Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica
19 settembre 2017
Valutazione quantitativa della crescita batterica è essenziale per comprendere la fisiologia microbica come un fenomeno di livello dei sistemi. Un protocollo per la manipolazione sperimentale e un approccio analitico vengono introdotti, per consentire analisi precisa, ad alta velocità di crescita batterica, che è un tema chiave di interesse in biologia dei sistemi.
L'obiettivo generale di questo esperimento è analizzare la crescita batterica con precisione in modo ad alto rendimento. Utilizzando questa procedura, è possibile testare contemporaneamente più terreni o ceppi diversi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi e della microbiologia, come ad esempio quali sono i fattori di determinazione della crescita cellulare.
I principali vantaggi di questa tecnica è che consente ai ricercatori di valutare con precisione i parametri globali del tasso di crescita massimo e della densità di popolazione massima nelle curve di crescita delle cellule batteriche. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su e. Coli, può essere applicato anche ad altri microrganismi come il saggio di crescita e lo screening dei batteri ambientali.
Per iniziare, posiziona cinque provette di vetro sterilizzate con tappi in gomma siliconica, pipette e i ceppi target su un banco pulito. Esporre l'imboccatura del tubo di vetro a un bruciatore bunsen prima di aprire il tappo in gomma siliconica. Esporre il tappo in gomma siliconica alla fiamma dopo aver aperto il tubo, quindi riposizionare leggermente il tappo sul tubo di vetro.
Successivamente, utilizzare la pipetta elettronica e la pipetta sierologica monouso per aggiungere cinque millilitri di M63 a una delle provette di vetro e 4,5 millilitri di M63 ad altre quattro provette. Usa la punta p200 per raccogliere una colonia e inocularla nel tubo di vetro contenente cinque millilitri di M63. Agitare il tubo per creare una sospensione.
Quindi, diluire la soluzione 10 volte trasferendo 0,5 millilitri di questa soluzione in una delle quattro provette contenenti 4,5 millilitri di M63. Ripetere questo processo per i tubi rimanenti. Dopo aver sterilizzato le bocche dei tubi di vetro e i tappi in gomma siliconica, tappare i tubi con i tappi.
Quindi, posizionare le cinque provette in un'incubatrice agitatrice preriscaldata a 37 gradi Celsius e agitarla a 200 giri/min. Incubare la coltura durante la notte o per 10-30 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 1.000 microlitri di M63 a una cuvetta monouso con il p1000.
Posizionare la cuvetta monouso in uno spettrofotometro. Avviare il programma a una lunghezza d'onda fissa di 600 nanometri e misurare il bianco. Spostare i cinque tubi di vetro dall'incubatrice a scuotimento al banco pulito.
Scartare M63 dalla cuvetta monouso e aggiungere 1.000 microlitri di coltura alla stessa cuvetta monouso con il p1000. Quindi, misurare la torbidità ottica della coltura cellulare. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di soluzione sterilizzata di glicerolo al 60% e 750 microlitri della coltura cellulare selezionata in una microprovetta da 1,5 millilitri e mescolare mediante pipettaggio.
Posizionare le restanti nove microprovette nel supporto per microprovette ed erogare 100 microlitri della miscela preparata in ciascuna provetta. Conservare i brodi in congelatore a 80 gradi Celsius. Per configurare il lettore di micropiastre, apri prima il software, apri i protocolli nel task manager e scegli crea nuovo.
Quindi, selezionare il protocollo standard. Aprire la procedura e regolare le impostazioni. Aprire la temperatura impostata e selezionare, incubatrice accesa.
Quindi, impostare la temperatura a 37 gradi Celsius e la pendenza a zero gradi Celsius. Controllare il preriscaldamento prima di continuare con il passaggio successivo. Aprire l'avvio cinetico e impostare il tempo di esecuzione per 24 o 48 minuti, quindi impostare l'intervallo 30 minuti o un'ora.
Apri shake e imposta la modalità shake su lineare. Controllare il tremolio continuo e impostare la frequenza a 567 cpm. Successivamente, aprire la lettura, controllare l'assorbanza, il punto finale/cinetico e i monocromatori.
Impostare la lunghezza d'onda su 600. Infine, fare clic su Convalida per confermare che la procedura è corretta. E fai clic su Salva per salvarlo come nuovo programma per un uso futuro.
Per registrare la crescita in tempo reale, aggiungere circa 25 millilitri di M63 a un serbatoio di reagenti sterilizzato. Quindi, aggiungere 900 microlitri di M63 alle microprovette in preparazione per effettuare diluizioni seriali. Quindi, aggiungi 900 microlitri di M63 allo stock di glicerolo scongelato e al vortice.
Trasferire 100 microlitri della diluizione 10 volte in un'altra microprovetta contenente 900 microlitri di M63 e vortex. Ripetere questo passaggio fino a raggiungere il numero di diluizioni desiderato. A questo punto, riempire i pozzetti sul bordo di una micropiastra sterilizzata a fondo piatto da 96 pozzetti con 200 microlitri di M63, utilizzando una pipetta a otto canali.
Caricare 200 microlitri di ciascun campione diluito nei pozzetti della micropiastra secondo la tabella di riferimento. Per evitare l'allocazione degli strati dovuta al riscaldamento e all'efficienza di semina, non utilizzare mai i pozzetti sul bordo della micropiastra per i campioni e caricare lo stesso campione in più pozzetti in punti diversi della micropiastra. Posizionare la micropiastra a 96 pozzetti sul lettore di piastre.
Apri leggi ora e task manager e scegli il programma. Fare clic su OK per avviare la misurazione. Infine, salva la registrazione come nuovo file sperimentale per l'analisi dei dati.
Di seguito è riportato un esempio di tabella di riferimento creata prima di eseguire l'esperimento. Un pittogramma di 96 pozzetti è stato disegnato come una tabella otto per 12 per indicare le posizioni dei campioni di coltura inoculati sulla piastra da 96 pozzetti. Il tasso di crescita viene calcolato applicando l'equazione per tutte le coppie di valori consecutivi di OD600.
La media e la deviazione standard di cinque tassi di crescita consecutivi sono state calcolate per stimare il tasso di crescita massimo. I tassi di crescita di un totale di 60 colture cellulari sono indicati come mappa di calore visualizzata. La degradazione dal bianco al rosso indica i tassi di crescita dal basso all'alto.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti se eseguita correttamente e in ordine. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come preparare e caricare i campioni sulla micropiastra per misurazioni altamente precise delle crescite batteriche in modo ad alta produttività. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di creare una tabella di riferimento prima di eseguire l'esperimento per evitare colture cellulari a bassa densità e per assicurarsi che le cellule inizino a crescere entro 24 ore.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'automazione della manipolazione sperimentale e l'analisi computazionale per rispondere a ulteriori domande, come quali siano i fattori di determinazione della propagazione della popolazione e le loro dinamiche. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei sistemi e della microbiologia. Esplorare i principi fondamentali della crescita cellulare e ottimizzare la composizione dei terreni di coltura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi precisa e ad alto rendimento della crescita batterica, fondamentale per comprendere la fisiologia microbica. Il metodo consente di testare contemporaneamente diversi mezzi di coltura o ceppi variati, fornendo informazioni sui fattori chiave che influenzano la crescita cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia microbica
- Biologia dei sistemi
- Microbiologia
Sfondo
- Comprendere la crescita batterica è essenziale per la fisiologia microbica.
- L'analisi ad alto rendimento consente la valutazione dei parametri di crescita.
- Questo metodo può essere applicato a vari microrganismi.
- Permette di rispondere a domande fondamentali in microbiologia.
Scopo dello studio
- Analizzare con precisione la crescita batterica.
- Valutare i parametri globali relativi ai tassi di crescita e alla densità delle popolazioni.
- Fornire informazioni dettagliate sulla crescita di E. coli e di altri microorganismi.
Metodi Utilizzati
- Manipolazione sperimentale delle condizioni di crescita batterica.
- Tecniche di analisi ad alto rendimento.
- Test simultaneo di ceppi e mezzi di coltura multipli.
- Valutazione delle curve di crescita per i batteri.
Risultati principali
- Valutazione precisa dei tassi di crescita massimali raggiunti.
- Valutazione della densità massima della popolazione nelle curve di crescita.
- Informazioni ottenute sui fattori che determinano la crescita batterica.
- Applicabilità alla selezione di batteri ambientali.
Conclusioni
- Il metodo migliora la comprensione della dinamica della crescita microbica.
- Fornisce un quadro di riferimento per future ricerche in biologia dei sistemi.
- Potenziale per applicazioni più ampie negli studi microbiologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi ad alto rendimento della crescita batterica consente una rapida valutazione dell'idoneità dei ceppi e dell'ottimizzazione dei terreni, supportando la validazione precoce delle target nella scoperta di agenti antimicrobici. Una quantificazione precisa del tasso di crescita e della densità della popolazione fornisce un'elevata affidabilità predittiva per ridurre i rischi associati ai candidati principali in processi mirati alla microbiologia. Questo metodo soddisfa la necessità di schermature fenotipiche scalabili e riproducibili nella ricerca di sistemi biologici e di microbiologia traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando la velocità massima di crescita come indicatore della fitness cellulare in condizioni genetiche o ambientali variabili.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante confronto ad alto rendimento tra ceppi di tipo selvatico e mutanti in diverse formulazioni di terreni di coltura.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale quantificando la coordinazione delle funzioni geniche dipendenti dalla crescita, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella scelta dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara ceppi batterici validati per la standardizzazione degli saggi riproducibili, garantendo letture basate sull'OD600 costanti in diverse campagne di screening.
- Valore operativo: Utilizza il formato a piastra a 96 pozzetti per consentire test scalabili e paralleli di dozzine di ceppi o condizioni con consumo minimo di reagenti.
- Prontezza del saggio: Genera curve di crescita temporali dettagliate che migliorano l'affidabilità dello screening catturando le fasi di latenza, esponenziale e stazionaria per la conferma dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i fenotipi di crescita nella fase di scoperta a modelli preclinici mantenendo la fedeltà del sistema in batteri ambientali e patogeni rilevanti per la malattia.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione collegando la cinetica di crescita alla riorganizzazione del trascrittoma e alle tendenze di fitness su scala genomica.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sulla fiducia predittiva nei percorsi dipendenti dalla crescita piuttosto che sugli esiti clinici, allineandosi agli obiettivi iniziali di riduzione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi nella biologia iniziale alla preparazione dei saggi per l'identificazione dei composti promettenti, in particolare nei programmi mirati ad agenti antimicrobici e al microbioma.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo un confronto preciso della dinamica di crescita tra knockout genici, varianti di promotore o condizioni di stress.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante misurazioni standardizzate di OD600, preparazione riproducibile delle colture madre e produzione di dati cinetici per la validazione dei risultati positivi.
- Analisi: Fornisce output quantitativi—come il tasso massimo di crescita e la densità della popolazione—che permettono il confronto statistico tra diverse condizioni e prestazioni dei ceppi.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'uso di batteri e mezzi di coltura ambientalmente rilevanti che imitano condizioni fisiologiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo di crescita in diversi progetti, riducendo lo sviluppo ridondante di protocolli e consentendo l'allineamento dei dati tra diversi gruppi di lavoro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi associati alla crescita.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle misurazioni della crescita tra ceppi e mezzi diversi.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale grazie a test paralleli e riduzione del rischio biologico nei programmi precoci di agenti antimicrobici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata sui dati di idoneità alla crescita, che consente lo sviluppo di ceppi con profili fenotipici robusti.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze di microbiologia in tecniche sterili, preparazione di colture madri e calibrazione dell'OD600.
- Richiede un lettore di micropiastre con controllo della temperatura, capacità di agitazione e lettura cinetica dell'assorbanza a 600 nm.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per tabelle di riferimento, protocolli di diluizione e posizionamento dei pozzetti, al fine di evitare effetti marginali.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono la regolazione della densità dell'inoculo e della composizione del terreno di coltura per ceppi a crescita lenta o fastidiosi.
- Limite pratico: limite di rilevazione più stringente a basse densità cellulari rispetto al conteggio UFC, richiedendo un inoculo sufficiente per un segnale affidabile.
