Name: Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri come indurre malattie autoimmuni del SNC mediante il trasferimento di cellule T specifiche per AQP4 nei topi. Questo metodo consente di monitorare le lesioni retiniche con la tomografia a coerenza ottica in modo non invasivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supporto è stato fornito a S.S.Z. dal National Institute of Health (RO1 AI073737 e RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (RG 4768, 5179 RG e RG 5180), Fondazione Maisin e Guthy Jackson Charitable Foundation.

<ol><li>Hardy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+inflammatory+demyelinating+syndromes+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS.</a> Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).</li>
<li>Lennon, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+autoantibody+marker+of+neuromyelitis+optica%3A+distinction+from+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis.</a> Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).</li>
<li>Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+marker+of+optic-spinal+multiple+sclerosis+binds+to+the+aquaporin-4+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel.</a> J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).</li>
<li>Zamvil, S. S., Slavin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+MOG+Ig-positive+AQP4-seronegative+opticospinal+inflammatory+disease+justify+a+diagnosis+of+NMO+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62(2015).</li>
<li>Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+pathogenic+anti-aquaporin-4+antibodies+in+early+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica.</a> Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).</li>
<li>Bradl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromyelitis+optica%3A+pathogenicity+of+patient+immunoglobulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo.</a> Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., Chung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+development+and+function+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Understanding the development and function of T follicular helper cells.</a> Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).</li>
<li>Lucchinetti, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+an+autoimmune+astrocytopathy%3A+lessons+learned+from+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica.</a> Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).</li>
<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4442096/">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Brum, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-DRB+association+in+neuromyelitis+optica+is+different+from+that+observed+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis.</a> Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).</li>
<li>Varrin-Doyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+4-specific+T+cells+in+neuromyelitis+optica+exhibit+a+Th17+bias+and+recognize+Clostridium+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter.</a> Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).</li>
<li>Vaknin-Dembinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+responses+to+distinct+AQP4+peptides+in+patients+with+neuromyelitis+optica+%28NMO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO).</a> Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).</li>
<li>Nelson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T+cell+determinants+of+aquaporin-4%2C+the+autoantigen+associated+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica.</a> PLoS One. 5 (11), 15050(2010).</li>
<li>Kalluri, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+aquaporin-4+specific+T+cells%3A+towards+a+model+for+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica.</a> PLoS One. 6 (1), 16083(2011).</li>
<li>Pohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+responses+against+aquaporin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell responses against aquaporin 4.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).</li>
<li>Zeka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+encephalitogenic+aquaporin+4-specific+T+cells+and+NMO-IgG+jointly+orchestrate+lesion+location+and+tissue+damage+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS.</a> Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).</li>
<li>Sagan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+checkpoint+bypass+permits+emergence+of+pathogenic+T+cells+to+neuromyelitis+optica+autoantigen+aquaporin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).</li>
<li>Vita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+epitope+database+%28IEDB%29+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The immune epitope database (IEDB) 3.0.</a> Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175907003651">Lymph node mapping in the mouse.</a> J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+retinal+wholemount+preparation+for+imaging+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (82), e51018(2013).</li>
<li>Cruz-Herranz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+APOSTEL+recommendations+for+reporting+quantitative+optical+coherence+tomography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies.</a> Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Molnarfi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-dependent+B+cell+APC+function+is+required+for+induction+of+CNS+autoimmunity+independent+of+myelin-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies.</a> J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).</li>
<li>Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+aquaporin-4+reactive+T+cells+are+sufficient+to+induce+mouse+model+of+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica.</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 28(2015).</li>
<li>Oertel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+visual+system+changes+in+AQP4-antiboby-seropositive+NMOSD%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Neuroimmunol.+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD.</a> Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72(2017).</li>
<li>Vogel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+prevents+AQP4+directed+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice.</a> Eur J Immunol. , (2017).</li>
<li>Zhang, H., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinally+extensive+NMO+spinal+cord+pathology+produced+by+passive+transfer+of+NMO-IgG+in+mice+lacking+complement+inhibitor+CD59%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59.</a> J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).</li>
<li>Zeka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+4-specific+T+cells+and+NMO-IgG+cause+primary+retinal+damage+in+experimental+NMO%2FSD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82(2016).</li>
<li>Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-independent+retinal+pathology+produced+by+intravitreal+injection+of+neuromyelitis+optica+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 275(2016).</li>
<li>Zamvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+clones+specific+for+myelin+basic+protein+induce+chronic+relapsing+paralysis+and+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination.</a> Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).</li>
<li>Zamvil, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitogenic+T+cell+clones+specific+for+myelin+basic+protein.+An+unusual+bias+in+antigen+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition.</a> J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).</li>
<li>Kuchroo, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-1+and+B7-2+costimulatory+molecules+activate+differentially+the+Th1%2FTh2+developmental+pathways%3A+application+to+autoimmune+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy.</a> Cell. 80 (5), 707-718 (1995).</li>
<li>Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).</li>
</ol>

Sagan S.A., A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green e R.A. Sobel non segnalare nessun informazioni integrative. S.S. Zamvil vice direttore della neurologia, neuroimmunologia e Neuroinflammation ed è un membro del Comitato consultivo per la società internazionale di Neuroimmunologia. Egli è membro del comitato editoriale del Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology e Giornale di scienze neurologicheed è stato socio fondatore del Comitato di revisione di sovvenzione per gli istituti nazionali di di neuroimmunologia clinica di salute (NIH) e i tumori di cervello (CNBT) studio sezione e la società nazionale di sclerosi a placche (NMSS). Ha lavorato come consulente e ricevuto onorari da Biogen Idec, EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech e Teva Pharmaceuticals, Inc. e ha servito o serve su schede di monitoraggio di dati sicurezza per Lilly, BioMS, Teva e Opexa Therapeutics. Attualmente, Dr. Zamvil riceve sovvenzioni di ricerca dal NIH, NMSS, Fondazione Maisin, Biogen e Celgene.

AQP4 è stato identificato come l'obiettivo primario in NMO IgG nel 20053. Quindi, è stato riconosciuto che sarebbe importante stabilire un modello animale di targeting AQP4 dell'autoimmunità CNS. Tale modello potrebbe essere utile per indagare come cellule di B e T specifici AQP4 partecipano nello sviluppo dell'autoimmunità CNS e testare therapeutics candidato per NMO. Anche se l'identificazione di specifiche AQP4 T cell epitopi nei topi wild-type in primo luogo è stato segnalato nel 201013, cellule T risponde a quegli epitopi non ha causato la malattia clinica o istologica14,17. L'incapacità di generare un modello di autoimmunità CNS basata su reattività immune a AQP4 è rimasto un enigma fino al 2015, quando Jones, et al. 25 scoperto che cellule T del donatore AQP4 p135-153-innescato da AQP4 topi- / - sono stati in grado di causare segni clinici e istologici di autoimmunità CNS nei topi WT. Di interesse, AQP4 p135-153 è preveduta per associare MHC II (-A,b) con alta affinità17. Solo un altra AQP4 sequenza dell'amminoacido, 201-220, è preveduta per associare-Ab con alta affinità simili. Infatti, abbiamo osservato che AQP4 p135-153 e p201-220 sia indurre proliferazione robusta in AQP4- / -, ma non WT, topi. Qui, abbiamo mostrato come si può isolare ed espandere encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - e p201-220-T cellule reattive da topi- / - AQP4. Quando trasferito nel destinatari topi WT, le cellule erogarici Th17 AQP4-reattiva indotta paralisi, che era accompagnata da infiltrati di cellule mononucleari nel midollo spinale e del nervo ottico. Sistema visivo afferente la ferita è ben nota in pazienti con AQP4-sieropositivi NMOSD26. Qui, abbiamo osservato che l'infiammazione del nervo ottico indotta dalle cellule AQP4-reattiva e Th17 MOG-reattiva era distinto. Considerando che le cellule Th17 AQP4-specifiche indotte perineuritis ottico, cellule Th17 MOG-specific ha indotto la neurite ottica severa. Inoltre abbiamo descritto le tecniche utilizzate per monitorare l'infiammazione del nervo ottico indotta dalle cellule di T di MOG-specific e AQP4 specifici da seriale OCT. Altri ricercatori dovrebbero ora essere in grado di applicare i protocolli descritti qui per spostare in avanti i propri studi focalizzati su meccanismi patogenetici dell'ATCA.
Si possono facilmente evitare tre potenziali insidie nel nostro protocollo. Primo trasferimento adottivo di ATCA richiede uso AQP4-specifiche delle cellule di T da topi di donatore- / - AQP4. In particolare, le cellule erogarici WT AQP4 p135-153-specifico T non hanno causato ATCA nei topi WT destinatari. In secondo luogo, è importante eseguire un "test-acqua" con una goccia di emulsione peptide/CFA prima immunizzazione di AQP4 topi- / - (protocollo passo 1,5). L'emulsione non deve disperdere in acqua quando è adatto per l'iniezione s.c.. Se l'emulsione si disperde, uno dovrebbe mescolare l'emulsione ancora una volta, chill nuovamente e ripetere la prova dell'acqua. Infine, cellule T antigene-specifiche di donatore attivato CNS inducono l'autoimmunità CNS più efficientemente le cellule di T di riposo. Uno dovrebbe ispezionare visivamente quelle culture sotto il microscopio chiaro prima della raccolta le cellule di T del donatore per trasferimento adottivo. Cellule in rapida divisione possono formare ammassi, che sono facilmente identificabili. Inoltre, quando culture contengono molte cellule di T attivate, i media possono transizione dal rosa all'arancio o anche al giallo, a causa della riduzione del pH. Uno inoltre possibile valutare l'attivazione delle cellule di linfonodo di AQP4-innescato T erogarici per proliferazione dall'incorporazione di 3H-timidina, come descritto nel protocollo passaggio 3.
La nostra scoperta che i due epitopi a cellula T AQP4 patogeni sono (1) previsto per associare MHC II con alta affinità e (2) suscitare risposte proliferative potente in AQP4- / -, ma non WT, topi suggeriscono che le cellule T targeting quelle determinanti sono normalmente controllata dalla selezione negativa timica17. Il repertorio TCR utilizzato per il riconoscimento di AQP4 p135-153 e p201-220 in AQP4- / - topi è unici (Figura 2), che è anche coerente con delezione clonale mediata da cellule epiteliali midollare del timo. Altri meccanismi tollerogeniche normalmente possono trattenere le risposte immunitarie a AQP4. A seguito del nostro rapporto iniziale17, un altro gruppo ha inoltre dimostrato che AQP4 p201-220 contiene un encephalitogenic cellula T determinante27. Quando i topi α/β (TCRα- / -) T cellula-carenti erano ricostituiti con AQP4- / - CD4+ T cellule, è stato possibile suscitare una risposta delle cellule T encephalitogenic AQP4 specifici, ma non una risposta umorale AQP4-specifica, che implica che in Topi WT AQP4-specifiche delle cellule di B risposte, simili a risposte delle cellule T specifiche per AQP4, sono soggetti a selezione negativa. Infatti, perdita di assoni del midollo spinale e RGCs, che non è stata osservata nei topi WT con ATCA indotta dalle cellule di T di AQP4 specifici da solo, può richiedere la partecipazione degli anticorpi patogeni specifici AQP4. È chiaro che modelli murini di autoimmunità targeting AQP4 CNS continuerà ad evolversi come apprendiamo di più per quanto riguarda i meccanismi di tollerogeniche normalmente controllo immunità AQP4 specifiche cellule T e delle cellule di B.
Altri modelli dell'autoimmunità targeting AQP4 CNS vengono sviluppati6,16,28,29,30. Ciascuno di essi può offrire vantaggi per lo studio di particolari aspetti che sono rilevanti per la patogenesi NMO. Le cellule di T di AQP4-specifiche sono state identificate in WT ratti6,16,29. Quelle cellule T specifiche AQP4 causato cambiamenti istologici dell'autoimmunità CNS ma, simili alle osservazioni nei topi, cellule T AQP4-specifici del ratto WT non causano significativi segni di malattia clinica. Pertanto, i meccanismi di tolleranza limitazione delle cellule T e delle cellule di B AQP4 specifiche risposte immunitarie in topi WT sono anche operativi in ratti. Indipendentemente da ciò, uno non dovrebbe sottovalutare il potere utilizzando modelli murini per studiare i meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia. La ricchezza di knock-out, transgenici e topi reporter può essere vantaggiosa. Va anche riconosciuto che parecchie scoperte fondamentali nell'autoimmunità sono stati realizzati utilizzando modelli murini di EAE. Ad esempio, dimostrazione che cellula T cloni specifici per un auto-antigene possa mediare la malattia autoimmune31,32, identificazione del ruolo della costimolazione delle cellule T in autoimmunità33 e la scoperta della via di sviluppo per Th17 differenziazione34 furono descritti per la prima volta utilizzando modelli murini di EAE. Utilizzando il modello murino di ATCA che abbiamo sviluppato, uno ora ha i mezzi per studiare lo sviluppo e la regolamentazione dei patogene risposte immunitarie specifiche AQP4 in vivo, che dovrebbe fornire le comprensioni importanti legate alla patogenesi NMO.

Neuromielite ottica (NMO) è una malattia demielinizzante infiammatoria autoimmune di sistema nervoso centrale (SNC) che provoca episodi ricorrenti di paralisi e perdita visiva che porta a disabilità neurologica permanente1. NMO è attualmente considerato principalmente una malattia autoimmune umorale2 come è associato con gli anticorpi (Igs) destinazione acquaporina-4 (AQP4), un canale di acqua espresso abbondantemente su astrociti3,4. Tuttavia, l'infiammazione CNS è un prerequisito per l'ingresso di CNS di AQP4 Ig5,6. Così, non è stato possibile stabilire un modello di NMO dal trasferimento di anti-AQP4 Igs da solo. I risultati che (1) patogeni specifici AQP4 Igs in pazienti NMO sono IgG11,2, un Ig di cellula T-dipendente sottoclasse7 (2) cellule di T sono identificate in NMO lesioni8,9 (3) NMO è associato con determinati geni MHC II (ad esempio HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10e (4) proinflammatory AQP4-reattiva DR-limitato Th17 cellule vengono espansi in NMO pazienti11,12 tutti indicano che le cellule T AQP4-specifiche hanno un ruolo chiave nella patogenesi NMO. Pertanto, è importante sviluppare modelli animali per determinare come le cellule T AQP4-specifici possono contribuire alla patogenesi NMO.
Diversi anni fa, più epitopi a cellula T di AQP4 sono stati identificati in wild type (WT) topi13,14 e ratti15. Mentre è stato osservato che le cellule T AQP4-reattiva potrebbero indurre l'infiammazione opticospinal ingenuo destinatario ratti15,16, significativi segni clinici della malattia dello SNC non sono stati osservati. Allo stesso modo, diretto l'immunizzazione di topi WT con peptidi contenenti AQP4 T cell epitopi14,17, o trasferimento di proinflammatory T cellule targeting quelli determinanti17, non ha causato segni clinici o istologico prova di autoimmunità CNS.
Recentemente, esso è stato osservato che l'immunizzazione dei topi C57BL/6 AQP4-carenti (AQP4- / -) con AQP4 peptide (p) 135-153 o p201-220, due determinanti preveduti per associare MHC II (-A,b) con alta affinità18, ha suscitato forte CD4 + Di risposte delle cellule T17. Al contrario, questi due peptidi ha suscitato solo modeste risposte proliferative nei topi WT. Ulteriormente, il repertorio di cellula T del ricevitore (TCR) utilizzato per il riconoscimento di questi fattori determinanti dalle cellule di T da topi- / - AQP4 era unico. Collettivamente, questi risultati indicano che il riconoscimento delle cellule di T dell'AQP4 è regolato da selezione negativa timica. AQP4 p135-153-p201-220-specifici o cellule Th17 da topi di donatore- / - AQP4 indotta paralisi in quasi il 100% dei topi WT destinatari ingenui; Ciò è stata associata con opticospinal si infiltra in delle cellule T, cellule B e monociti. Opticospinal seriale tomografia di coerenza (ottobre) ha dimostrato la partecipazione dinamica sistema visivo. Topi con l'autoimmunità mediata da cellule T targeting AQP4 CNS (ATCA) recupero da paralisi e lesioni del sistema visivo. A differenza di EAE indotto da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) p35-55-specifico cellule di T, che ha portato alla malattia clinica persistente, ATCA indotta dalle cellule di T da solo non è stato associato con perdita axonal o riduzione in cellule retiniche del ganglio (RGCs). I nostri risultati hanno dimostrato chiaramente che esistono molteplici determinanti di cellula T AQP4 patogeni. Questo nuovo modello di ATCA è utile per studiare i meccanismi che controllano lo sviluppo delle cellule di T AQP4-specifici patogeni, imparando come quelle cellule inducono l'infiammazione CNS e come essi può cooperare con AQP4 specifiche B cellule e anticorpi per promuovere la patogenesi NMO .
Nel rapporto presente, descriviamo i protocolli utilizzati per indurre e valutare ATCA indotta da cellula di T. Cominciamo con le tecniche usate per immunizzazione, la coltura delle cellule T e la polarizzazione Th17 di generare le cellule T AQP4-specifici patogene, analisi di citometria a flusso per confermare il trasferimento adottivo di quelle cellule di T e di polarizzazione. Descriviamo quindi i metodi utilizzati per valutare la malattia clinica ed istologica e l'uso di OCT seriale per monitorare le lesioni del sistema visivo nei topi di destinatario.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Essiccato, ucciso M. tubercolosis</td></tr><tr><td>Incompleto Adiuvante di Freund</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 peptide p135-153</td><td>Genemed</td><td></td><td>Sequenza peptidica di sintesi personalizzata: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>Peptide AQP4 p201-220</td> Sequenza peptidica <td>di sintesi personalizzata</td><td>Genemed</td><td>: Peptide HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>MOG peptide p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td> Sequenza peptidica <td>di sintesi personalizzata</td><td>: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale HyClone (caratterizzato)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ricombinante IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ricombinante IL-6</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ricombinante IL-12</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Timidina [Metil-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Tappetini filtranti in fibra di vetro</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-topo</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[various]</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo TCR V&beta; Pannello di screening</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Colorazione di cellule morte riparabile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[vari]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (16%)Microscopia</td> <td>elettronica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione con GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristate 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Iomormicina (sale di calcio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Tossina della pertosse da B. pertussis</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica a flusso variabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti per biopsia in schiuma, rettangolari</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (isoflurano, USP)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td>NDC: 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Soluzione oftalmica tropicale, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Piattaforma di imaging diagnostico Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule t per neuromielite ottica autoantigen acquaporina-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Mentre è riconosciuto che l'Acquaporina-4 (AQP4)-specifiche cellule T e anticorpi partecipano nella patogenesi della neuromielite ottica (NMO), una malattia demielinizzante autoimmune umano sistema nervoso centrale (CNS), la creazione di un modello di AQP4-mirati con entrambi le manifestazioni cliniche ed istologiche dell'autoimmunità CNS ha dimostrato impegnativo. Immunizzazione dei topi di wild-type (WT) con peptidi AQP4 ha suscitato la proliferazione delle cellule T, anche se quelle cellule T non potrebbero trasferire la malattia ai topi destinatario ingenuo. Recentemente, due novelli epitopi a cellula T di AQP4, peptide (p) 135-153 e p201-220, sono state identificate quando studiando le risposte immunitarie di AQP4 in topi AQP4-carenti (AQP4- / -), suggerendo la reattività delle cellule T a questi epitopi è normalmente controllato da timica selezione negativa. AQP4- / - Th17 polarizzata cellule T innescate a p135-153 o p201-220 paralisi indotta nei topi WT destinatari, che è stata associata con principalmente leptomeningeal infiammazione del midollo spinale e nervi ottici. L'infiammazione circostante i nervi ottici ed il coinvolgimento degli strati retinici interni (IRL) sono stati manifestati dai cambiamenti nella tomografia a coerenza ottica seriale (OCT). Qui, vi illustriamo gli approcci utilizzati per creare questo nuovo modello in vivo di autoimmunità targeting AQP4 CNS (ATCA), che ora può essere impiegato per lo studio dei meccanismi che consentono lo sviluppo di patogeni specifici AQP4 T cellule e come essi possono cooperare con B cellule nella patogenesi NMO.

In questo protocollo, abbiamo usato le cellule di T del donatore da topi di C57BL/6 AQP4- / . L'immunizzazione sottocutanea di questi topi con AQP4 p135-153 o p201-220, che contengono epitopi a cellula T patogeni, ha suscitato forte proliferative delle cellule T risposte nei linfonodi drenanti (Figura 1), mentre questi due peptidi indotto molto più debole delle cellule T proliferazione nei topi WT. In confronto, l'immunizzazione con AQP4 p91-110, contenente un non-patogeni AQP4 T cellulare determinante13, o MOG p35-55, un peptide di mielina che attiva le cellule di T che causano l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)22,23 ,24, indotto grandezza simile di proliferazione delle cellule T in AQP4- / - e topi WT. Analisi dell'utilizzo di TCR macchiando di citometria a flusso per di Vβ individuali o famiglie Vβ, ha dimostrato che cellule p135-153-p201-220-specifici e T da topi- / - AQP4 utilizzato unico repertorio TCR. Iper-proliferazione selettiva dell'AQP4 p135-153 e p201-220 in topi- / - AQP4, nonché l'unico utilizzo di TCR (Figura 2), indicato che la cellula T patogeni risposte a questi fattori determinanti è normalmente regolato da negativo timica selezione, sottolineando l'importanza per usando le cellule di T del donatore- / - di AQP4 nel presente protocollo.
Prima del trasferimento adottivo per l'induzione dell'ATCA, cellule di linfonodo da AQP4 peptide-innescato topi sono state coltivate in vitro in condizioni di Th17 o di polarizzazione Th1 per tre giorni. La misura della polarizzazione del donatore CD4+ T cellule è stata confermata dalla macchiatura (ICS) intracellulari di cytokine e misurata da citometria a flusso (Figura 3). Ingenuo destinatari topi sono stati iniettati per via endovenosa con cellule di T di 2 x 107 donatore AQP4 peptide specifico. Dopo circa sei giorni, quasi 100% dei topi destinatari sviluppato i segni clinici della malattia autoimmune dello SNC, compreso la paralisi zoppicare di coda e dell'arto posteriore (Figura 4). Polarizzato Th17 AQP4 specifiche T cellule indotte più grave malattia clinica che le cellule Th1 polarizzato T AQP4-specifici. Un topo rappresentativo che ricevuto Th17 AQP4-peptide-specifico e ha sviluppato la paralisi completa dell'arto (paraplegia) è mostrato nel Video 1. In contrasto con i topi che hanno sviluppato EAE dopo somministrazione di cellule Th17 MOG-specific, topi destinatari recupero da malattia clinica indotta dalle cellule Th17 AQP4 specifici. Per quanto riguarda EAE indotto da cellule Th17 p35-55-specifiche MOG, malattia clinica indotta da AQP4 p135-153-specifico o cellule Th17 p201-220-specific è stata associata con infiltrazione delle cellule mononucleari nel parenchima CNS e meningi (Figura 5). Le lesioni erano più abbondanti nelle meningi che nel parenchima dell'autoimmunità CNS indotta dalle cellule Th17 AQP4 specifici.
MOG-specific Th17 cellule sia infiammazione indotta del nervo ottico, che è stato caratterizzato dalla presenza di cellule mononucleari e coinvolgimento del nervo ottico è stato dimostrato dalla valutazione istologica e da seriali OCT. AQP4-specifici. Considerando le cellule Th17 AQP4 specifico causato perineuritis ottico, cellule Th17 MOG-specific ha indotto la neurite ottica severa (Figura 5). Utilizzando seriale OCT, l'infiammazione del nervo ottico era evidente dal gonfiore e aumento dello spessore di strato retinico interno (IRL) per malattia clinica indotta da AQP4-specifiche o cellule Th17 MOG-specific (Figura 6). Per l'autoimmunità indotta da AQP4 Th17 CNS, spessore IRL ritornato ai valori basali come topi recuperato da malattia clinica. Al contrario, la persistenza di EAE indotto da MOG-specific Th17 corrispondeva con IRL assottigliamento e, come abbiamo dimostrato in precedenza17, è stata associata con perdita delle cellule ganglionari retiniche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
Figura 1 : AQP4 p135-153 e p201-220 suscitare la proliferazione delle cellule di T robusta in AQP4- / - topi, ma non i topi WT. Topi sono stati immunizzati s.c. con i peptidi indicati in CFA. Undici giorni più tardi, linfonodi sono stati rimossi e poi coltivate con entrambi nessun antigene, o con il peptide utilizzato per l'immunizzazione. La proliferazione è stata misurata dall'incorporazione di 3H-timidina (media ± SEM, rappresentante di 5 esperimenti). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
Figura 2 : Le cellule di T AQP4-specifici da topi- / - AQP4 utilizzano repertori TCR unici. AQP4- / - e topi WT sono stati immunizzati con i peptidi indicati. Undici giorni più tardi, i linfonodi sono stati rimossi e coltivati con peptide utilizzato per l'immunizzazione. Le cellule sono state raccolte. L'utilizzo di TCR Vβ è stata analizzata mediante citometria a flusso (media ± SEM, n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
Figura 3 : Proinflammatory polarizzazione delle cellule erogarici AQP4 specifiche T. Undici giorni dopo immunizzazione con AQP4 p135-153 o p201-220, cellule di linfonodo sono state raccolte e coltivate con il peptide utilizzato per l'immunizzazione in condizioni di non-polarizzazione Th1 o di polarizzazione Th17 condizioni. Polarizzazione Th17 o Th1 è stato esaminato da ICS e flusso cytometry per IL-17 o IFN-γ, rispettivamente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
Figura 4 : Cellule Th17-polarizzata AQP4 specifiche T inducono paralisi nei destinatari topi WT. WT destinatari topi hanno ricevuto 2 x 107 donatore polarizzato Th17 AQP4 p135-153 o cellule T p201-220-specifiche da topi- / - AQP4. Cellule di T di MOG-specific polarizzato Th17 servito come controllo positivo. Risultati sono rappresentativi di 8 esperimenti (n = 5/gruppo). * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
Figura 5 : Cellule Th17 AQP4 specifico inducono l'infiammazione opticospinal nei topi WT. Destinatari topi hanno ricevuto 2 x 107 cellule Th17 in donatore Th17 AQP4 p135-153 - o p201-220-innescato da AQP4 topi- / - o le cellule Th17 MOG p35-55-specifiche e sono stati sacrificati 10 giorni più tardi. Tessuti del midollo spinale e del nervo ottico sono stati preparati e macchiati con H &#38; E/LFB per valutare la prova di infiammazione e demielinizzazione, rispettivamente. Risultati sono rappresentativi di 5 topi/gruppo. Barra della scala = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
Figura 6 : Infiammazione del nervo ottico indotta dalle cellule Th17 AQP4 specifici possa essere monitorato da ottobre retinica longitudinale WT destinatari topi hanno ricevuto 2 x 107 donatore polarizzato Th17 AQP4 p201-220-specifico o le cellule di T di MOG p35-55-specifico il giorno 0. Essi sono stati esaminati entro ottobre il giorno 0 (prima della somministrazione delle cellule T) e quindi nei giorni 4, 7, 8, 9 10, 11 14 e 21. Spessore IRL è stato misurato (media ± SEM). Le statistiche indicano un confronto con controllo ingenuo. Risultati sono rappresentativi di 3 esperimenti (5 topi/gruppo). * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'infiammazione di paralisi e opticospinal di trasferimento di acquaporina-4 (AQP4)-specifiche cellule T da AQP4 topi- / - in topi WT. Inoltre, dimostriamo come utilizzare tomografia a coerenza ottica seriale per monitorare la disfunzione del sistema visivo.

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono indurre una malattia autoimmune del sistema nervoso centrale o SNC mediante il trasferimento adottivo di linfociti T specifici per l'acquaporina 4 e monitorare gli effetti risultanti sul SNC e sul sistema visivo dinamico. Questo metodo contribuirà a rispondere a domande fondamentali riguardo al ruolo dei linfociti T specifici per l'acquaporina 4, comunemente nota come AQP4, nella neuromielite ottica e in altri disturbi infiammatori del sistema visivo. Il principale vantaggio della tomografia a coerenza ottica è la capacità di effettuare un monitoraggio longitudinale del danno retinico in modo non invasivo.La procedura sarà dimostrata da Sharon Sagan, un'assistente di ricerca del mio laboratorio, e da Andreas Cruz Harans, un ricercatore del Laboratorio di RE Greens. Iniziare collegando un rubinetto a tre vie in nylon con due connessioni maschio Luer lock a una siringa in vetro con connessione Luer lock, senza stantuffo. Ruotare la leva del rubinetto verso la siringa per chiudere il rubinetto e posizionare la siringa con l'estremità aperta rivolta verso l'alto.Dopo aver agitato con il vortex, aggiungere un volume equimolare di peptido e soluzione di adiuvante completo di Freund nella siringa, quindi reinserire lo stantuffo di vetro nella siringa. Tenendo lo stantuffo in posizione, capovolgere la siringa in modo che il rubinetto sia rivolto verso l'alto e spostare la leva sul collegamento femmina non utilizzato. Premere con attenzione lo stantuffo per rimuovere l'aria in eccesso dalla siringa.La soluzione riempirà il secondo connettore maschio Luer lock del rubinetto. Quindi collegare una seconda siringa di vetro con lo stantuffo completamente inserito nel secondo connettore maschio Luer lock. Per creare un'emulsione, premere alternativamente gli stantuffi per far passare la soluzione tra le due siringhe per circa due minuti, quindi raffreddare la soluzione per circa 10 minuti finché non si osserva un cambiamento visibile nella viscosità della soluzione.Quando si forma un'emulsione bianca molto rigida, trasferire tutta la soluzione in una delle siringhe e sostituire la siringa vuota con una nuova siringa Luer lock da un millimetro. Riempire la nuova siringa con l'emulsione. Rimuovere la siringa dal rubinetto e attaccare un ago da 25 gauge.Per verificare la consistenza dell'emulsione mediante test con acqua, espellere una goccia dell'emulsione in un piccolo contenitore con acqua. Se l'emulsione non si disperde, è adatta per l'iniezione. Iniettare quindi ogni topo donatore knockout per AQP4 una sola volta per via sottocutanea su ciascun lato dell'addome inferiore e su ciascun lato della parete toracica in posizione mediale rispetto all'ascella.Da 10 a 12 giorni dopo l'immunizzazione, praticare un'incisione mediana nella pelle dalla regione inguinale fino al collo e lungo ciascuna gamba del primo topo. Staccare la pelle dal peritoneo e fissarla saldamente alla tavoletta. Quindi prelevare i linfonodi inguinali e ascellari e collocare i tessuti in un colino cellulare all'interno di una piastra di Petri contenente mezzo completo.Dopo aver raccolto tutti i linfonodi, posizionare il colino cellulare su un tubo conico da 50 millilitri contenente mezzo completo fresco posto sul ghiaccio ed utilizzare l'estremit&agrave; piatta dello stantuffo di una siringa sterile da cinque millilitri per spingere le cellule dei linfonodi attraverso la maglia del filtro. Risciacquare la maglia con 20-30 millilitri di mezzo completo per facilitare il recupero cellulare, seguito da due lavaggi mediante centrifugazione. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere il pellet nel mezzo per linfociti T per il conteggio.Aggiungere alle cellule le concentrazioni appropriate di antigene, interleuchina murina ricombinante 23 e IL-6 murina ricombinante, quindi aggiungere due millilitri di cellule per pozzetto di questa miscela polarizzante Th17 in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per 72 ore. Al terzo giorno di polarizzazione, triturare le colture in ciascun pozzetto alcune volte per staccare le cellule polarizzate e raccoglierle in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio per il conteggio.Dopo due lavaggi in PBS, diluire le cellule fino a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro in PBS ed emulsionare delicatamente la sospensione cellulare ruotando il contenitore. Entro un'ora dal prelievo, trasferire le cellule in una siringa da un millilitro ed inoculare 200 microlitri di cellule a ciascun animale ricevente per via endovenosa attraverso la vena della coda. Successivamente, iniettare immediatamente a ciascun topo e due giorni dopo 200 nanogrammi di tossina di B pertussis diluiti in 200 microlitri di PBS per via intraperitoneale.Per l'imaging retinico in vivo degli animali riceventi mediante tomografia a coerenza ottica, cinque minuti prima dell'imaging, dilatare le pupille con una goccia di tropicamide allo 1% per ogni occhio e accendere il tappetino riscaldante. Posizionare il topo sul cilindro di imaging e deviare adeguatamente il flusso di anestesia. Proteggere gli occhi con idrossipropil metilcellulosa allo 0,3% per mantenerli umidi e garantire la continuità della rifrazione, e posizionare una lente a contatto personalizzata sull'occhio da esaminare.Guidati dall'immagine del fondo oculare in infrarosso, indirizzare il laser sull'occhio coperto dalla lente, avendo cura che il fascio sia centrato sulla testa del nervo ottico. Eseguire 25 B-scan in modalità ad alta risoluzione e rasterizzare le immagini a partire da 30 A-scan mediati. Dopo aver effettuato l'imaging di entrambi gli occhi, sostituire la lente a contatto con del gel oftalmico e posizionare il topo in una gabbia di recupero riscaldata.Per analizzare le immagini acquisite utilizzando il software modulare di imaging per la segmentazione automatica, correggere innanzitutto manualmente i segmenti corrispondenti alla membrana limitante interna e al livello plessiforme interno in modo da rappresentare i limiti dei livelli retinici interni. Successivamente, verificare che i livelli delle fibre nervose retiniche e delle cellule gangliari siano compresi entro i limiti del livello retinico interno e che non si sovrappongano. L'immunizzazione sottocutanea con peptidi AQP4 contenenti epitopi di cellule T patogeni induce forti risposte proliferative delle cellule T nei linfonodi drenanti di topi knockout per AQP4 rispetto alle risposte delle cellule T di tipo selvatico.Le analisi citofluorimetriche dell'espressione individuale delle catene V beta dimostrano che le cellule T specifiche per peptidi di AQP4 contenenti epitopi T patogeni utilizzano repertori unici di recettori per cellule T (TCR) e mostrano una iperproliferazione selettiva, indicando che le risposte delle cellule T patogene a questi determinanti sono normalmente regolate dalla selezione negativa timica. Circa sei-nove giorni dopo l'iniezione di cellule T polarizzate, quasi tutti i topi riceventi hanno sviluppato segni clinici di malattia autoimmune del sistema nervoso centrale, inclusi coda floscia e paralisi degli arti posteriori. Le cellule T specifiche per AQP4 polarizzate verso il fenotipo Th17 inducono una malattia clinica più grave rispetto alle cellule T specifiche per AQP4 polarizzate verso il fenotipo Th1.Ad esempio, questo topo ha sviluppato paralisi completa degli arti posteriori dopo la somministrazione di cellule T specifiche per il peptide AQP4 polarizzate in senso Th17. La malattia clinica indotta da cellule Th17 specifiche per il peptide AQP4 è associata anche a un'infiltrazione di cellule mononucleate nel parenchima e nelle meningi del SNC, nonché a un'infiammazione del nervo ottico, ulteriormente dimostrata da un rigonfiamento e un aumento dello spessore dello strato retinico interno che torna alla normalità quando i topi si riprendono dalla malattia. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre e monitorare l'autoimmunità diretta contro AQP4, il che permetterà ulteriori studi per comprendere il ruolo delle cellule T nella neuromielite ottica.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il video dimostra l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino iniettando una combinazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche e Mycobacterium tuberculosis inattivato. Il modello consente ai ricercatori di studiare i meccanismi della malattia e testare gli interventi terapeutici.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Questo video mostra il metodo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) iniettando peptidi derivati dalla mielina con un adiuvante per attivare le cellule T autoreattive, che migrano verso il cervello. La tossina della pertosse viene somministrata per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo a queste cellule T e ad altre cellule immunitarie di entrare nel cervello. Queste cellule immunitarie causano demielinizzazione, portando a una compromissione...

Generazione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Questo video mostra la procedura per indurre la paralisi trasferendo cellule Th17 attivate che hanno come bersaglio l'acquaporina-4 in un modello murino. Nel sistema nervoso centrale, le cellule Th17 attivate interagiscono con gli astrociti che esprimono l'acquaporina-4, innescando una risposta immunitaria che porta alla paralisi della coda e degli arti nel topo.

Induzione della paralisi in un modello murino tramite il trasferimento di cellule Th17 specifiche per l'acquaporina-4

Questo video dimostra il processo di valutazione della disfunzione motoria in un modello murino attraverso la somministrazione della tossina della pertosse e di un inoculo contenente peptidi e adiuvanti che imitano la mielina, seguiti da test su tapis roulant per valutare la funzione motoria e valutare il danno nervoso risultante dovuto all'attivazione immunitaria e alla demielinizzazione.

Valutazione della funzione motoria in un modello murino sperimentale di neurite autoimmune

Descriviamo un metodo per impiantare e mantenere finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Queste finestre forniscono un accesso ottico cronico al midollo spinale per il monitoraggio della dinamica cellulare a livello subcellulare in animali vivi utilizzando la microscopia a due fotoni.

Impianto di finestre in vetro del midollo spinale in topi adulti con encefalomielite autoimmune sperimentale

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.

Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological

Test basati su celle è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare l'immunoglobulina del siero anti-acquaporina-4 G. Questo metodo potrebbe essere applicato a diagnosi clinica e ricerche scientifiche di neuromielite ottica dello spettro autistico.

Rilevamento di immunoglobulina Anti-acquaporina-4 G di siero umano dall'analisi Cell-based

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

Scopri come indurre malattie autoimmuni del SNC mediante il trasferimento di cellule T specifiche per AQP4 nei topi. Questo metodo consente di monitorare le lesioni retiniche con la tomografia a coerenza ottica in modo non invasivo.

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4 (Video) | JoVE Journal

Induzione di paralisi e di lesioni del sistema visivo in topi da specifiche cellule T per neuromielite ottica Autoantigen acquaporina-4

Esplora altri video