Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono l'induzione di malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale o del SNC mediante il trasferimento adottivo di cellule T specifiche per l'acquaporina 4 e il monitoraggio degli effetti risultanti sul SNC e sul sistema visivo dinamico. Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave riguardanti il ruolo dell'acquaporina 4, comunemente nota come AQP4, delle cellule T specifiche nella neuromielite ottica e in altri disturbi visivi infiammatori. Il vantaggio principale della tomografia a coerenza ottica è la capacità di eseguire il monitoraggio longitudinale della lesione retinica in modo non invasivo.

A dimostrare la procedura saranno Sharon Sagan, un ricercatore associato nel mio laboratorio, e Andreas Cruz Harans, un membro del RE Greens Laboratory. Inizia collegando un rubinetto di arresto in nylon a tre vie con due connessioni Luer lock maschio a una siringa Luer lock in vetro senza lo stantuffo. Spostare la leva del rubinetto verso la siringa per chiudere il rubinetto e posizionare la siringa con l'estremità aperta rivolta verso l'alto.

Dopo il vortex, aggiungere un volume uno a uno di peptide e la soluzione adiuvante di Complete Freund alla siringa e reinserire lo stantuffo di vetro nella siringa. Tenendo lo stantuffo in posizione, capovolgere la siringa in modo che il rubinetto sia rivolto verso l'alto e spostare la leva sulla connessione femmina non utilizzata. Premere con cautela lo stantuffo per rimuovere l'aria in eccesso dalla siringa.

La soluzione riempirà la seconda connessione Luer lock maschio del rubinetto. Quindi collegare una seconda siringa di vetro con lo stantuffo completamente inserito nella seconda connessione Luer lock maschio. Per creare un'emulsione, premere alternativamente gli stantuffi per far passare la soluzione tra le due siringhe per circa due minuti e raffreddare la soluzione per circa 10 minuti fino a quando non si verifica un cambiamento visibile nella viscosità della soluzione.

Quando si forma un'emulsione bianca molto rigida, trasferire tutta la soluzione in una delle siringhe e sostituire la siringa vuota con una nuova siringa Luer lock da un millimetro. Riempire la nuova siringa con l'emulsione. Estrarre la siringa dal rubinetto e inserire un ago calibro 25.

Per testare la consistenza dell'emulsione nell'acqua, espellere una goccia di emulsione in un piattino d'acqua. Se l'emulsione non si disperde, è adatta per l'iniezione. Quindi iniettare ciascuna donatrice di topo knockout AQP4 per via sottocutanea una volta in ciascun lato del basso addome e in ciascun lato della parete toracica mediale all'ascella.

Da 10 a 12 giorni dopo l'immunizzazione, praticare un'incisione sulla linea mediana nella pelle dall'inguine al collo e lungo ciascuna gamba del primo topo. Stacca la pelle dal peritoneo e fissala saldamente alla tavola. Quindi raccogliere i linfonodi inguinali e ascellari e posizionare i tessuti in un colino cellulare all'interno di una capsula di Petri contenente un terreno completo.

Quando tutti i linfonodi sono stati raccolti, posizionare il filtro cellulare su una provetta conica da 50 millilitri contenente terreno completo fresco su ghiaccio e utilizzare l'estremità piatta di uno stantuffo a siringa sterile da cinque millilitri per premere le cellule linfonodali attraverso la rete del filtro. Sciacquare la rete con 20-30 millilitri di terreno completo per facilitare il recupero cellulare seguito da due lavaggi di centrifugazione. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere il pellet nel terreno di coltura delle cellule T per il conteggio.

Aggiungere alle cellule le concentrazioni appropriate di antigene, interleuchina di topo ricombinante 23 e IL-6 di topo ricombinante e aggiungere due millilitri di cellule per pozzetto in questa miscela polarizzante Th17 in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per 72 ore. Il terzo giorno di polarizzazione, triturare le colture in ogni pozzetto alcune volte per rimuovere le cellule polarizzate e raccoglierle in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio per il conteggio.

Dopo due lavaggi in PBS, diluire le cellule a una concentrazione di una volta 10-8 cellule per millilitro in PBS e mescolare delicatamente la sospensione cellulare agitandola. Entro un'ora dalla raccolta, trasferire le cellule in una siringa da un millilitro e somministrare 200 microlitri di cellule a ciascun animale ricevente per via endovenosa attraverso la vena caudale. Quindi iniettare immediatamente ogni topo per via intraperitoneale e due giorni dopo con 200 nanogrammi di tossina B pertosse diluita in 200 microlitri di PBS.

Per l'imaging retinico in vivo degli animali riceventi mediante tomografia a coerenza ottica, cinque minuti prima dell'imaging, dilatare le pupille con una goccia di tropicamide all'1% per occhio e accendere il tappetino termico. Posizionare il mouse sul cilindro di imaging e reindirizzare il flusso di anestesia di conseguenza. Proteggi gli occhi con lo 0,3% di idrossipropilmetilcellulosa per mantenerli umidi e per garantire la continuità della rifrazione e posiziona una lente a contatto personalizzata sull'occhio da esaminare.

Guidato dall'immagine del fondo oculare a infrarossi, dirigere il laser verso l'occhio coperto dalla lente facendo attenzione che il raggio sia centrato sulla testa del nervo ottico. Esegui 25 B-scan in modalità ad alta risoluzione e rasterizza le immagini da 30 A-scan medi. Dopo l'imaging di entrambi gli occhi, sostituire la lente a contatto con gel oftalmico e posizionare il topo in una gabbia di recupero calda.

Per analizzare le immagini acquisite utilizzando il software di imaging modulare per la segmentazione automatizzata, correggere prima manualmente i segmenti corrispondenti alla membrana limitante interna e allo strato plessiforme interno per rappresentare i limiti degli strati retinici interni. Quindi verificare che la fibra nervosa retinica e gli strati delle cellule gangliari risiedano entro i limiti dello strato retinico interno e che non si sovrappongano. L'immunizzazione sottocutanea con peptidi AQP4 che contengono epitopi patogeni delle cellule T suscita forti risposte proliferative delle cellule T nei linfonodi drenanti dei topi knockout per AQP4 rispetto alle risposte delle cellule T wild type.

Le analisi citofluorimetriche dell'espressione individuale di V beta dimostrano che le cellule T specifiche per i peptidi AQP4 che contengono epitopi patogeni delle cellule T utilizzano repertori TCR unici e dimostrano un'iperproliferazione selettiva che indica che le risposte delle cellule T patogene a questi determinanti sono normalmente regolate dalla selezione timica negativa. Circa sei-nove giorni dopo l'iniezione di cellule T polarizzate, quasi tutti i topi riceventi hanno sviluppato segni clinici di malattia autoimmune del SNC, tra cui la coda floscia e la paralisi degli arti posteriori. Con le cellule T specifiche per AQP4 polarizzate Th17 che inducono una malattia clinica più grave rispetto alle cellule T specifiche per AQP4 polarizzate Th1.

Ad esempio, questo topo ha sviluppato una paralisi completa degli arti posteriori dopo la somministrazione di cellule T specifiche per il peptide AQP4 polarizzate Th17. La malattia clinica indotta dalle cellule Th17 peptide-specifiche dell'AQP4 è anche associata a un'infiltrazione di cellule mononucleate nel parenchima del SNC e nelle meningi, nonché all'infiammazione del nervo ottico, come ulteriormente evidenziato da un rigonfiamento e un aumento dello spessore dello strato retinico interno che ritorna al basale man mano che i topi si riprendono dalla malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre e monitorare l'autoimmunità mirata all'AQP4, il che consentirà ulteriori studi per capire come le cellule T partecipano alla neuromielite ottica.