso, utilizzare cellule parentali, trasdotte, o trasdotte vettoriale (non fluorescente) per stabilire la fluorescenza della linea di base. Inoltre, si noti che in tutte le fasi cui triturazione meccanica viene chiamato per, essere gentile. Triturazione duro può uccidere un numero significativo dell'artigiano fragile e influenzare i risultati di citometria a flusso.
<ol><li>1 x 106 cellule in 2 mL di mezzo di sviluppo completo delle cellule staminali neurali in un piatto 6-pozzetti della piastra.</li>
	<li>Trasducono cellule aggiungendo reporter lentivirus ad una molteplicità di infezione (moi) pari a 5.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di polybrene per una concentrazione finale di 8 µ g/mL.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 per una notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, sostituire crescita medio per rimuovere virus non associato. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 e incubare per 24 h.</li>
	<li>Vendemmia 0,5 mL di volume totale; rotazione verso il basso le cellule a 360 x g per 5 min a temperatura ambiente in una provetta conica da 15 mL ed eliminare il surnatante tramite aspirazione. Aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura fresco delle cellule staminali neurali per le celle rimanenti e restituire la piastra nell'incubatore per l'espansione continua.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di reagente di dissociazione e incubare per 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Dissociare le cellule pipettando delicatamente su e giù. Nota: Triturazione duro può provocare significative uccisione di artigiano, dissociazione completa è realizzata solitamente dopo 20 - 30 volte.</li>
	<li>Per minimizzare il collegamento delle cellule o aggregazione, aggiungere 800 µ l di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) per un volume finale di 1 mL.</li>
	<li>Trasferire 200 µ l di ogni sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Per questa procedura, è necessario utilizzare un citometro a flusso da banco con piastra a 96 pozzetti capacità equipaggiato con un laser blu per l'eccitazione e con la capacità di rilevare la proteina fluorescente verde. Eseguire analisi cytometric di flusso con almeno 10.000 cellule vitali per ogni acquisizione.</li>
	<li>Determinare la percentuale di cellule GFP-positive tramite flusso cytometry.</li>
</ol>2. subclone selezione, espansione e convalida
<ol><li>Cellule di piastra in 100 µ l di terreno di cellule staminali neurali ad una densità di 0,7 cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Cultura cloni per 11 giorni a 37 ° C e 5% CO2. Questo passaggio è altamente dipendente dal tipo di cellula e richiederà probabilmente una regolazione basata sulla linea cellulare utilizzata. Come regola generale, una sfera di diametro ≥ 100 µm è una buona indicazione della presenza di clonogenic artigiano nel neurosfere.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtro FITC, contrassegnare i pozzetti che contengono un singolo neurosphere dove ~ 1-5% delle cellule sono GFP-positivi. Nota: Nel determinare che la percentuale esatta delle cellule GFP-positive non è troppo critica a questo punto. Ciascuno dei subcloni sarà successivamente valutata tramite flusso cytometry. Questa operazione viene eseguita per ridurre il totale numero di cloni da analizzare con l'accento sulla neurosfere che provengono da indifferenziato, GFAP-negativo, GSC.</li>
	<li>Espandere reporter selezionati cloni fino a quando ci sono un numero sufficiente di cellule per l'analisi di citometria a flusso. Un sub-confluente pozzetto di una piastra 6-pozzetti contenenti ≤ 1, 5x105 cellule/mL dovrebbe fornire un numero sufficiente di cellule. Nota: Una procedura dettagliata per l'isolamento e l'espansione di artigiano è disponibili 17.</li>
</ol>3. determinazione dell'espressione di GFAP:GFP tramite flusso Cytometry
<ol><li>Raccogliere un'aliquota di cellule (0,5 mL) da ogni reporter clone e non trasdotte controlli per determinare l'esatta percentuale di cellule GFP-positive. Considerando cloni di reporter che contengono cellule GFP-positive ~ 1-5%.</li>
	<li>Spin di cellule a 360 x g per 5 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante tramite aspirazione.</li>
	<li>Per ogni pallina, aggiungere 200 µ l di reagente di dissociazione delle cellule e incubare le provette in un bagnetto ad acqua settato a 37 ° C.</li>
	<li>Triturare le cellule delicatamente per ottenere una sospensione di singola cellula (di solito tra 20-30 volte).</li>
	<li>Per minimizzare il collegamento delle cellule o aggregazione, è possibile aggiungere 800 µ l HBSS ad un volume finale di 1 mL.</li>
	<li>Trasferire 200 µ l per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da ogni sospensione cellulare.</li>
	<li>Per questa procedura, è necessario utilizzare un citometro a flusso da banco con piastra a 96 pozzetti capacità. Eseguire analisi cytometric di flusso con almeno 10.000 cellule vitali per ogni acquisizione.</li>
</ol>4. ELDA Self-Renewal test per valutare la capacità clonogenica
Nota: Per i controlli, sia dei genitori, non trasdotte, nonché che esprimono GFP cellule trasdotte lentivirus, deve essere utilizzato per determinare il potenziale relativo clonogenic delle linee GSC differenziazione reporter alle culture GSC originale da cui sono stati derivati.
<ol><li>Dissociare subcloni differenziazione-reporter in sospensioni unicellulari, come descritto in precedenza.</li>
	<li>Cellule di piastra a 96 pozzetti piastre in 100 µ l di media di sviluppo completo delle cellule staminali neurali alle densità delle cellule comprese tra 5 e 500 cellule per pozzetto.</li>
	<li>Incubare le cellule per 9 a 11 giorni a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Punteggio ottenuto pozzetti positivi di visualizzazione diretta di neurosfere sotto un microscopio chiaro. Un pozzo dovrebbe essere considerato "positivo" se contiene almeno un singolo grande neurosphere.</li>
	<li>Inserire i dati: totale pozzi analizzati e il numero di pozzetti positivi usando l'interfaccia di ELDA online disponibile a http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.</li>
</ol>5. droga biblioteca diluizione preparazione
<ol><li>Rimuovere le piastre libreria da conservazione a-80 ° C, coprire con carta stagnola (proteggere composti sensibili alla luce). Scongelare per circa 30 minuti a un'ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta multicanale a 12 canali per diluire i composti di libreria da 0,2 mM in mezzo completa delle cellule staminali neurali. DMSO diluita al 10% in crescita medio Nota: La concentrazione finale di DMSO dovrebbe essere 0,1% quando aggiunto alle cellule. Una maggiore concentrazione di DMSO nella cultura può provocare la tossicità. Per questo motivo, si consiglia di testare la sensibilità a DMSO nella linea cellulare utilizzata, prima del trattamento.</li>
	<li>Utilizzare DMSO come controllo del veicolo per il trattamento di cellule che si trovano nelle colonne sinistra e destra di ciascuna piastra (colonne 1 e 12; Pozzi A attraverso H).</li>
	<li>Coprire le piastre libreria diluito con carta stagnola e restituire le tavole originali di biblioteca nel congelatore a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>6. drug Screen
Nota: Le cellule trattate DMSO dovrebbero essere utilizzate per impostare la fluorescenza della linea di base e regolare gating.
<ol><li>Piastra 5x103 celle in una piastra a 96 pozzetti in 99 µ l di terreno di coltura delle cellule staminali neurali completa.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale a 12 canali, trattare le cellule con composti di libreria diluito ad una concentrazione finale di 2 µM (1 µ l di droga di 0,2 mM in 99 µ l di sospensione cellulare) o con DMSO (controllo). Incubare le piastre per 72 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale a 12 canali aggiungere 150 µ l di reagente di dissociazione delle cellule in ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C.</li>
	<li>Dissociare le cellule mediante triturazione delicatamente con una pipetta multicanale a 12 canali fino a sospensione unicellulare è raggiunto (solitamente fra 20-30 volte). La quantità di tempo che è necessario dissociare completamente neurosfere varierà tra linee di GSC. Mentre il reagente di dissociazione di cella consigliati (Vedi materiali) è sicuro e incubazione fino a 45 minuti non ha avuto effetto sulla vitalità in più righe di GSC testati, verificare per ogni linea di GSC per essere impiegato per lo screening. Nota: Il volume finale in ogni bene dovrebbe essere all'incirca 250 µ l (100 µ l di sospensione cellulare + 150 µ l di reagente di dissociazione delle cellule).</li>
	<li>Determinare la percentuale di cellule che esprimono il reporter GFAP:GFP tramite flusso cytometry. Utilizzare la strategia di gating standard. In primo luogo, tracciare gli spargimenti in avanti e laterali per ottenere un senso generale della dimensione delle cellule e della fattibilità. Poi posto un cancello sulla popolazione di singole cellule vitale. Questa è la popolazione per i quali sarà determinata fluorescenza verde (eGFP). Ogni composto che determini un aumento della percentuale di GFP-positive cellule da oltre tre deviazioni standard sopra controllo (DMSO-trattati) è considerato come un segnale positivo "hit". Questa soglia deve essere regolata secondo l'applicazione specifica e al rigore desiderato. Nota: Per il throughput elevato schermo è consigliabile utilizzando un singolo subclone reporter GSC. A seguito di identificazione di colpo, ogni colpo deve essere convalidato contro ulteriori reporter subcloni della stessa linea di GSC. Per aumentare la fiducia per veri successi è anche consiglia di test composti contro reporter subcloni isolato da neurosfere GSC diverse linee.</li>
</ol>

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<li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma%3A+a+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
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<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li>
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<li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mentre la maggior parte degli studi precedenti di artigiano focalizzata principalmente sui marcatori che li definiscono, in questo studio abbiamo deciso di adottare l'approccio inverso. Ci concentriamo principalmente sulla progenie differenziate generate da artigiano (per esempio, le cellule che esprimono astroglial e marcatori neuronali). Qui dimostriamo l'utilizzazione di un sistema, che è basato sulla espressione umana del promotore-dipendente GFAP di GFP di screening di stupefacenti basati su celle a resa elevata. Tu...

Recenti studi hanno dimostrato che i tumori contengono una piccola popolazione di cellule, chiamate cellule staminali tumorali (CSC) o cellule d'inizio del tumore, che sono responsabili della progressione del tumore, metastasi e resistenza alla chemio - e radio-terapie 1, 2. la presenza di cellule staminali tumorali e loro progenie differenziate all'interno dei tumori è considerata un fattore importante promuovere eterogeneità intratumorale e rappresenta quindi una transenna importante nel trattamento di tumori3. Gerarchia delle cellule di tumore, fornita dalla teoria di cellule staminali del cancro, ha ispirato lo sviluppo di nuove strategie per trattare tumori 4. Un approccio per mirare alle cellule staminali tumorali è di identificare e inibire le vie di segnalazione che sono noti per essere richiesto durante lo sviluppo embrionale dell'organo colpito. Infatti, noi ed altri abbiamo precedentemente pubblicato più documenti che descrivono il requisito in corso di cellule staminali-pertinenti segnalazione percorsi neurali Sonic Hedgehog e Notch in glioblastoma5,6,7. Questo lavoro ha aiutato a solidificarsi la spiegazione razionale per parecchi test clinici di GBM. Un secondo approccio per mirare alle cellule staminali tumorali è quello di promuovere la loro differenziazione. Questo approccio ha ricevuto un sacco di supporto dovuto i risultati favorevoli da studi preclinici e clinici nel trattamento della leucemia promyelocytic acuta con l'acido retinoico (ATRA, un analogo della vitamina A). Qui ATRA è stato trovato per rimuovere il blocco di maturazione e promuovere il cancro cellula differenziazione8. Più recentemente, Piccirillo e colleghi hanno elegantemente dimostrato che BMP-4 promuove la differenziazione di GSC in astrocytes con anti-GBM significativi effetti in vitro e in vivo9.
Il razionale per lo studio corrente si basa su un approccio di "ingegneria inversa" per il targeting artigiano. Data l'eterogeneità di vasto presente nel GBM e con scarsa differenziazione essendo uno dei tratti distintivi del cancro, abbiamo chiesto se ci potrebbe promuovere un fenotipo più favorevole - differenziazione in uno stato simil-astrociti. Qui, non abbiamo conoscenza preventiva delle vie di segnalazione che mantenere artigiano in un esemplare del tumore determinato ma piuttosto mirare a raggiungere un fenotipo desiderato (ad es. positività GFAP).
Questo rapporto descrive le procedure utilizzate per stabilire GSC differenziazione reporter-linee dalla trasduzione delle culture GSC-arricchita per selezione clonale GSC. Le linee di glioblastoma neurosphere utilizzate sono state stabilite al laboratorio del Professor Angelo Vescovi da pazienti con una diagnosi di glioblastoma primario presso l'ospedale San Raffaele - Milano, Italia. Queste linee sono state studiate estesamente in diverse pubblicazioni 6,10,11,12,13,14. È altamente raccomandato che gli individui che sono interessati a implementare queste tecniche nel loro laboratorio di determinano la rilevanza del reporter per capacità di auto-rinnovamento delle cellule staminali del cancro nelle cellule hanno in programma di studiare (questo è vero per qualsiasi giornalista). Un protocollo dettagliato per uno dell'analisi in vitro clonogenic accettate nel campo è fornito per compire questo15,16. Infine, un protocollo dettagliato che descrive l'utilizzo delle differenziazione reporter-linee in uno schermo di droga di citometria a flusso basato è fornito alla fine. Di nota, allo stesso modo per il sistema di differenziazione astroglial descritto qui, abbiamo con successo stabilito e convalidato linee reporter GSC l'integrazione di un reporter di MAP2:GFP (differenziamento neuronale). Pertanto, le metodologie di descrivere in questa carta può essere applicata per studiare la differenziazione cellulare in varie linee cellulari.
Alcune delle figure in questo rapporto può essere trovato in una recente pubblicazione: "Atracurium Besylate e altri agenti di blocco neuromuscolare promuovere il differenziamento astrogliale e impoveriscono glioblastoma cellule staminali18.

<table><tbody><tr><td>ESGRO Complete Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SF006</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Soluzione salina bilanciata di Hank)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)</td><td>SBI (System Biosciences)</td><td>SR10015VA-1</td><td></td></tr><tr><td>Reagente monouso sterile da 50 ml serbatoi</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T25 cm&sup2; Pallone Ventilato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T75 cm&sup2; Flask Vented</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale Ovation, 12 canali, 0,5 - 20uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale Ovation, 12 canali, 5-250uL</td><td>VistaLab Tecnologie</td><td>1060-0250</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette multiplo a 12 canali 25 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-1002</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette multi a 12 canali 250 &mu; l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-9025</td><td></td></tr><tr><td>Guava easyCyte 5HT Citometro a flusso da banco</td><td>EMD Millipore</td><td>0500-4005</td><td></td></tr><tr><td>NIH Collezioni cliniche 1 e 2 librerie di piccole molecole</td><td>Evotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Per la preparazione di terreni di cellule staminali neurali (500 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentrazione finale</td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBio.com</td><td>A-421-250</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>DMEM/F12 10X</td><td>Corning</td><td>90-091-PB</td><td>1X</td></tr><tr><td>sale sodico di eparina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich H3149</td><td>0,0002%</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4036</td><td>5,4 mM</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td>1X</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td>14,5 mM</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) 100X</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1X</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>16 nM</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>4.8 &; M</td></tr><tr><td>Basic FGF (FGF2), Human</td><td>GoldBio</td><td>1140-02-50</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF, Human</td><td>GoldBio</td><td>1150-04-100</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Filtro per flaconi, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>Utilizzare per filtrare i terreni sterilizzati</td></tr></tbody></table>

farmaco a base di citometria a flusso sistema di screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di glioblastoma

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune e più letali negli adulti, provocando circa 14.000 morti ogni anno nei soli Stati Uniti. La sopravvivenza mediana dopo la diagnosi è meno di 15 mesi con massima chemioterapia chirurgico di resezione, radioterapia e temozolomide. Le sfide inerenti lo sviluppo di trattamenti più efficaci di GBM sono diventati sempre più chiare e includono la sua invasività inflessibile, la resistenza ai trattamenti standard, sua complessità genetica e molecolare adattabilità e sottopopolazioni di GBM cellule con somiglianze fenotipiche delle cellule staminali normali, riferito come le cellule staminali di glioblastoma (artigiano). Perché artigiano è necessari per la progressione e la crescita del tumore, terapia a base di differenziazione rappresenta una modalità di trattamento vitale per questi neoplasma incurabile.
Il seguente protocollo descrive un insieme di procedure per stabilire un throughput elevato piattaforma, finalizzato all'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione di GSC astroglial di screening. Il nucleo del sistema è un reporter-costrutto di differenziazione di proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Il protocollo contiene le procedure generali seguenti: (1) stabilire GSC differenziazione reporter linee; (2) test/convalida la rilevanza del reporter alla capacità di auto-rinnovamento/clonogenic GSC; e lo screening di stupefacenti basato di citometria a flusso ad alta capacità (3).
La piattaforma di screening fornisce un approccio semplice e poco costoso per identificare piccole molecole che promuovono la differenziazione di artigiano. Inoltre, l'utilizzo di librerie di farmaci approvati dalla FDA possiede il potenziale per l'identificazione degli agenti che possono essere riutilizzati più rapidamente. Inoltre, terapie che promuovono la differenziazione delle cellule staminali del cancro devono lavorare in sinergia con le terapie "standard di cura" che sono state indicate per mirare ed eliminare soprattutto più cellule di cancro differenziato.

Tre linee indipendenti neurosfere paziente-derivati sono state trasdotte con il reporter di astroglial lentivirus codifica per una proteina fluorescente verde (GFP) fusa in-frame con una cassetta di resistenza zeocina e guidati dall'elemento promotore umano GFAP ( Figura 1). Prossimi singoli cloni sono stati isolati da placcatura 0,7 cellule per pozzetto in un piatto ben 96 (Figura 2), seguita dalla determinazione di cytometric d...

Un protocollo di screening efficiente è presentato per l'identificazione di piccole molecole che promuovono astroglial differenziazione in cellule staminali di glioblastoma (artigiano). Il dosaggio è basato su un reporter di differenziazione di cellule staminali per cui l'espressione della GFP avanzata (eGFP) è guidato da promotore umano di GFAP.

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

L'obiettivo generale di questa procedura è lo screening di librerie di piccole molecole per identificare agenti che promuovano la differenziazione astrogliale nelle cellule staminali del glioblastoma. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali tumorali, ad esempio quali vie di segnalazione siano necessarie per mantenere le cellule staminali del glioblastoma in uno stato indifferenziato. Un'esecuzione corretta di questa tecnica consente l'identificazione diretta di piccole molecole in grado di indurre la differenziazione delle cellule staminali del glioblastoma.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per l’Ehlers-Danlos e il glioblastoma, poiché la riduzione della percentuale di cellule staminali del glioblastoma potrebbe diminuire la probabilità di recidiva. Questo metodo può essere applicato anche per indirizzare la differenziazione verso altre linee cellulari utilizzando altri costrutti reporter. La nostra relazione è la prima a stabilire un approccio ad alto rendimento per selezionare agenti in grado di forzare la differenziazione delle cellule staminali del glioma.Il lavoro con particelle di lentivirus in cellule tumorali derivate da pazienti può essere estremamente pericoloso. Pertanto, è sempre necessario seguire le procedure standard per la manipolazione di agenti patogeni trasmessi con il sangue. Per iniziare, seminare un milione di cellule staminali di glioblastoma o GSCs in due millilitri di mezzo di crescita completo per cellule staminali neurali in una piastra a sei pozzetti.Successivamente, trasdurre le cellule con il lentivirus reporter a una multiplicità di infezione pari a cinque. Alla miscela di cellule e virus, aggiungere due microlitri di polibrene in modo che la concentrazione finale sia di otto microgrammi per millilitro e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per tutta la notte. Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo di crescita per rimuovere il virus non legato.E centrifugare le cellule a 360 volte G per cinque minuti. Quindi aspirare con attenzione il mezzo e seminare nuovamente le cellule in una piastra a sei pozzetti. E continuare l'incubazione delle cellule per 24 ore.Raccogliere 0,5 millilitri del volume totale della coltura. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 360 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 0,5 millilitri di mezzo di crescita fresco per cellule staminali neurali.Riposizionare la piastra nell'incubatore per consentire l'espansione per almeno 72 ore. Aggiungere 200 microlitri di reagente di dissociazione e incubare per cinque minuti in un bagno termico regolato a 37 gradi Celsius. Dissociare le cellule pipettando delicatamente su e giù.Aggiungere alle cellule dissociate 800 microlitri di HBSS per garantire un minimo di adesione o aggregazione cellulare. Successivamente, trasferire 200 microlitri di ciascuna sospensione cellulare in pozzetti di una piastra multipozzetto da 96. Determinare la percentuale di cellule che esprimono la proteina fluorescente verde mediante citometria a flusso.Registrare almeno 10.000 cellule vitali per ogni acquisizione. In tutti gli analisi citofluorimetrici, utilizzare cellule parentali non trasdotte o cellule trasdotte con vettore non fluorescenti per stabilire il livello di fluorescenza di base. Per selezionare ed espandere singole sottocloni, seminare le cellule a una densità di 0,7 cellule per pozzetto in 100 microlitri di mezzo per cellule staminali neurali in una piastra a 96 pozzetti.Mantenere queste linee cellulari in coltura per 11 giorni. Prestare attenzione a neurosfere con un diametro superiore a 100 micron. In precedenti studi abbiamo stabilito questa soglia dimensionale per determinare in modo retrospettivo se la neurosfera fosse originata da una cellula staminale di glioblastoma con capacità di autorinnovamento.Questa dimensione di cutoff potrebbe richiedere un'ottimizzazione quando si utilizzano diversi modelli cellulari di glioblastoma. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza dotato di filtro FITC e segnare le pozzette che contengono un singolo neurosfera in cui circa dall'1% al 5% delle cellule risultano positive per GFP. Dopo la marcatura, espandere singole linee cellulari fino a ottenere un numero sufficiente di cellule per l'analisi mediante citometria a flusso.Supponendo che le linee cellulari reporter contengano dall'1% al 5% di cellule GFP-positive, raccogliere 0,5 millilitri da ciascuna linea insieme a una quantità equivalente di cellule di controllo non transdotte per determinare la percentuale esatta di cellule GFP-positive. Dopo aver centrifugato le cellule a 360 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare il soprannatante. Aggiungere 200 microlitri di reagente di dissociazione a ciascun pellet e incubare i tubi in un bagnomaria impostato a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, triturare le cellule circa 20-30 volte per ottenere una sospensione di singole cellule. Aggiungere quindi 800 microlitri di HBSS per garantire un minimo di adesione o aggregazione cellulare. Trasferire ora 200 microlitri di ciascuna sospensione cellulare in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.Infine, eseguire la citometria a flusso, registrando almeno 10.000 cellule vitali per ogni acquisizione. Per valutare la capacità clonogenica, preparare sospensioni cellulari singole di sottocloni del reporter di differenziamento triturando le cellule circa da 20 a 30 volte. Successivamente, seminare queste cellule in 100 microlitri di mezzo completo per la crescita di cellule staminali neurali a una densità di circa da cinque a 500 cellule per pozzetto in piastre multipozzetto da 96.Mantenere queste cellule in coltura per nove a undici giorni. Cercare neurosfere al microscopio ottico. Un pozzetto contenente almeno una singola neurosfera di grandi dimensioni è considerato positivo.Considerando le cellule parentali non trasdotte e le cellule trasdotte con lentivirus GFP-positivo come controlli, inserire nell'interfaccia online ELDA il numero totale di pozzetti analizzati e il numero di cellule positive. Per iniziare lo screening, seminare 5000 cellule in 99 microlitri di mezzo di crescita completo per cellule staminali neurali in una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, utilizzando un pipettatore a 12 canali, trattare le cellule con una concentrazione finale di due micromoli dei composti della libreria diluiti o con il controllo DMSO.Incubare le cellule per 72 ore. Aggiungere ora 150 microlitri di reagente di dissociazione cellulare utilizzando un pipettatore a 12 canali in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, triturare delicatamente le cellule in ogni pozzetto circa da 20 a 30 volte utilizzando un pipettatore a 12 canali fino a ottenere una sospensione monocellulare.Eseguire ora la citometria a flusso e determinare la percentuale di cellule che esprimono il reporter GFAP:GFP. Determinare innanzitutto le dimensioni cellulari e la vitalità in base agli scatter anteriore e laterale e selezionare la popolazione di cellule vitali. Successivamente, determinare le cellule GFP-positive all'interno della popolazione di cellule vitali.Un aumento della percentuale di cellule GFP-positive di tre deviazioni standard rispetto ai controlli è considerato un risultato positivo, che può essere adattato in base alle preferenze dell'utente riguardo alla stringenza. Vengono mostrate immagini rappresentative di subcloni di GSC HSR-GBM1 che esprimono livelli bassi e alti di GFAP:GFP. I subcloni positivi per l'espressione di GFAP:GFP sono stati selezionati mediante citometria a flusso per la linea di neurosfere derivate da paziente.Qui, un basso rapporto GFAP:GFP indica che meno del 5% delle cellule nel clone è positivo per GFP, mentre un alto rapporto GFAP:GFP indica che più del 75% delle cellule nel clone è positivo per GFP. Questi risultati mostrano che la capacità di autorinnovamento in vitro dei sottocloni GFAP-basso è maggiore rispetto ai corrispondenti sottocloni GFAP-alto, come determinato mediante ELDA. Pertanto, i sottocloni GH sono più differenziati rispetto ai sottocloni GL.Infine, sono state analizzate librerie di farmaci per identificare agenti in grado di indurre la differenziazione astrogliale nelle GSC. Sono stati identificati 12 farmaci che aumentano significativamente la percentuale di cellule che esprimono il reporter GFAP:GFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in poche settimane se eseguita correttamente.Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il saggio alamarBlue, il saggio di clonogenicità in mezzi semisolidi, l'iniezione di xenotrapianto in sede laterale o intracranica, al fine di rispondere ad ulteriori domande, come l'effetto di farmaci selettivi sulla proliferazione cellulare e sulla clonogenicità in vitro e sulla tumorigenicità in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare composti in grado di indurre la differenziazione astrogliale nelle cellule staminali del glioblastoma.

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Questo protocollo video dimostra l'applicazione del colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) per l'identificazione e la separazione di differenti sottopopolazioni di cellule di glioblastoma umano basati sulla frequenza di divisione cellulare.

Identificazione e isolamento di Slow-divisione delle cellule nel glioblastoma umano per mezzo di Carboxy fluoresceina succinimidile Ester (CFSE)

Questo video mostra una tecnica per generare una linea reporter di cellule staminali di glioblastoma per identificare la differenziazione delle cellule staminali di glioblastoma (GSC) in astroglia. Delinea i passaggi coinvolti nella semina delle GSC, nella loro trasduzione con un lentivirus che codifica per GFP e nella determinazione dell'espressione del reporter GFP attraverso la citometria a flusso.

Un sistema reporter trascrizionale lentivirale per generare una linea reporter di differenziazione delle cellule staminali del glioblastoma

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Identificare nuovi bersagli farmacologici che passano dai test preclinici agli studi sull'uomo è una priorità scientifica. A tal fine, qui descriviamo un approccio di genomica funzionale per esaminare l'impatto della deplezione genica sugli sferoidi delle linee cellulari tumorali, che modellano in modo più appropriato i tumori umani in vivo.

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati ​​da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

Qui, descriviamo le tecniche di imaging di cellule vive per misurare quantitativamente la migrazione e l'invasione delle cellule staminali tumorali di glioblastoma del cervello nel corso del tempo e sotto condizioni multiple di trattamento.

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l'analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza e l'imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l'identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo...

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

Qui, stabiliamo una piattaforma di profilazione metabolica che integra gliomi sferoidi tridimensionali (3D) e normalizzazione basata sull'imaging tramite analisi del flusso extracellulare. Questo approccio consente una valutazione più accurata delle risposte metaboliche dei tumori ai trattamenti farmacologici e fornisce informazioni sui potenziali meccanismi di resistenza.

Progressi nella profilazione metabolica degli sferoidi tridimensionali dei tumori cerebrali per lo screening dei farmaci

Presentiamo un modello di migrazione del glioblastoma 3D utilizzando gliomasfere magnetiche derivate dal paziente generate da tumori appena diagnosticati e ricorrenti. Questa piattaforma consente la visualizzazione delle dinamiche migratorie specifiche del paziente e la valutazione dell'efficacia terapeutica. Il saggio può essere multiplexato dopo la migrazione per valutare la localizzazione e i modelli di espressione delle proteine.

Test riproducibile di migrazione del glioblastoma 3D con localizzazione sferoide mediata da nanoparticelle magnetiche in condizioni ipossiche

Scopri un protocollo di screening per identificare piccole molecole che promuovono la differenziazione astrogliale nelle cellule staminali di glioblastoma. Questo metodo utilizza un reporter di differenziazione con eGFP.

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per lidentificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma (Video) | JoVE Journal

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

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