Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

L'obiettivo generale di questo metodo di preparazione della retina è utilizzare la microscopia video per misurare la reattività arteriosa retinica nei topi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della regolazione del flusso ematico retinico e potrebbe aiutare a migliorare la comprensione della fisiopatologia di diverse malattie oculari. Il principale vantaggio di questa nuova tecnica è che consente di misurare la reattività dei vasi sanguigni retinici con un'elevatissima risoluzione ottica.

E allo stesso tempo, non richiede molto equipaggiamento sofisticato. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero avere difficoltà perché può essere complesso individuare l'arteria oftalmica e le sue ramificazioni. Dimostrerò questa procedura insieme a Jenia Kouchek Zadeh e Wael Omran, studenti post-laurea del mio laboratorio.

Prepararsi per le procedure sperimentali predisponendo gli strumenti necessari. Quindi utilizzare un paio di forbici di acciaio per tagliare longitudinalmente il cranio del topo in due metà ed usare le forbici da occhiale per rimuovere la pelle e il cervello. Usare le forbici da occhiale per rimuovere l'osso cranico fino a quando rimane solo l'osso orbitario, quindi trasferire l'orbita in una piastra per dissezione contenente soluzione fisiologica di Krebs-Henseleit fredda su ghiaccio, sotto un microscopio chirurgico.

Tagliare l'osso orbitale con forbici da occhio e utilizzare pinzette di precisione di tipo quattro e forbici a molla Vannas da studente per rimuovere delicatamente il bulbo oculare e i tessuti orbitali. Utilizzando pinzette di precisione di tipo cinque e forbici da capsulotomia Vannas, rimuovere con attenzione la ghiandola di Harder, il tessuto connettivo e i muscoli estrinseci dell'occhio, avendo cura di non danneggiare il ramo principale dell'arteria oftalmica. Usare suture in Nylon 10-0 per legare i rami orbitali all'estremità prossimale del ramo principale delle arterie oftalmiche e utilizzare le pinzette di precisione di tipo quattro per trasferire il bulbo oculare in una piastra di Petri contenente etanolo al 70%.

È molto importante che tutti i rami orbitali dell'arteria oftalmica vengano legati per evitare perdite durante l'esperimento. Dopo 10 secondi, riposizionare il bulbo oculare nella piastra per dissezione. La cornea apparirà di colore biancastro a causa dell'esposizione all'etanolo.

Sostituire il buffer con una soluzione di Krebs fresca e utilizzare il microscopio e un ago da tre per forare la cornea periferica. Usare le forbici da capsulotomia di Vannas per dissezionare la cornea e rimuovere delicatamente il tessuto dell'iride. Quindi posizionare una punta affilata delle forbici da capsulotomia di Vannas tra la coroide e la retina e recidere la coroide e la sclera.

Per montare la retina in una camera di perfusione su misura, utilizzare innanzitutto un portaaighi per spingere l'estremità di una micropipetta di vetro con una punta di diametro di 100 micrometri nel tubo di silicone della camera. Successivamente, collegare la siringa all'altro capo del tubo per rimuovere eventuali detriti dalla punta della micropipetta. Riempire la camera di perfusione con tampone Krebs freddo e posizionare la camera sotto un microscopio stereoscopico.

Posizionare una piattaforma in plastica trasparente con un'incisione di 1,8 millimetri sopra due fili d'acciaio del diametro di 1,6 millimetri all'interno della camera di perfusione e apporre un anello in acciaio inossidabile sulla piattaforma. Utilizzare un cucchiaio per trasferire la retina con il nervo ottico, mantenendo l'arteria oftalmica ancora attaccata, sulla piattaforma e rimuovere l'estremità suturata dell'arteria oftalmica. Posizionare due asole precedentemente preparate di sutura in Nylon 10-0 sulla micropipetta e fissare l'arteria alla micropipetta mediante le suture.

Utilizzare una pinzetta a punta fine per posizionare la retina sulla piattaforma trasparente e usare una seconda pinzetta a punta fine per aprire delicatamente la capsula lentica anteriore. Rimuovere il cristallino e utilizzare forbici microchirurgiche per asportare completamente la capsula lentica e l'umor vitreo. Successivamente, effettuare quattro incisioni radiali nella retina, a metà strada tra la pars plana e il nervo ottico, quindi posizionare l'anello in acciaio inossidabile sulla retina per fissarla alla piattaforma.

Per preparare le arteriole retiniche all'analisi, trasferire la camera di perfusione sotto un microscopio ottico e selezionare l'obiettivo a immersione in acqua da 100X. Collegare dei tubi ai porti di ingresso e uscita di una pompa paraciclica e far circolare all'interno della camera una soluzione tampone di Krebs a 37 gradi Celsius, ossigenata con il 95% di ossigeno e arricchita con il 5% di anidride carbonica. Collegare il tubo di silicone dotato della micropipetta a un tubo di silicone serbatoio tramite un rubinetto a tre vie e riempire il serbatoio con soluzione tampone di Krebs fino a un'altezza corrispondente a 50 millimetri di mercurio.

Utilizzando gli obiettivi, mettere manualmente a fuoco la superficie retinica per cercare vasi sanguigni o globuli rossi. Quando si trova un vaso sanguigno, mettere a fuoco sul vaso e aprire il rubinetto a tre vie. Il diametro del vaso dovrebbe aumentare immediatamente e dovrebbero apparire globuli rossi.

Dopo un periodo di equilibrazione di 30 minuti, le arteriole svilupperanno un tono intrinseco debole con una riduzione del diametro luminale inferiore al 10%. Aggiungere un reagente restrittivo della retina di topo alla soluzione del bagno e verificare la vitalità del vaso. Successivamente, far circolare la pompa per eliminare l'agonista dal bagno e aggiungere tampone Krebs fresco alla camera.

In questo esperimento rappresentativo, l'U46619, un composto analogo al trombossano, ha indotto risposte vasocostrittive dipendenti dalla concentrazione nelle arteriole retiniche di topi wild type C57Bl/6J, determinando una riduzione di circa il 50% del diametro luminale rispetto al valore di riposo alla concentrazione di 1 × 10⁻⁶ M. In arteriole precontratte con l'agonista, la somministrazione cumulativa di acetilcolina ha provocato un aumento dipendente dalla concentrazione del diametro luminale, raggiungendo circa il 25% del diametro precontratto alla concentrazione di 1 × 10⁻⁵ M di acetilcolina, indicativo di un'endotelio vascolare integro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90-120 minuti se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire queste procedure, ricordare di legare tutti i rami arteriosi retrobulbari per immergere l'occhio nell'etanolo prima di aprire il bulbo oculare, al fine di evitare la torsione dell'arteria oftalmica, e infine controllare le punte delle micropipette di vetro per verificare eventuali ostruzioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare la retina del mouse per la misurazione arteriosa mediante microscopia video in vitro.