Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'attività citotossica dei linfociti NK umani. Questo metodo può essere utilizzato per monitorare pazienti affetti da carenza funzionale o classica di cellule NK. I principali vantaggi di questa tecnica basata sulla citometria a flusso sono la sua sensibilità, riproducibilità e velocità rispetto ai metodi standard di valutazione della funzione delle cellule NK, come il saggio di rilascio di cromo radioattivo.

Questo metodo può essere utilizzato per testare nuove terapie mirate alle cellule NK, nonché per effettuare analisi multiparametriche in profondità mediante citometria a flusso della biologia delle cellule NK, analisi in precedenza non ottenibili. Iniziare utilizzando una separazione mediante gradiente di densità per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, da campioni di sangue intero seguendo protocolli standard. L'utilizzo di PBMC invece di cellule NK purificate è estremamente vantaggioso quando si lavora con campioni clinici.

Diluire le cellule isolate fino a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro in mezzo completo e raccogliere immediatamente le cellule bersaglio K562 mediante centrifugazione. Ri-sospendere cinque volte 10 alla quinta cellule 562 in 500 microlitri di mezzo fresco integrato con l'uno percento di FBS. Etichettare quindi le cellule bersaglio con 500 microlitri di soluzione working di CFSE e mescolare delicatamente la sospensione cellulare aspirando e dispensando da tre a cinque volte con una pipetta.

Dopo 10 minuti a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce, arrestare la reazione di marcatura con 10 millilitri di mezzo completo per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di arresto, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere la popolazione di cellule bersaglio marcate in un millilitro di mezzo completo per il conteggio. Successivamente, diluire le cellule a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro di mezzo completo fresco e posizionare le cellule bersaglio in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e cinque percento di anidride carbonica.

Per un saggio di successo, ridurre al minimo lo stress delle cellule bersaglio e testare le cellule effettrici il più presto possibile dopo il prelievo. Entro 30 minuti dall'etichettatura delle cellule bersaglio, etichettare una piastra da coltura tissutale a 96 pozzetti a fondo rotondo secondo la tabella. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di mezzo completo ai pozzetti con rapporto cellule effettrici su cellule bersaglio di 25:1, 12,5:1 e 6,25:1, ai pozzetti contenenti solo cellule bersaglio e ai pozzetti contenenti solo cellule effettrici.

Aggiungere 100 microlitri di cellule effettrici nei pozzetti di controllo della citotossicità e nei pozzetti con rapporto di 50:1 e 25:1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio. Successivamente, partendo dal pozzetto con rapporto 25:1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio, trasferire 100 microlitri di cellule nel pozzetto con il successivo rapporto cellulare più basso per i successivi due pozzetti, saltando i pozzetti contenenti solo cellule bersaglio, mescolando accuratamente dopo ogni trasferimento cellulare e aggiungendo gli ultimi 100 microlitri di cellule nei pozzetti contenenti solo cellule effettrici. Aggiungere 100 microlitri di soluzione lavorata 2X allo 0,2 percento di Tween nei pozzetti di controllo positivo della morte cellulare K562 contenenti solo Tween.

Aggiungere 30 microlitri della soluzione di lavoro del vial due alle pozzette di controllo positivo per la citotossicità delle cellule NK. Successivamente, aggiungere una volta 10 alla quinta cellule bersaglio K562 marcate per millilitro in 100 microlitri di mezzo completo in tutte le pozzette, eccetto quelle contenenti solo cellule effettrici. Una volta piastrati tutti i campioni, mescolare tutte le pozzette con la pipetta multicanale.

Centrifugare brevemente le cellule e posizionare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari per quattro ore. Al termine dell'incubazione, mettere la piastra sul ghiaccio o su una superficie fredda e aggiungere 50 microlitri di colorante per cellule morte appena preparato in ogni pozzetto. Quindi mescolare delicatamente tutti i pozzetti ed analizzare le cellule mediante citometria a flusso.

L'analisi mediante citometria a flusso di CSFE e del colorante per le cellule morte dopo quattro ore di coltura a freddo, come appena illustrato, rivela che le cellule nei pozzetti contenenti solo cellule bersaglio presentano una morte cellulare pari al 15% o inferiore. Nessun segnale di CSFE viene rilevato nei pozzetti contenenti solo cellule effettrici se la morte cellulare osservata in questi pozzetti è inferiore al cinque percento. Mentre la morte cellulare nei pozzetti di uccisione delle cellule bersaglio mediata da Tween è tipicamente superiore all'85%. In pazienti con un difetto della funzione delle cellule NK si osserva un'attività citolitica ridotta nella maggior parte o in tutti i rapporti testati rispetto a individui sani, dimostrando che le cellule NK di questi pazienti mostrano una riduzione differenziale della citotossicità che si correla con un rapporto decrescente tra cellule effettrici e cellule bersaglio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei ore e mezza, comprese due ore di preparazione e semina, quattro ore di incubazione e 30 minuti di acquisizione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di preparare le cellule bersaglio ed effettori in parallelo per ridurre al minimo il tempo di attesa tra la preparazione cellulare e l'inizio della co-incubazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'attività citotossica delle cellule NK umane contro cellule bersaglio marcate con fluorocromo mediante citometria a flusso.