Name: Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Impara il protocollo ChIP per campioni embrionali a bassa abbondanza di pollo. Questo metodo consente di analizzare i profili di modificazioni istoniche e migliorare l'annotazione funzionale dei genomi dei vertebrati.

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Gli autori ringraziano Jan Appel per la sua eccellente assistenza tecnica durante l'istituzione del presente protocollo. Lavoro in laboratorio Rada-Iglesias è supportato da CMMC intramurale finanziamenti, sovvenzioni di ricerca DFG (2547/1-1 RA, RA 2547/2-1 e TE 1007/3-1), il ricercatore avanzato UoC gruppo Grant e la concessione di CECAD.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun interesse finanziari concorrenti per essere comunicati.

Epigenomic profilatura di modifica dell'istone utilizzando ChIP-seq può essere utilizzato per migliorare l'annotazione funzionale dei genomi di vertebrati in diversi contesti cellulari4,5,18. Questi profili di epigenomic possono essere utilizzati, tra le altre cose, per identificare gli elementi enhancer, per definire lo stato normativo di esaltatori di (cioè, attivo, innescato, o in bilico) e per definire regolatori di...

Modificazioni post-traduzionali degli istoni sono direttamente coinvolti nei vari processi di cromatina-dipendenti, compreso trascrizione, replicazione e DNA riparazione1,2,3. Inoltre, modificazioni istoniche differenti mostrano positivi (ad es., H3K4me3 e H3K27ac) o negativo (ad es., H3K9me3 e H3K27me3) correlazioni con espressione genica e possono essere definiti largamente come attivante o repressivo dell'istone segna, rispettivamente di2,3. Di conseguenza, mappe di modifica globale dell'istone, noto anche come epigenomic mappe, sono emersi come strumenti potenti e universali per annotare funzionalmente i genomi di vertebrati4,5. Ad esempio, sequenze regolatrici distale come rinforzatori possono essere identificati in base la presenza di firme di cromatina specifici (ad es., esaltatori di attivo: H3K4me1 e H3K27ac), che li distinguono dalle regioni promotore prossimale (per esempio, promotori attivi: H3K4me3)6,7,8. D'altra parte, i geni con funzioni di regolamentazione di identità delle cellule principali si trovano tipicamente con domini di cromatina ampio contrassegnati con H3K4me3 o H3K27me3, a seconda dello stato trascrizionalmente attivo o inattivo dei geni sottostanti, rispettivamente9 ,10. Allo stesso modo, l'espressione di geni di identità delle cellule principali sembra essere controllato frequentemente dal multiplo e spazialmente cluster rinforzatori (cioè, Super-rinforzatori), che possono essere identificati come vasto H3K27ac-contrassegnato domini11.
Attualmente, istone modifica mappe vengono generate utilizzando la tecnologia ChIP-seq, che rispetto alle precedenti approcci come ChIP-chip (ChIP accoppiato ai microarray) fornisce maggiore risoluzione, meno artefatti, meno rumore, copertura superiore e inferiore Costa12. Tuttavia, la generazione di mappe di epigenomic utilizzando la tecnologia ChIP-seq ha i suoi limiti intrinseci, principalmente connesse con la capacità di eseguire correttamente il ChIP nei campioni di interesse. Protocolli di ChIP tradizionali in genere necessari milioni di cellule, che limitano l'applicabilità di questo metodo al cellulare in vitro linee o cellule che può essere facilmente isolato in vivo (ad esempio, cellule del sangue). Negli ultimi anni, un numero di protocolli di ChIP modificate compatibile con numeri di cellulare bassa è stati descritti13,14,15,16. Tuttavia, questi protocolli sono progettati specificamente per essere accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) e che in genere utilizzano hoc biblioteca preparazione metodi13,14, 15 , 16.
Qui, abbiamo descritto un protocollo di ChIP che può essere utilizzato per analizzare i profili di modifica dell'istone utilizzando numeri di basso a intermedio delle cellule (5 x 104 - 5 x 105 cellule) sia selezionato loci (cioè, ChIP-qPCR) o a livello globale (cioè, ChIP-seq) (Figura 1). Quando accoppiato alla tecnologia ChIP-seq, il nostro protocollo di ChIP può essere utilizzato insieme ai metodi di preparazione della libreria standard, rendendo così largamente accessibile a molti laboratori10. Questo protocollo è stato utilizzato per indagare parecchi contrassegni istone (ad es., H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) in tessuti embrionali di pollo diversi (ad es., tubo neurale spinale (SNT), frontonasale protuberanze ed epiblasto). Tuttavia, possiamo anticipare che dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altri organismi in cui biologicamente e/o clinicamente rilevanti campioni possono essere ottenuti solo in basse quantità.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA in polvere</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Tampone salino fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-desossicolato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroilsarcosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Proteina G / perle magnetiche</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasi</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-butirrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Inibitore della proteinasi</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb ladder</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Ottilfenolo etossilato (Triton X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Punte di caricamento gel Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Piastre</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>provette da 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &; L Punte filtranti</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &; L Punte filtranti</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &; L Punte filtranti</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0,5 - 10 &; L Punte del filtro</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Perline paramagnetiche</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di risospensione</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Tailing Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di legatura</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Indici dell'adattatore RNA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Stop Ligation Buffer</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di primer per PCR</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Miscela PCR potenziata</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Scala del DNA genomico</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di eluizione</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per campioni</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> <td>di quantificazione della libreriaKapa Biosystems</td><td>KK4835 - 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Uova bianche di gallina fertile</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>Ago (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear sonda sonicatore Sonicator</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Volume variabile (5 &ndash; 1.000 &mu; L) pipette</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Roteatrice da tavolo</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Cycler per PCR in tempo reale</td><td>Roche</td><td>Light Cycler; Serial Nr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di controllo qualità DNA e RNA</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation System</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio perforato</td> World <td>precision</td><td>instruments 501997</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo di immunoprecipitazione (chip) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica ampiamente utilizzata per il mapping la localizzazione di istoni traduzionalmente modificati, varianti dell'istone, fattori di trascrizione o enzimi modificanti la cromatina a un dato locus o su una scala di genoma. La combinazione di analisi di ChIP con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-Seq) è un approccio potente per scoprire globalmente reti di regolazione genica e migliorare l'annotazione funzionale di genomi, soprattutto di non-codificazione di sequenze regolatrici. Protocolli di chIP normalmente richiedono grandi quantità di materiale cellulare, così precludendo l'applicabilità di questo metodo a investigare di tipi di cellule rare o le biopsie del tessuto piccolo. Al fine di rendere l'analisi del ChIP compatibile con la quantità di materiale biologico che in genere possa essere ottenuto in vivo durante l'embriogenesi dei vertebrati precoce, descriviamo qui un protocollo semplificato di ChIP in cui il numero di passaggi necessari per completare la analisi sono state ridotte per minimizzare la perdita di campione. Questo protocollo di ChIP è stato usato con successo per studiare le modificazioni istoniche differenti in vari pollo embrionale e tessuti di topo adulto utilizzando bassa ai numeri delle cellule medie (5 x 104 - 5 x 105 cellule). D'importanza, questo protocollo è compatibile con la tecnologia ChIP-seq utilizzando metodi di preparazione di libreria standard, fornendo così globale epigenomic mappe in tessuti embrionali altamente pertinenti.

Per illustrare le prestazioni del nostro protocollo di ChIP, abbiamo effettuato esperimenti utilizzando pool SNT sezioni da embrioni di pollo HH19, protuberanze maxillary della HH22 pollo embrioni ed embrioni di pollo di fase-HH3 per indagare i profili di associazione di ChIP-seq varie modifiche dell'istone (cioè, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 e H3K27me3). Una volta che sono stati ottenuti ChIP "DNAS", l'efficienza di sonicazione è stata valutata tramite l'elettroforesi del gel dell'...

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare i profili di legame di diverse modificazioni istoniche, utilizzando campioni embrionali a bassa abbondanza al fine di migliorare l'annotazione funzionale dei genomi dei vertebrati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali sono i potenziatori chiave e i geni che definiscono l'identità di un particolare tessuto embrionale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che richiede una quantità limitata di materiale particolare e può essere utilizzata sia per l'analisi specifica locale che per l'analisi dell'intero genoma.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della trascrizione o sull'eterogeneità cellulare con i tessuti embrionali, può essere applicato anche ad altri sistemi come i campioni di brevetti. Per ottenere lo stadio HH19, embrioni di pollo per questo esperimento, incubare uova fertili di gallina bianca livornese con orientamento orizzontale a 37 gradi Celsius e 80% di umidità per tre giorni. Per iniziare a isolare gli embrioni HH19, rendili accessibili estraendo tre millilitri di albumina con una siringa da 1

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La differenziazione del Comitato coincide con cellule di tipo specifici cambiamenti nella struttura e nella composizione della cromatina. La rilevazione di questi cambiamenti fornisce preziose informazioni sui meccanismi che definiscono stemcellness e differenziazione cellulare. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) rappresenta un metodo valido per analizzare i meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule staminali.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

Un regolamento messa a punto della trascrizione genica alla base embrionali decisione destino della cellula. Qui, descriviamo immunoprecipitazione della cromatina utilizzati per indagare regolazione epigenetica di entrambi differenziazione cardiaca delle cellule staminali e sviluppo cardiaco di embrioni di topo.

Regolazione epigenetica del Cardiac differenziazione delle cellule staminali embrionali e Tessuti

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Impara il protocollo ChIP per campioni embrionali a bassa abbondanza di pollo. Questo metodo consente di analizzare i profili di modificazioni istoniche e migliorare l'annotazione funzionale dei genomi dei vertebrati.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

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