Name: Unanalisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dellattività delle cellule NK umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Scopri un saggio di citotossicità basato su citometria a flusso per valutare l'attività delle cellule NK umane. Questo metodo sensibile e rapido offre un'alternativa sicura ai test radioattivi per diagnosi e ricerca.

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Vorremmo ringraziare Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, per la sua assistenza con la preparazione del manoscritto.

I campioni sono stati raccolti secondo le linee guida etiche stabilite dal Programma di Protezione della Ricerca Umana dell'UCLA e approvati dall'IRB.
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Se non diversamente specificato, tutti i reagenti devono essere lasciati equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso. Tutti i reagenti devono rimanere sterili.
<ol>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro 2x di Tween-20 (cioè 0,2%) aggiungendo 10 μL di soluzione Tween-20 a 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio con una pipetta p20.
	<ol>
		<li>Data l'elevata viscosità di Tween-20, adottare le seguenti misure per garantire la precisione: raccogliere lentamente per evitare la formazione di bolle, non immergere l'intero puntale per evitare il carry-over e pipettare su e giù più volte in PBS per lavare via tutto Tween-20 dal puntale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di soluzione madre di IL-2 (2,1E6 UI/mL) a 198 μL di terreno completo (cioè diluizione 1:100), che è RPMI con l'1% di penicillina-streptomicina e il 10% di siero fetale bovino (FBS), quindi procedere a un'ulteriore diluizione 1:100 aggiungendo 2 μL di soluzione intermedia di IL-2 a 198 μL di terreno completo per preparare una soluzione di lavoro 7x (210 UI/mL).</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di soluzione madre di CFSE (5 mM) a 500 μL di terreno semplice (RPMI). Vortex, centrifugare verso il basso per rimuovere le gocce dal tappo, quindi procedere con un'ulteriore diluizione 1:20 aggiungendo 50 μl della soluzione intermedia CFSE a 950 μl di RPMI semplice per ottenere una soluzione di lavoro 2x di 1 μM. Vorticare bene e proteggere dalla luce.</li>
</ol>
2. Isolamento delle PBMC come cellule effettrici
NOTA: Questo test è stato convalidato per l'uso efficace con PBMC totali da controlli sani. Tuttavia, si raccomanda di verificare il contenuto di cellule NK con ogni preparazione di PBMC (Figura 1). Inoltre, il volume di sangue intero per la raccolta si basa sulla frequenza delle cellule NK nel sangue intero periferico e questo può variare da persona a persona, in particolare tra donatori sani e pazienti.
<ol>
	<li>Raccogliere un minimo di 4 ml di sangue intero umano in provette per la raccolta del sangue eparinizzato di sodio o litio. Conservare i campioni di sangue a temperatura ambiente al momento della raccolta e utilizzarli entro 30 ore dalla raccolta.</li>
	<li>Diluire il sangue intero con 4 mL di PBS (cioè uguale volume di PBS al sangue intero).</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di soluzione a gradiente di densità (vedere la tabella dei materiali) in una provetta conica da 15 mL. Sovrapporre con cura il sangue intero diluito sulla soluzione del gradiente di densità inclinando la provetta.</li>
	<li>Centrifugare a 650 x g per 24 min con il freno disinserito.</li>
	<li>Raccogliere con cura lo strato di cellule mononucleate, che è il sottile strato bianco sotto lo strato superiore di plasma e piastrine, in una nuova provetta conica da 15 ml. Portare il volume a 15 ml con PBS.</li>
	<li>Centrifugare a 450 x g per 10 min con il freno tirato. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 0,5 mL di terreno completo.</li>
	<li>Utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro per contare le cellule e regolare la concentrazione di PBMC a 5x106 cellule/mL con terreno completo.</li>
	<li>Controllare il contenuto di cellule NK mediante citometria a flusso (vedere passaggio 4).</li>
	<li>Iniziare il test entro 30 minuti. Mantenere le cellule a temperatura ambiente per un massimo di 10 minuti o metterle in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C fino al momento dell'uso.</li>
</ol>
3. Isolamento delle cellule NK come cellule effettrici
NOTA: Questa parte del protocollo è un'alternativa all'utilizzo di PBMC totali come cellule effettrici. La resa tipica di 4 ml di sangue intero da un individuo sano è di circa 4x105 cellule NK, o circa il 5-15% delle PBMC, anche se questa frequenza varia tra i donatori 21. Si raccomanda di eseguire un controllo della purezza dopo l'isolamento.
<ol>
	<li>Raccogliere un minimo di 4 ml di sangue intero umano in provette per la raccolta del sangue eparinizzato di sodio o litio. Prelevare 50 μL di sangue intero da colorare come campione di pre-arricchimento.</li>
	<li>Aggiungere il cocktail di arricchimento a campioni di sangue a 50 μL/mL (vedere la tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di PBS + 2% FBS per diluire il campione e mescolare delicatamente bene.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di soluzione a gradiente di densità in una provetta conica da 15 mL. Sovrapporre con cura il campione diluito sopra il mezzo del gradiente di densità.</li>
	<li>Centrifugare a 1.200 x g per 10 min con il freno disinserito.</li>
	<li>Raccogliere con cura lo strato di cellule arricchite in una nuova provetta conica da 15 mL. Lavare le cellule portando il volume fino a 50 mL con PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 10 min. Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 0,5 mL di terreno completo.</li>
	<li>Utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro, contare le cellule e regolare la concentrazione a 5x105 cellule/mL. Prelevare 50 μl di sospensione cellulare purificata per colorare come campione post-arricchimento.</li>
	<li>Conservare le celle a temperatura ambiente per un massimo di 10 minuti o collocarle in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C fino al momento dell'uso.</li>
</ol>
4. Immunofenotipizzazione per la valutazione del contenuto di cellule NK
<ol>
	<li>Utilizzando 50 μL di PBMC isolate totali, sangue intero pre-arricchimento o cellule NK purificate, colorare con anticorpo coniugato con fluorocromo anti-CD56 come marcatore di cellule NK. Possono essere inclusi anche marcatori per altri tipi di cellule e lignaggi (ad esempio cellule T CD3+, cellule B CD19+) per valutare l'origine dell'eventuale contaminazione.</li>
	<li>Incubare per 20 minuti a 4 °C e lavare aggiungendo 2 mL di PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Centrifugare a 450 x g per 5 min.</li>
	<li>Per le PBMC o le cellule NK, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Per i campioni di sangue intero, eseguire la lisi dei globuli rossi (RBC):
	<ol>
		<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere in 2 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (31,75 g di cloruro di ammonio + 4,16 g di Tris base + 6,65 g di EDTA, disciolto in 5000 mL di acqua deionizzata).</li>
		<li>Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ripetere il lavaggio due volte, aspirare il surnatante e risospendere il campione lisato in 100 μl di PBS + 2% FBS. 
		NOTA: La lisi dei globuli rossi può essere eseguita anche prima della colorazione.</li>
		<li>Procedere con l'analisi citofluorimetrica.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Scongelamento, coltura e raccolta delle cellule bersaglio K562
<ol>
	<li>Aliquotare 10 mL di terreno completo in una provetta conica da 15 mL e lasciarla riscaldare a bagnomaria a 37 °C. Per lo scongelamento e la coltura delle cellule K562, utilizzare solo terreni preriscaldati a 37 °C per tutte le fasi.</li>
	<li>Mettere un flaconcino di cellule K562 congelate nel bagnomaria a 37 °C fino a quando la maggior parte di essa non è scongelata.</li>
	<li>Trasferire le cellule K562 semi-scongelate nel terreno completo, preriscaldato a 37 °C, nella provetta conica da 15 mL. Lavare l'interno della fiala criogenica con alcuni terreni preriscaldati e aggiungere il lavaggio alla provetta da 15 ml.</li>
	<li>Centrifugare a 140 x g per 7 min con il freno inserito. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo.</li>
	<li>Aliquotare una quantità appropriata di sospensione cellulare per contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.</li>
	<li>Regolare la concentrazione a 1x10 5-2x105 cellule/mL e coltivare in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per almeno 2 giorni prima dell'uso. Mantenere la coltura a questo intervallo di densità per non più di 3 mesi, quindi scongelare una nuova aliquota. Non superare mai una concentrazione cellulare di 1x106 cellule/mL in coltura.</li>
	<li>Per l'uso nel test, miscelare il pozzetto di coltura cellulare K562 con una pipetta sierologica da 10 ml e rimuovere un'aliquota per contare e valutare la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro e la colorazione Trypan Blue.
	<ol>
		<li>Se la vitalità è inferiore all'85%, procedere con i seguenti passaggi per la rimozione delle cellule morte.
		<ol>
			<li>Se necessario, aggiungere 15 mL di soluzione a gradiente di densità a provette coniche da 50 mL. Raccogliere tutte le cellule dalla coltura e sovrapporre lentamente la sospensione cellulare sulla soluzione del gradiente di densità inclinando la provetta.</li>
			<li>Centrifugare a 650 x g per 24 minuti con freno spento. Raccogliere con cura lo strato di cellule vive in una nuova provetta conica da 15 mL. Portare il volume a 50 ml con PBS.</li>
			<li>Centrifugare a 450 x g per 10 min con il freno tirato. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo. Contare le cellule e controllare la vitalità delle cellule (come in 5.7).</li>
			<li>Coltura in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per almeno 2 giorni prima dell'uso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccogliere 5x105 cellule bersaglio K562 e centrifugare a 140 x g per 7 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 500 μl in terreno con l'1% di FBS.</li>
</ol>
6. Etichettatura delle cellule bersaglio K562
NOTA: Assicurati che le celle K562 siano ben risospese prima di aggiungere la soluzione di lavoro CFSE.
<ol>
	<li>Pipettare 500 μl della soluzione di lavoro CFSE nei 500 μl di cellule K562 per una concentrazione finale di 0,5 μM. Utilizzando lo stesso puntale da 1000-1250 μl, miscelare immediatamente pipettando delicatamente su e giù 3-5 volte.</li>
	<li>Incubare in bagnomaria a 37 °C o in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per 10 minuti al buio. 
	NOTA: Poiché il tempo di ritardo di equilibratura della temperatura nell'incubatore è più lungo rispetto al bagno d'acqua, potrebbe essere necessario regolare il tempo di incubazione soprattutto per volumi > 1 ml.</li>
	<li>Spegnere la reazione di marcatura con 10 mL di terreno completo per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare le cellule K562 marcate a 140 x g per 7 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 mL di terreno completo.</li>
	<li>Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro e portare la concentrazione a 1x105 cellule/mL in terreno completo.</li>
	<li>Porre le cellule in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C fino al momento dell'uso. Le celle possono essere conservate a temperatura ambiente per un massimo di 10 minuti o in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C fino al momento dell'uso. Non conservare in frigorifero.</li>
</ol>
7. Placcatura
NOTA: Se le cellule NK sono limitanti, la concentrazione di entrambe le cellule K562 e NK può essere dimezzata, in modo che metà delle cellule vengano piastrate nel test. Il test produce risultati comparabili con la metà della quantità di cellule (a condizione che i rapporti siano mantenuti coerenti).
<ol>
	<li>Se si utilizzano PBMC totali, etichettare una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti, con fondo a U, per le seguenti condizioni per pozzetto: (1) Effettore (E) : Bersaglio (T) = 50 : 1 + IL-2 - controllo positivo per la citotossicità delle cellule NK; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - solo cellule bersaglio - controllo negativo per la morte di K562; (7) E - solo celle effettrici; (8) T + Tween - Controllo positivo per la morte di K562</li>
	<li>Se si utilizzano cellule NK purificate, etichettare una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti, fondo U, per le seguenti condizioni per pozzetto: (1) Effettore (E) : Bersaglio (T) = 5: 1 + IL-2 - controllo positivo per la citotossicità delle cellule NK; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625: 1; (6) T - solo cellule bersaglio - controllo negativo per la morte di K562; (7) E - solo celle effettrici; (8) T + Tween - controllo positivo per la morte di K562</li>
	<li>Aggiungere 100 μl di terreno completo alle condizioni 3, 4, 5, 6, 7. Per questo e per tutti i passaggi successivi, (consigliato) utilizzare una pipetta multicanale.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di cellule effettrici (PBMC a 5x106 cellule/mL o cellule NK purificate a 5x105 cellule/mL) alle condizioni 1, 2, 3. Aggiungere celle effettrici per le condizioni 4-7 mediante diluizione seriale. Non cambiare le punte da una condizione all'altra.
	<ol>
		<li>Miscelare la condizione 3, prelevare 100 μL e trasferire alla condizione 4.</li>
		<li>Miscelare la condizione 4, prelevare 100 μl e trasferire alla condizione 5.</li>
		<li>Miscelare la condizione 5, prelevare 100 μL e trasferire alla condizione 7; La condizione 6 non ha cellule effettrici.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro preparata 2x 0,2% Tween alla condizione 8 (concentrazione finale: 0,1% Tween-20); la condizione 8 non ha celle effettrici.</li>
	<li>Aggiungere 30 μL di soluzione di lavoro IL-2 alla condizione 1. L'IL-2 deve essere aggiunta alla sospensione di cellule effettrici prima dell'aggiunta della sospensione di cellule bersaglio (concentrazione finale: 27 UI/mL).</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di cellule bersaglio (cellule K562 marcate a 1x105 cellule/mL) alle condizioni 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. La condizione 7 non ha cellule bersaglio.</li>
	<li>Miscelare tutti i pozzetti con una pipetta multicanale e centrifugare la piastra a 120 x g per 2 minuti.</li>
	<li>Incubare in un incubatore umidificato a CO2 a 37 °C per 4 ore. Al termine dell'incubazione, posizionare la piastra sul ghiaccio e procedere alla colorazione di vitalità entro 30 minuti.</li>
</ol>
8. Colorazione per la vitalità e l'acquisizione
<ol>
	<li>Preparare la colorazione delle cellule morte (vedere la tabella dei materiali) aggiungendo 3 μl della soluzione madre da 5 μM a 600 μl di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl di colorante di cellule morte diluite a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 250 μl e una concentrazione finale di 0,005 μM. Mescolare bene con una pipetta multicanale.</li>
	<li>Procedere con l'analisi citofluorimetrica. Utilizzando un citometro a flusso, raccogli almeno 1.000 eventi nel cancello della cellula target (Figura 2) per ottenere risultati statisticamente significativi.</li>
</ol>

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<li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li>
<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse finanziario.

Il metodo qui descritto fornisce un'alternativa semplice e conveniente per il test di rilascio di Cr tradizionale 51per valutare l'attività citotossica delle cellule NK. Questo metodo è sensibile, riproducibile e richiede meno tempo rispetto ai metodi standard precedenti, come CRA e può essere usato per entrambi clinici e applicazioni di ricerca.
Mentre il dosaggio funziona sia con totale PBMCs e arricchito le cellule NK, l'opzione per utilizzare PBMCs senza la necessità di purifica...

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<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

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Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Cellule natural killer (NK) sono un sottoinsieme sofisticato dei linfociti umani innati criticamente coinvolti nell'eliminazione delle cellule infettate viralmente, cellule trasformate e altri patogeni minacce 1,2. Granuli litici delle cellule di NK casa proteine citotossiche, come perforine e granzimi. Al momento dell'attivazione, le cellule NK formano una complessa interazione con i loro obiettivi conosciuto come sinapsi immunologica, per cui queste molecole citolitiche localmente vengono rilasciate, con conseguente lisi delle cellule bersaglio diretto e apoptosi, insieme al rilascio di citochine e chemochine e, infine, l'induzione di un infiammatorio stato 1,3,4.
Attivazione delle cellule NK coinvolge una stringa complessa di attivazione e inibitorie interazioni tra NK delle cellule recettori e ligandi espressi sulla superficie delle cellule bersaglio, formando un sistema strettamente regolato. Uno dei più studiati meccanismi di attivazione delle cellule NK è il "sé mancante". Infatti, mancanza di rilevazione di classe che maggiore istocompatibilità (MHC), o umano del leucocita (HLA) l'antigene molecole, il infetti o trasformato la citotossicità delle cellule NK di cellule trigger. Tumore e cellule infettate da virus generalmente downregulate questi antigeni di fuggire immunità comunicata per cellule di T, diventando così NK primario delle cellule target 1,3,4.
Valutazione della funzione delle cellule NK è principalmente suddivise in degranulazione o citotossicità saggi. Tuttavia, test di degranulazione, quali il rilevamento di cytometric di flusso del marcatore associato degranulazione CD107a, sono indicativi dell'attivazione delle cellule NK e non della loro funzione finale, l'uccisione diretta di destinazione celle 5,6,7,8. Quindi, questa limitazione ha attirato gli investigatori a saggi di citotossicità come un'alternativa più eloquente e più diretto.
Da sempre "gold standard" per la valutazione della attività citotossica cellulo-mediata delle cellule NK e T è il test di rilascio di cromo (CRA). CRA coinvolge radioattivo etichettatura delle cellule bersaglio con 51Cr e co-incubarle con cellule effettrici. Questo test è immersa nel principio che la lisi delle cellule provoca il rilascio di legato alle proteine 51Cr nel surnatante, che può essere misurato contando gamma. Questo test, mentre efficaci, è problematico per una serie di motivi: costi elevati di materiale, manipolazione e smaltimento di radioattivo 51Cr, rilascio spontaneo di 51Cr e difficile standardizzazione - rendendolo del tutto impraticabile 9,10.
Una serie di saggi non radioattivo, che coinvolgono etichettatura fluorescente, rilascio di enzimi e anche bioluminescenza, allora è stata sviluppata come alternative al CRA 11,12,13,14. Descriviamo qui un metodo di basato su citometria di flusso per la misura di attività delle cellule NK citotossica sulle cellule bersaglio K562 che è semplice, sensibile e riproducibile. Le cellule K562 sono una cellula umana eritroleucemiche linea con riduzione dell'espressione di molecole HLA di classe I ed espressione intensificata di ligandi per recettori NK attivatori, che li rende particolarmente suscettibili a NK Citotossicità cellulo-mediata 15. In questa analisi, le cellule K562 sono pre-etichettate con carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) e co-coltivate a vari rapporti con entrambi cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o purificata di cellule NK 1. CFSE è un colorante fluorescente stabile, legame che consente di discriminazione delle cellule bersaglio da effettore NK cellule 16,17. Dopo la co-incubazione, una macchia di acido nucleico, specificamente che permea la membrana di cellule morte, viene utilizzata per identificare le celle di destinazione ucciso (Vedi tabella dei materiali). I campioni vengono quindi acquisiti su un citometro a flusso per determinare la percentuale di morti (cioè, macchia +) CFSE + cellule bersaglio.
Questa analisi può essere usata come uno screening diagnostico per malattie monogenici difetti che interessano il compartimento cellulare NK, di cui ci sono circa 30 difetti noti causando carenza di cellule NK o funzionale o classica, e per il lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secondario. È anche utile indagare l'attività delle cellule NK in pazienti con infezioni virali da herpes ricorrente, grave, di valutare la ricostituzione immunitaria dopo trapianto di cellule ematopoietiche o post immunomodulatori terapia 18,19,20e per una miriade di applicazioni di ricerca di base.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (1x, senza Ca2+ e Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>Soluzione madre a 10.000 U/mL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>Liofilizzato da 0,2 &mu; m soluzione filtrata in acetonitrile e TFA con BSA come proteina trasportatrice. Ricostituire con 500 ul a 100 &mu; g/mL in acido acetico sterile 100 mM contenente almeno lo 0,1% di albumina sierica bovina (2,1x10E6 UI/ml)</td></tr><tr><td>K562 Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Linea cellulare tumorale&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiasche per colture cellulari T-75</td><td>Kit di proliferazione cellulare Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Ricostituire la fiala I con 18 ul di DMSO per preparare una soluzione madre da 5 mM. Non congelare/scongelare.</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>La soluzione stock è fornita a 5 &mu; M in 1 mL DMSO. La soluzione DMSO può essere sottoposta a più cicli di congelamento-scongelamento senza degradazione del reagente.</td></tr><tr><td>Provette per prelievo di sangue con eparina di sodio/litio</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo (5 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubo conico in polipropilene</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di reagenti</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di arricchimento di cellule NK umane</td><td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule nk umane

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

All'interno del sistema immunitario innato, linfociti effettori conosciuti come cellule natural killer (NK) svolgono un ruolo essenziale nella difesa dell'ospite contro le cellule aberranti, in particolare eliminando tumorali e cellule infette viralmente. Circa 30 difetti noti monogenici, insieme a una serie di altre condizioni patologiche, causano la mancanza delle cellule NK sia funzionale o classica, che si manifesta ridotta o assente attività citotossica. Storicamente, la citotossicità è stata studiata con metodi radioattivi, che sono ingombranti, costosi e potenzialmente pericolose. Questo articolo viene descritto un metodo di base di cytometry di flusso aerodinamico, clinicamente applicabile per quantificare l'attività citotossica delle cellule NK. In questo saggio, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o preparazioni purificate di cellule NK sono co-incubate a diversi rapporti con una linea cellulare di tumore destinazione conosciuta ad essere sensibili alla citotossicità cellulo-mediata NK (NKCC). Le cellule bersaglio sono pre-etichettate con un colorante fluorescente per permettere la loro distinzione dalle cellule effettrici (cellule NK). Dopo il periodo di incubazione, le cellule bersaglio uccisi sono identificate da una macchia di acido nucleico, che permea in modo specifico le cellule morte. Questo metodo è favorevole alla sia diagnostico e applicazioni di ricerca e, grazie alle funzionalità multi-parametro di citometria a flusso, presenta il vantaggio aggiunto di potenzialmente consentire un'analisi più approfondita del fenotipo delle cellule NK e funzione.

Prima di impostare il dosaggio, si consiglia vivamente che contenuto delle cellule NK essere valutata nella popolazione dell'effettore di scelta. La figura 1 Mostra una tipica colorazione CD56 prima (luce blu) e dopo arricchimento di cellule NK (rosso). Le cellule NK comprendono fino a 15% di PBMCs e devono essere almeno 80% puro dopo arricchimento.
Analisi cytometric di flusso in questo test compor...

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'attività citotossica dei linfociti NK umani. Questo metodo può essere utilizzato per monitorare pazienti affetti da carenza funzionale o classica di cellule NK. I principali vantaggi di questa tecnica basata sulla citometria a flusso sono la sua sensibilità, riproducibilità e velocità rispetto ai metodi standard di valutazione della funzione delle cellule NK, come il saggio di rilascio di cromo radioattivo.Questo metodo può essere utilizzato per testare nuove terapie mirate alle cellule NK, nonché per effettuare analisi multiparametriche in profondità mediante citometria a flusso della biologia delle cellule NK, analisi in precedenza non ottenibili. Iniziare utilizzando una separazione mediante gradiente di densità per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, da campioni di sangue intero seguendo protocolli standard. L'utilizzo di PBMC invece di cellule NK purificate è estremamente vantaggioso quando si lavora con campioni clinici.Diluire le cellule isolate fino a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro in mezzo completo e raccogliere immediatamente le cellule bersaglio K562 mediante centrifugazione. Ri-sospendere cinque volte 10 alla quinta cellule 562 in 500 microlitri di mezzo fresco integrato con l'uno percento di FBS. Etichettare quindi le cellule bersaglio con 500 microlitri di soluzione working di CFSE e mescolare delicatamente la sospensione cellulare aspirando e dispensando da tre a cinque volte con una pipetta.Dopo 10 minuti a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce, arrestare la reazione di marcatura con 10 millilitri di mezzo completo per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di arresto, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere la popolazione di cellule bersaglio marcate in un millilitro di mezzo completo per il conteggio. Successivamente, diluire le cellule a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro di mezzo completo fresco e posizionare le cellule bersaglio in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica.Per un saggio di successo, ridurre al minimo lo stress delle cellule bersaglio e testare le cellule effettrici il più presto possibile dopo il prelievo. Entro 30 minuti dall'etichettatura delle cellule bersaglio, etichettare una piastra da coltura tissutale a 96 pozzetti a fondo rotondo secondo la tabella. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di mezzo completo ai pozzetti con rapporto cellule effettrici su cellule bersaglio di 25:1, 12,5:1 e 6,25:1, ai pozzetti contenenti solo cellule bersaglio e ai pozzetti contenenti solo cellule effettrici.Aggiungere 100 microlitri di cellule effettrici nei pozzetti di controllo della citotossicità e nei pozzetti con rapporto di 50:1 e 25:1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio. Successivamente, partendo dal pozzetto con rapporto 25:1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio, trasferire 100 microlitri di cellule nel pozzetto con il successivo rapporto cellulare più basso per i successivi due pozzetti, saltando i pozzetti contenenti solo cellule bersaglio, mescolando accuratamente dopo ogni trasferimento cellulare e aggiungendo gli ultimi 100 microlitri di cellule nei pozzetti contenenti solo cellule effettrici. Aggiungere 100 microlitri di soluzione lavorata 2X allo 0,2 percento di Tween nei pozzetti di controllo positivo della morte cellulare K562 contenenti solo Tween.Aggiungere 30 microlitri della soluzione di lavoro del vial due alle pozzette di controllo positivo per la citotossicità delle cellule NK. Successivamente, aggiungere una volta 10 alla quinta cellule bersaglio K562 marcate per millilitro in 100 microlitri di mezzo completo in tutte le pozzette, eccetto quelle contenenti solo cellule effettrici. Una volta piastrati tutti i campioni, mescolare tutte le pozzette con la pipetta multicanale.Centrifugare brevemente le cellule e posizionare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari per quattro ore. Al termine dell'incubazione, mettere la piastra sul ghiaccio o su una superficie fredda e aggiungere 50 microlitri di colorante per cellule morte appena preparato in ogni pozzetto. Quindi mescolare delicatamente tutti i pozzetti ed analizzare le cellule mediante citometria a flusso.L'analisi mediante citometria a flusso di CSFE e del colorante per le cellule morte dopo quattro ore di coltura a freddo, come appena illustrato, rivela che le cellule nei pozzetti contenenti solo cellule bersaglio presentano una morte cellulare pari al 15% o inferiore. Nessun segnale di CSFE viene rilevato nei pozzetti contenenti solo cellule effettrici se la morte cellulare osservata in questi pozzetti è inferiore al cinque percento. Mentre la morte cellulare nei pozzetti di uccisione delle cellule bersaglio mediata da Tween è tipicamente superiore all'85%. In pazienti con un difetto della funzione delle cellule NK si osserva un'attività citolitica ridotta nella maggior parte o in tutti i rapporti testati rispetto a individui sani, dimostrando che le cellule NK di questi pazienti mostrano una riduzione differenziale della citotossicità che si correla con un rapporto decrescente tra cellule effettrici e cellule bersaglio.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei ore e mezza, comprese due ore di preparazione e semina, quattro ore di incubazione e 30 minuti di acquisizione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di preparare le cellule bersaglio ed effettori in parallelo per ridurre al minimo il tempo di attesa tra la preparazione cellulare e l'inizio della co-incubazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'attività citotossica delle cellule NK umane contro cellule bersaglio marcate con fluorocromo mediante citometria a flusso.

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