Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare i profili di legame di diverse modificazioni istoniche, utilizzando campioni embrionali a bassa abbondanza al fine di migliorare l'annotazione funzionale dei genomi dei vertebrati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali sono i potenziatori chiave e i geni che definiscono l'identità di un particolare tessuto embrionale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che richiede una quantità limitata di materiale particolare e può essere utilizzata sia per l'analisi specifica locale che per l'analisi dell'intero genoma.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della trascrizione o sull'eterogeneità cellulare con i tessuti embrionali, può essere applicato anche ad altri sistemi come i campioni di brevetti. Per ottenere lo stadio HH19, embrioni di pollo per questo esperimento, incubare uova fertili di gallina bianca livornese con orientamento orizzontale a 37 gradi Celsius e 80% di umidità per tre giorni. Per iniziare a isolare gli embrioni HH19, rendili accessibili estraendo tre millilitri di albumina con una siringa da 10 millimetri per abbassare il blastoderma.

Per rimuovere le membrane embrionali in eccesso, utilizzare le forbici sottili per creare una piccola apertura nell'occhio. Aggiungere un millilitro di soluzione di serratura. Con l'aiuto di un ago piegato, aggiungere 0,5 millilitri di inchiostro nero di china.

Usa forbici chirurgiche e pinze sottili per tagliare la membrana embrionale extra che circonda l'embrione. Quindi, trasferire l'embrione con un cucchiaio perforato in una capsula di Petri da 4,5 centimetri contenente 20 millilitri di soluzione di PBS. Lavorando sul ghiaccio con uno stereomicroscopio, usa forbici sottili e pinze per sezionare e scartare l'amnio e le parti rimanenti della membrana extra embrionale.

Quindi, tagliare il tubo neurospinale trasverso o il segmento SNT a livello brachiale dell'embrione. Estendere la dissezione caudalmente nella regione toracica per isolare il SNT. Per finire, usa una pinza per rimuovere i tessuti che circondano lateralmente e ventralmente l'SNT.

Dopo aver isolato gli SNT, immergere ogni segmento in una capsula di Petri da 3,5 centimetri contenente tripsina calda a 37 gradi Celsius. Quando l'allentamento dei tessuti non neuronali attorno all'SNT è visibile al microscopio stereoscopico, trasferire i campioni in 1x PBS freddo. Per fermare la tripsinizzazione, trasferire i campioni in una nuova piastra con DMEM freddo contenente il 10% di FBS.

Usa una pinza per rimuovere manualmente i restanti tessuti mesenchimali ed ectodermici dall'SNT. Trasferisci questa sezione SNT pulita in una provetta da 1,5 millilitri e congelala in azoto liquido. Successivamente, omogeneizzare il tessuto secondo il protocollo di testo.

Aggiungere 13,5 microlitri di formaldeide al 37% e incubare a temperatura ambiente su un rotatore per 15 minuti. Per estinguere la formaldeide, aggiungere 25 microlitri di glicina molare da 2,5 molari alla provetta e incubare a temperatura ambiente su un rotatore per 10 minuti. Centrifugare la provetta e poi lavare il pellet secondo il protocollo di testo.

Dopo la reticolazione, risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di lisi ghiacciato e completo mediante pipettaggio. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius su una piattaforma a dondolo per 10 minuti. Quindi, sonicare i campioni a quattro gradi Celsius.

Dopo la sonicazione, centrifugare i campioni a 16.000 x G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire il surnatante o il lisato in una provetta fresca da 1,5 millilitri e gettare il pellet di detriti cellulari. Diluire il lisato secondo il protocollo di testo.

Quindi, conservare una piccola aliquota di ciascun campione come controllo di input e congelare a 20 gradi Celsius. Incubare i campioni rimanenti che saranno sottoposti a precipitazione della cromatina o chippare con anticorpi appropriati secondo il protocollo di testo. Quindi, aggiungere 300 microlitri di cromatina legata agli anticorpi alle perle magnetiche precedentemente lavate.

Capovolgere le provette per mescolare i campioni. Per legare gli anticorpi alle perle, posizionare le provette su un rotatore di provette e ruotarle verticalmente a quattro gradi Celsius per un minimo di quattro ore. Per lavare le perle legate alla cromatina, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio RIPA ghiacciato al tubo tenuto sul ghiaccio e mescolare capovolgendo o muovendo il tubo.

Dopo aver posizionato il tubo nel supporto magnetico a temperatura ambiente, attendere che le perline si depositino sul lato. Versare il liquido limpido e ripetere questo lavaggio altre tre volte. Dopo aver aggiunto un millilitro di cloruro di sodio TE 50 millimolare alla provetta, trasferire le perle legate alla cromatina in questa soluzione in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 millimetri.

Posizionare il tubo nel supporto magnetico e, quando le perline si sono depositate, versare il liquido. Quindi, centrifugare le perle a 900 x G a quattro gradi Celsius per tre minuti in una centrifuga pre-raffreddata. Dopo che le perle sono state depositate nel supporto magnetico, rimuovere tutto il TE rimanente utilizzando una punta di caricamento in gel.

Lavorando a temperatura ambiente, aggiungere 210 microlitri di tampone di eluizione alle perle e risospendere con un colpo. Incubare la provetta in un blocco termico preriscaldato a 65 gradi Celsius per 15 minuti, agitando. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette con le perle a 16.000 x G a temperatura ambiente, per un minuto.

Una volta che le perle si sono depositate nel supporto magnetico, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Scongelare il campione di controllo in ingresso precedentemente congelato da 20 gradi Celsius a temperatura ambiente. Aggiungere 90 microlitri di tampone di eluizione al campione e mescolare agitando brevemente.

Per invertire i legami incrociati, incubare il chip e controllare i campioni a 65 gradi Celsius durante la notte. Lavorando a temperatura ambiente, aggiungere un volume di tampone TE per provetta e capovolgere per mescolare. Per digerire l'RNA, aggiungere l'RNAsi A al controllo e chippare i campioni a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro e capovolgere le provette per mescolare.

Incubare le provette in un blocco termico preriscaldato a 37 gradi Celsius per due ore. Per digerire la proteina per la successiva purificazione del DNA, aggiungere la proteasi K a una concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro nelle provette e capovolgere le provette per mescolare. Incubare le provette in un blocco termico preriscaldato a 55 gradi Celsius per due ore.

Estrarre e purificare il DNA secondo i materiali supplementari. Questo DNA può ora essere utilizzato per la PCR quantitativa e la preparazione di librerie di ricerca su chip. L'efficienza di sonicazione, essenziale per il successo di un chip, è confermata dall'elettroforesi su gel di agarosio dei campioni di controllo in ingresso.

In questo esempio, utilizzando il tubo neurale spinale di pollo o le sezioni SNT, sono stati utilizzati 11 cicli di sonicazione per ottenere una dimensione ottimale del frammento compresa tra 200 e 500 coppie di basi. Il DNA scheggiato è stato analizzato mediante PCR quantitativa per misurare i livelli di arricchimento dei marcatori istonici attivanti e repressivi attorno alle regioni promotrici dei geni attivi e inattivi nel SNT del pollo. Ciò dimostra che è possibile valutare la qualità del chippato quantificando solo alcuni lati bassi senza perdere molto DNA per ulteriori analisi.

Dopo che le librerie di ricerca del chip sono state preparate in sequenza, viene mostrata una locusta rappresentativa per i dati di ricerca del chip di trimetilazione H3K27 e H3K4 generati nella SNT del pollo. Profili di ricerca di chip simili sono stati generati con successo anche in diversi tessuti embrionali di pollo, come le prominenze mascellari e gli embrioni in stadio HH3. Ciò dimostra che qui presentato, il protocollo chip può essere utilizzato per generare profili epigenomici da quantità limitate di vari tessuti embrionali.

Utilizzando questo protocollo per generare i profili di modificazione degli istoni in un tessuto embrionale, è importante ricordare che i segnali proverranno da tutti i diversi tipi di cellule presenti in tale tessuto. Seguendo questo protocollo e utilizzando più materiale biologico di partenza, dovrebbe essere possibile studiare i profili di legame di altre proteine coinvolte nella regolazione trascrizionale, come i fattori di trascrizione, i co-attivatori o le subunità della RNA polimerasi 2. Una volta stabiliti, questi protocolli consentiranno ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo o della genetica medica di migliorare l'alterazione funzionale dei genomi dei vertebrati e di acquisire importanti informazioni sulle basi molecolari della miogenesi, dell'evoluzione e delle malattie umane.