Name: Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Impara a preparare colture neuronali dissociate dalla corteccia di embrioni e topi neonati per studi di elettrofisiologia e imaging. Questo metodo fornisce una piattaforma versatile per la ricerca neuroscientifica.

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I preparativi prima del giorno di coltura: <ul><li> Preparare soluzione sterile dissezione (DS). </li><li> Preparare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con supplementi di B27). </li><li> Autoclave DDH 2 O e sterilizzare coversilps vetro, se necessario. </li><li> Cappotto tessuto piatti cultura o coprioggetto di vetro con poli-D-lisina. </li></ul> Poli-D-lisina Coating: Preparare il giorno prima della coltura in condizioni di sterilità. <ul><li> Aliquota del disgelo PDL 10X e posto sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 9 ml sterile ultra-filtrata acqua a 1 ml di PDL e mescolare bene (1X). </li><li> Superfici cappotto con 1X Pdl notte a temperatura ambiente come segue: <ul><li> vetro coprioggetti (Bellco gatto di vetro, Inc. # 1943-00012.): 75 microlitri / coprioggetto O </li><li> 24 pozzetti cultura: 300 ml / pozzetto O </li><li> 35 millimetri piatto cultura: 1ml/dish </li></ul></li><li> Risciacquare con acqua sterile 5X (usare pipette Pasteur sterili per aspirare liquidi). </li><li> Eliminare l&#39;acqua in superficie fino a quando è completamente asciutto. </li></ul> Coltura procedura (fatto in cappa a flusso laminare in condizioni sterili) <ol><li> Tagliare blocco di agar e la colla sul blocco sostegno della Vibraslicer microtomo (Campden Instruments Ltd.) con colla super. </li><li> Quando si utilizza tardo fase embrionale (E17-18) feti di topo, diga euthanise, togliere utero e feto singolo libero dal sacco embrionale. Feti posto in piastra di Petri sterile e procedere come descritto di seguito. </li><li> Decapitare feto mouse o cucciolo (seguire le linee guida approvate dalla vostra cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa). </li><li> Togliere la pelle e il cranio e il cervello posto sul disco Whatman carta da filtro in una capsula di Petri riempite con 60 millimetri DS freddo. </li><li> Tagliare il cervelletto con una lama di rasoio sterile. </li><li> Pick up cervello con una spatola e scarico liquidi in eccesso su carta da filtro, poi il trasferimento cervello per bloccare il supporto Vibraslicer e il cervello colla al posto (lato caudale e parte ventrale fronte agar). </li><li> Riempire da camera con DS freddo. Impostare il selettore della velocità a 8-9. </li><li> Tagliare sezioni 200-400 micron, a partire dal bulbo olfattivo. Una volta che la lama del Vibraslicer penetri nella corteccia, iniziare il taglio 600μm sezioni coronali. Un cervello E17-18 topo produce tipicamente 3-4 fette utilizzabile, mentre un P0 cervello di topo cede 4-5 fette utilizzabile. </li><li> Trasferimento fettine di cervello di piatto da 35 mm di Petri etichettati DS 2 usando fine inverso di un-inserito 10 ml di vetro pipetta Pasteur. </li><li> Sezionare fuori corteccia e rimuovere le meningi con aghi di vetro tirato da tubi capillari. </li><li> Scorze tagliate corticale in piccoli pezzi, 0,5-1 mm di lunghezza. </li><li> ES Filtrare 0,2 micron filtro attaccato ad una siringa da 5 cc in un piatto 35 millimetri di Petri. </li><li> Trasferire i pezzi di tessuto corticale capsula di Petri contenente ES filtrata. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 min. </li></ol> Nel frattempo: <ol><li> Pulire cappuccio, Vibraslicer e strumenti di dissezione. </li><li> Aggiungere 5 ml di caldo NBM/B27 in un piatto 60 millimetri di Petri. </li></ol> Dopo 30 min. incubazione: <ol><li> Trasferimento di tessuto a 10 ml DS. Lasciare riposare per 1 minuto. </li><li> Trasferimento di tessuto al primo turbinii tubo Hi e lasciare riposare per 2-3 minuti. </li><li> Trasferimento a Hi secondo. Ripetere come sopra. </li><li> Trasferimento al primo Li. Ripetere come sopra. </li><li> Trasferimento alla seconda Li. Ripetere come sopra. </li><li> Cessione a terzi Li. Ripetere come sopra. </li><li> Trasferimento di tessuto al piatto 60 mm con i media. </li></ol> Sotto il microscopio dissezione: <ol><li> Eliminare i detriti dal tessuto e triturare ogni pezzo con delicatezza passando attraverso una pipetta di vetro tirato (minor utilizzo diametri) per allentare il tessuto. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare a 15 ml tubo contenente il resto della NBM + B27 (per un totale di 13 ml per una piastra ben 24 o 11 ml per 5 - 35. Piatti millimetri Mescolare delicatamente e attendere grandi pezzi di tessuto per risolvere). </li><li> Trasferimento di sospensione cellulare (0,5 ml / pozzetto di una piastra ben 24 o 2 ml / 35 piatto cultura mm). </li><li> Quando si utilizza coprioggetto di vetro, aggiungere 80 microlitri di sospensione cellulare per coprioggetto e lasciare 1 ora nel tessuto culturale incubatore per le cellule di aderire prima di allagare la camera con più NBM/B27 media. </li><li> Mantenere le culture a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> Giorno successivo 24 pozzetti: Feed ciascun pozzetto con 0,5 ml di cellule non neuronali condizionata NBM/B27 medio (cNBM/B27; Protocollo per la preparazione di cNBM/B27 media appare sotto) Piatti 35 mm: Sostituire 0,5 ml con cNBM/B27 media. Mantenere la cultura sostituendo 0,5 ml di media con cNBM/B27 fresca ogni 2-3 giorni. Sebbene i media cultura non promuove la proliferazione delle cellule gliali, le culture possono essere trattate con FDU 5 micron (5-Fluoro-2&#39;-deossiuridina, Sigma F0503) al giorno 3-5 in cultura per ridurre ulteriormente il numero di cellule gliali, se necessario. SET<html> -UP per la dissezione e la Cultura Sterilizzare gli strumenti dissezione nel 70% EtOH o autoclave loro: <ul><li> Forbici (aziende medie e piccole) Spatole (aziende medie e piccole) </li><li> Pinzetta (aziende medie e piccole) Razor blade </li><li> Lama per il bagno Buffer vibraslicer </li><li> Piccolo cuneo di metallo per il supporto della lama per il cervello </li></ul> Altri materiali: <ul><li> Piastre di Petri (60 mm) </li><li> Piastre di Petri (35 mm) </li><li> Filtro di carta </li><li> Pipetta di vetro da 10 ml </li><li> Pipette sterili monouso, 5,10 e 25 ml </li><li> Siringa filtro, 0,2 micron </li><li> Siringa da 5 cc </li><li> Provette per centrifuga, 15 ml </li><li> Sterile di vetro pipette Pasteur </li><li> PDL piatti cultura rivestiti o coprioggetto di vetro </li></ul> Etichetta sei provette da 15 ml e seguire la preparazione: Tubo # 1: soluzione enzimatica: Aggiungere 50 U di papaina (Worthington LS 03126) a 5 DS ml contenente: <ul><li> 100μl di L-cisteina (0,8 mg) </li><li> 7 microlitri 0.1N NaOH </li><li> 50 microlitri APV (5mm) </li></ul> Lasciare la soluzione a temperatura ambiente per cancellare. Si noti che appariranno soluzione enzimatica &#39;torbida&#39; in un primo momento e ha bisogno di pulire prima dell&#39;uso. Tubo # 2 e # 3: inibitore Max: 3 ml DS + 300 ml BSA / Ti + 30 microlitri APV (5mm). Mescolare delicatamente per evitare le bolle, poi dividere in due aliquote da 1,5 ml. Tubo # 4 - # 6: inibitore Basso: 8 ml DS + 80 microlitri BSA / Ti + 80 microlitri APV (5mm). Mescolare delicatamente per evitare le bolle, si dividono in tre aliquote da 2,6 ml. Tubi posto numerato # 2 al # 6 su ghiaccio. Lascia tubo # 1 (soluzione enzimatica) a temperatura ambiente. SOLUZIONI E aliquote <ul><li> Soluzione A (Buffered Saline) Sigma Formula wt 500 ml [conc.] </li><li> Cloruro di sodio NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm </li><li> Cloruro di potassio KCl P-4504 74,56 4,0 G 5.4mm </li><li> Fosfato di sodio bibasico anidro Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0.24g 0,17 mm </li><li> Potassio fosfato monobasico anidro KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0,22 mm 0,3 g </li></ul> Pesare tutti gli ingredienti e mescolare fino a sciogliere con 400 ml di acqua ultra filtrata. Portare il volume finale a 500 ml. Mettere in una bottiglia pulita e autoclave. Conservare a 4 ° C e l&#39;etichetta &quot;Soluzione DS A&quot;. <ul><li> Soluzione B (Hepes) Sigma Formula wt 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9,9 mm </li></ul> Aggiungi ultra-filtrata l&#39;acqua fino a 200 ml. Mescolare fino a scioglimento e portare il volume finale a 250 ml. Mettere in una bottiglia pulita e autoclave. Conservare a 4 ° C e l&#39;etichetta &quot;DS Soluzione B&quot;. <ul><li> Soluzione di lavoro da 500 ml [conc.] </li><li> Ultra 400 ml di acqua filtrata </li><li> Soluzione A 25 ml </li><li> Soluzione B 14 ml </li><li> D (+)-glucosio Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Sigma saccarosio S-0389 7,5 g 43,8 mm </li></ul> Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1N. Portare il volume finale a 500 ml con acqua ultra filtrata. Decantare in una bottiglia di vetro pulita e autoclave. Conservare a 4 ° C. Etichetta &quot;Soluzione dissezione&quot;. Poli-D-lisina Preparazione: <ol><li> Preparare la soluzione 10x stock di poli-D-lisina (PDL; Sigma P-7280) in sterili H 2 O a 1mg/ml. </li><li> Fai aliquote 1,0 ml. Questa soluzione può essere conservata a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. </li></ol> MEDIA <ol><li> Aggiungere 10 ml di B-27 Supplemento (Gibco 17504-044) per flacone da 500 ml NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049). </li><li> Fai 40 aliquote da ml e conservare a 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Aggiungere 10 ml di H 2 O sterile per flaconcino da 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic acido, Sigma A-5282) e mescolare accuratamente. </li><li> Preparare aliquote di 180 microlitri e conservare a -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Sciogliere 1 g di BSA (albumina bovina. Sigma A-7030) e 1 g di tripsina inibitore (Sigma T-9253) in 10 ml DS. </li><li> Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1N. </li><li> Sterilizzare per filtrazione attraverso filtro da 0,2 micron siringa. </li><li> Dividere in aliquote da 400 microlitri e conservare a -20 ° C. </li></ol> L-cisteina In una provetta Eppendorf sciogliere 0,6 mg L-cisteina (Sigma C-7755) in 200 microlitri DS. AGAR (4%) <ol><li> Sciogliere 4 g di Agar Bacto (Difco 0140-01) in 100 ml di acqua sterile. Conservare a 4 ° C fino al momento della cultura. </li><li> Agar microonde per fondere e riempire un piatto di 35 millimetri di Petri. Lasciate riposare per raffreddare e polimerizzare. </li></ol> Papaina (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; non neuronali CULTURE IN BOTTIGLIA CULTURA NUNC RIVESTIMENTO BOTTIGLIA CULTURA (4 bottiglie Nunc) <ol><li> Aggiungere 9 ml di acqua sterile a ciascuno dei 3 tubi del PDL 10X per rendere PDL 1X. </li><li> Trasferire 30 ml 1X PDL nella prima bottiglia. </li><li> Spostare leggermente fino a quando tutte le superfici di crescita sono coperti. Lasciate riposare per 1 minuto. </li><li> Trasferimento 1x PDL a seconda bottiglia. Lasciate riposare per 1 minuto. </li><li> Ripetere con le bottiglie terzo e quarto. </li><li> Risciacquare tutte le quattro bottiglie 2X con 150 ml sterile H 2 O. </li></ol> PREPARARE soluzione enzimatica (ES): <ol><li> In un peso 0,6 ml in provetta da centrifuga 0,8 mg L-cisteina (Sigma C7755), aggiungere DS 150ml e vortice fino a quando i cristalli si sciolgono. </li><li> Trasferire 5 ml DS in una provetta da 15 ml, poi aggiungere 150ml L-cisteina. </li><li> Papaina aggiungere 50 unità. (Worthington LS 03126) </li><li> Aggiungi 7ml 0.1N NaOH. </li></ol> PREPARARE MEM (GIBCO # 11090-081) <ol><li> Togliere 65 ml dalla bottiglia da 500 ml MEM. Risparmia il 10 ml per preparare glucosio. </li><li> Aggiungere 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> Aggiungere 10 ml di glucosio 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml di MEM) </li><li> Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (Gibco # 16140-071) o siero bovino di vitello (Omega aC-04). </li><li> Mescolare bene, aliquota e conservare a 4 ° C. </li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27 SUPPLEMENTO (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Aggiungere l&#39;intero contenuto di B-27 vial alla bottiglia NBM e mescolare. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. </li></ol> DISSEZIONE del tessuto cerebrale <ol><li> Secco dissezione strumenti dal 70% EtOH prima della dissezione. </li><li> Trasferire 10 ml DS in ogni tubo di 3-15 ml. </li><li> Seleziona cuccioli mouse (P0 - P3), avrete bisogno di tre cervelli per 4 bottiglie. </li><li> Aggiungi DS piatto freddo a 35 mm di Petri. </li><li> Decapitare il mouse cucciolo e sezionare i cervelli. </li><li> Cervello posto nella capsula di Petri contenente DS freddo. </li><li> Tritare tessuto in pezzi, abbastanza piccolo da passare attraverso una pipetta di vetro. </li></ol> ENZIMA DISSOCIAZIONE <ol><li> Rimuovere il DS più possibile il piatto con una pipetta Pasteur. </li><li> ES filtrare attraverso una siringa da 0,2 micron filtro e 5 cc. </li><li> Luogo ES nel piatto con il tessuto. </li><li> Incubare il tessuto a 37 ° C incubatore (CO 2 anni gratis) per 30 minuti. </li></ol> LAVAGGIO DEL TESSUTO <ol><li> Tessuto trasferimento con pipetta di vetro per il primo tubo DS, avendo cura di avere come ES meno possibile. </li><li> Centrifugare per 30 sec a 1500 giri al minuto. </li><li> Trasferimento di tessuti e ripetere la procedura altre due volte. </li></ol> TRITURAZIONE <ol><li> Mettere 38 ml di MEM / FBS in un tubo da 50 ml per centrifuga </li><li> Aggiungere 3 ml di MEM / FBS a un piatto da 35 mm e il tessuto di trasferire a questa capsula di Petri. </li><li> Dissociare il tessuto con delicatezza triturazione attraverso un 1000μl punta della pipetta eppendorf. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare alla provetta contenente 38ml di MEM / FBS e mescolare bene. </li></ol> PLATING <ol><li> Stare le bottiglie cultura in posizione verticale per ottenere la stessa quantità di sospensione cellulare e dei media in ogni bottiglia. </li><li> Mettere 90 ml di MEM / FBS in ogni bottiglia cultura. </li><li> Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare in ogni bottiglia. </li><li> Etichetta: non neuronali, iniziali e la data. Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> ALIMENTAZIONE <ol><li> Il giorno 3 o 4, le cellule di alimentazione con caldo MEM / FBS (decantare tutti i media e sostituirlo con 100 ml di MEM / FBS). Culture possono prendere 7-10 giorni per diventare confluenti. </li><li> Il giorno di 7-10 cambiare il supporto per NBM/B27. </li><li> Il giorno dopo, raccogliere i media. Filtro con 0.22μm </li><li> Fai aliquote di 40 ml e mangimi cultura con MEM / FBS. </li><li> Prossimi 2 o 3 giorni, cambio dei media per NBM/B27 </li><li> Il giorno dopo, raccogliere e ripetere la procedura. </li><li> Continuare a raccogliere i media per ca. 2 settimane. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Neurobasale (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Acido 2-ammino-5-fosfonopentanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio 1N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa sterile da 0,2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip di vetro, No1, 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Minimo Essenziale (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>con sali di Earle&amp;rsquo;s senza L-glutammina, necessario per la coltivazione di colture non neuronali</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>per colture non neuronali</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>necessario per colture non neuronali</td></tr><tr><td>Flacone per colture cellulari Nunclon &quot;Triple Flask&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Da utilizzare per colture non neuronali. Questi flaconi sono molto comodi per produrre &quot;mezzo Neurobasale/B27 condizionato&quot;, ma possono essere usati anche altri flaconi o piastre per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Piastre per imaging con fondo in vetro &quot;Imaging dishes&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Piastre per colture da 35 mm con fondo in vetro, ideali per l'imaging del calcio o del sodio quando si utilizza un sistema di imaging invertito. Ma costose!</td></tr></tbody></table>

preparazione del dissociato culture neuron mouse corticale

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Questo video vi guiderà attraverso il processo per la generazione di neuroni corticali culture dall&#39;embrione fine e l&#39;inizio del cervello di topo postnatale. Queste culture può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, imaging di calcio e sodio, proteine ​​e / o RNA isolamento. Queste culture anche fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione in ritardo embrionale o postnatale gene letale. La procedura è relativamente semplice, richiede una certa esperienza nelle tecniche di coltura e non dovrebbe richiedere più di due o tre ore se si è adeguatamente preparati. Un&#39;attenta separazione della crosta corticale dal talamo-corticale del tratto di fibra ridurrà il numero degli indesiderati cellule non neuronali. Per aumentare la resa delle cellule neuronali triturare i pezzi del tessuto corticale delicatamente dopo la fase di incubazione dell&#39;enzima. Questo è indispensabile in quanto previene inutili danni alle cellule e la morte prematura delle cellule neuronali. Dato che queste colture sono mantenute in assenza di cellule di alimentazione glia, offrono anche un vantaggio aggiunto di culture crescente arricchito nei neuroni.

Questo video mostra una procedura per la generazione di culture neuronali dall&#39;embrione fine e l&#39;inizio della corteccia del mouse postnatale. Queste culture possono essere utilizzati per immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, calcio e sodio di imaging e di fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione genetica postnatale letale.

Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

Questo video vi guiderà attraverso il processo di generazione di colture neuronali corticali a partire dal cervello di topo in fase embrionale tardiva e postnatale precoce. Queste colture ...

Ciao, mi chiamo Hilgenberg. Lavoro qui all'università della California a Irvine, nel Dipartimento di Anatomia e Neurobiologia. Oggi vi parlerò di come prepariamo colture corticali da topi.Questi sono topi al giorno postnatale da cui prepariamo quei neuroni. E tipicamente utilizziamo queste colture per elettrofisiologia, oppure per preparazioni di proteine o RNA. Utilizziamo la stessa preparazione di colture per l'imaging del calcio o del sodio.La cosa interessante di queste colture è che, in realtà, rappresenta un'adattamento del protocollo banker, ma coltiviamo queste colture in assenza di cellule gliali di supporto, il che le rende molto più comode e di solito più ricche di neuroni rispetto a cellule gliali. Cominciamo dunque e vi mostrerò come prepariamo quei neuroni. Bene, ora siamo arrivati al punto in cui possiamo rimuovere il cervello e iniziare la dissezione vera e propria.Ma prima è importante precisare che i vetrini su cui si desidera seminare queste cellule devono essere rivestiti. Di solito si esegue questo passaggio durante la notte a temperatura ambiente, utilizzando una concentrazione di polilisina pari a 0,1 milligrammi per millilitro. Il giorno successivo si rimuove la polilisina e si lavano i vetrini per tre volte consecutive.A seconda dell'applicazione, si possono utilizzare piatti grandi, piatti piccoli oppure coprioggetti di vetro. Bene, questa è la configurazione tipica per la cappa, e brevemente vi ho illustrato quali soluzioni è necessario avere pronte e anche quali strumenti risultano utili per l'isolamento, o la dissezione del cervello, e successivamente per il taglio effettivo del cervello. Quello che abbiamo qui è la soluzione per la dissezione, che è fredda.Di solito, viene tenuto sul ghiaccio. Abbiamo un vibratomo che dobbiamo utilizzare per sezionare i cervelli. Ho un contenitore con soluzione di dissezione in cui il cervello viene montato e poi tagliato.E ho diversi strumenti necessari per l'asportazione del cervello. Ho una piastra a trivella. È una trivella al 4% che uso per tenere fermo il cervello.Abbiamo bisogno di una siringa, un paio di filtri sterili, capsule di carta Rotman, piastre di Petri di diverse dimensioni. Questo è il mio strumento per colpire il tubo del mouse. Ho anche pipette di vetro tirate qui dentro.Questi sono capillari di vetro che utilizzo sia come strumenti da dissezione sia per raccogliere i pezzi di cervello ed essenzialmente per iterare tali operazioni. La nostra soluzione enzimatica contiene quindi soluzione di dissezione. È presente cisteina L per attivare la peptasi, nonché idrossido di sodio 0,1 N per bilanciare il pH.Dopo aver aggiunto la pepaina, la soluzione risulta leggermente opaca e deve schiarirsi prima di poter essere utilizzata per la digestione enzimatica del tessuto. Ora siamo praticamente pronti per iniziare la procedura. Il fibro Slicer è stato preparato.Ho inserito una lama che seziona il mio cervello e ho anche posizionato sotto un contenitore che contiene il buffer e sostiene il cervello. Ora sono pronto per montare il blocco di agarosio sulla mia piastra di supporto, che sosterrà anche il cervello. Questo agarosio è stato polimerizzato; si tratta di agarosio al 4%. Procederò ora a tagliare attraverso una zona come questa.E lateralmente, fondamentalmente, si ricava un estrattore di forma rettangolare. Poi utilizzo una spatola per rimuovere questo pezzo dal blocco dell'estrattore. Ora incollerò questo estrattore sulla mia piastra di supporto, con il lato piatto dell'estrattore rivolto in avanti.Quindi questo è il supporto al quale il cervello viene incollato e che lo mantiene in posizione tramite questa vite senza fine. In questo modo, quando effettuiamo il sezionamento in questo orientamento, il cervello non si sposta all'indietro. Ora siamo pronti a rimuovere il cervello.Di solito utilizziamo un topo P zero o un topo P uno. Bene, questa è la testa del topo decapitata e ora rimuoverò rapidamente il cranio. Per prima cosa taglierò la fascia muscolare che si trova proprio qui e dall'altro lato.Poi entro con le forbici, avendo molta cura che la parte interna delle forbici non danneggi il cervello. Sto tagliando attorno al cranio su entrambi i lati.E ora possiamo semplicemente prendere la cartilagine e userò il mio piccolo ULA per rimuovere il cervello in questo modo. Questo cervello verrà quindi collocato nella mia piastra di Petri riempita con soluzione per sezionamento, che contiene un filtro di carta Watman sul fondo. Quello che desidero fare ora è tagliare la base del cervello, in modo da ottenere una superficie piatta e stabile su cui montare il cervello sulla mia spalla.Quindi metterò una goccia molto piccola di colla sul mio piatto di supporto. Prenderò ora il cervello con la spatola, utilizzando le pinzette curve per aiutarmi in questa operazione. Quello che voglio fare è eliminare semplicemente il liquido in eccesso proveniente dalla soluzione di dissezione, quindi monterò il cervello contro il mio supporto elicoidale.Ora siamo pronti a trasferire il cervello nel bagno tampone. Aggiungo quindi la soluzione di dissezione a quel piccolo contenitore e inserirò il supporto che trattiene il cervello. Il cervello viene montato con la faccia rivolta verso la lama.Bene, ora il cervello è montato e userò il taglierino per fibro, cercando l'inizio del cervello spostando il cervello verso la lama. Ho appena tagliato una piccola parte dell'olfattivo. Ora sto spostando la mia lama di circa 600 micrometri verso il basso ed eseguo un altro taglio, che dovrebbe attraversare esattamente la corteccia.Ecco che va il cortex e risale sul, sul bordo. E sto spostando ulteriormente il mio bordo di altri 600 micrometri verso il basso e sto tagliando la seconda sezione. È importante che ciò venga fatto in modo continuo, senza interruzioni e in maniera regolare e uniforme.E quando si ritira la lama, si arresta il tagliafibre. Ora userò una pipetta di vetro che ho utilizzato in modo errato. In realtà uso l'estremità posteriore e sposterò questa sezione corticale qui dentro, trasferendola in una nuova piastra di Petri.Procedo attraverso il cervello, sempre di 600 micrometri, finché non ho raccolto circa cinque o sei sezioni per un topo P zero o P uno. E continuo fino a raggiungere l'estremità della corteccia. A questo punto siamo pronti per isolare la corteccia dal resto del cervello.Bene, sto usando queste pipette di vetro, tirate fino a diventare appuntite come strumenti da dissezione. Di solito inizio con la prima sezione che ho ottenuto, ossia la più piccola, e devo rimuovere l'olfatto. Sto anche cercando di rimuovere le meningi da questo preparato.Nuovamente, rimuovendo l'olfattivo di questo frammento, staccandolo delicatamente dalle meningi. A volte ci sono frammenti che non è possibile separare facilmente, quindi procedete oltre e lasciate indietro quelli meno idonei, tenendo solo i frammenti migliori. Mi muovo sempre in direzione di un'estremità e attraverserò una sezione dopo l'altra.È importante che rimuoviate le meningi e, quando osservate queste sezioni, a volte può essere utile girarle per vedere meglio dove si trova il fascio di fibre che contiene la maggior parte delle cellule non neuronali che non si desidera includere in questo preparato. Ok, in questa sezione è chiaramente visibile il fascio di fibre al di sotto del livello corticale. Pertanto, infilo il bisturi proprio nel punto in cui termina il livello corticale, indicando il fascio di fibre che contiene la maggior parte delle cellule non neuronali che stiamo cercando di evitare in questo preparato.Sto tagliando lungo questa linea, cercando di lasciare indietro i tratti di fibre. Questo è il passaggio in cui si trita il tessuto in piccoli cubetti. Bene, ora sto sterilizzando la mia soluzione enzimatica attraverso un filtro da 0,2 micron applicato a una siringa.E aggiungo questo direttamente sui miei pezzi corticali, proprio così. Assicurarsi che ci sia abbastanza liquido che circonda tutti i pezzi corticali e che questi pezzi vengano quindi posti in un incubatore a 37 gradi per 30 minuti, il che dovrebbe ammorbidire notevolmente il tessuto. Quindi sono passati 30 minuti da quando questi pezzi corticali sono stati posti in incubazione nell'incubatore.Nel frattempo, ho riscaldato un po' di mezzo basale neuro con integratore B 27, nel quale queste cellule finiranno alla fine. Ho anche preparato alcune soluzioni qui. La prima è la soluzione di dissezione.Quindi è una semplice soluzione di dissezione. Successivamente vengono trasferiti in una soluzione con alto contenuto di inibitore della tripsina, che contiene BSA come sostanza catturante e un PV per bloccare il componente recettoriale NMDA. E poi vengono sottoposti a tre lavaggi con BSA e un PV a basso contenuto di inibitore della tripsina. Ora rimuoverò questi pezzi dalla soluzione di propano e li trasferirò in una provetta conica contenente la soluzione di dissezione DS.Questi aggregati scenderanno semplicemente verso il basso per gravità e potrebbe volerci un minuto o due prima che si depositino tutti nella parte conica del tubo. Poi li preleverò nuovamente e li trasferirò nella soluzione contenente l'elevato inibitore della tripsina. Ancora una volta, dovremo attendere che questi aggregati si depositino sul fondo del tubo.Viene effettuato un ulteriore lavaggio con una soluzione ad alto contenuto di inibitore della tripsina, quindi questi aggregati vengono lavati in una soluzione a basso contenuto di inibitore della tripsina. Dopo l'ultimo lavaggio e l'aggiunta dell'inibitore enzimatico a bassa concentrazione, trasferirò le cellule nel mio mezzo neurobasale preriscaldato e inizierò a dissociare meccanicamente le cellule aspirandole e rilasciandole ripetutamente attraverso una pipetta capillare di vetro con diametro decrescente. Ora procederò a mescolare le cellule e gli aggregati di tessuto.Ma prima di farlo, rimuoverò tutti i detriti visibili qui. Ad esempio, ci sono proteine e DNA che fuoriescono dalle cellule e formano una sostanza simile a una pallina di cotone, che aderisce agli aggregati di tessuto. È necessario rimuoverla prima, perché intasa la punta della pipetta e rende più difficile forzare il tessuto attraverso un diametro più piccolo.Poi andrò a rompere alcuni di questi capillari di vetro per ottenere un'apertura della dimensione corretta per spostare le cellule all'interno e all'esterno dell'apertura. Questa è una buona pipetta. In questa si può vedere che è bella e rotonda e non ha spigoli vivi.Inserirò questo nel mio dispositivo per iniettare nei topi. Tra il dispositivo e la pipetta è presente un filtro da 0,2 micron e ora muoverò i tessuti all'interno e all'esterno del mio capillare di vetro. Il primo passaggio dovrebbe quindi procedere abbastanza agevolmente, poiché gli aggregati di tessuto non sono molto più grandi dell'apertura della pipetta.Tutto ciò che si vuole fare è ammorbidire il tessuto. Poi proseguo con una punta di pipetta leggermente più piccola. Vorrei avere una punta di pipetta perfettamente rotonda e pulita.Questo aspetto è buono. E ancora, tutti gli aggregati vengono spostati dentro e fuori la pipetta contemporaneamente. Il tessuto ora è molto morbido e sciolto, al punto che se si risospendono questi aggregati nel mezzo, le cellule praticamente fuoriescono.Ora trasferirò tutte le mie cellule dissociate in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e le raffredderò altre due o tre volte, aspirando e dispensando delicatamente su e giù per rompere le cellule che si trovano ancora in aggregati più grandi. Successivamente, dobbiamo attendere uno o due minuti affinché i frammenti più grandi ancora presenti si depositino sul fondo. Inoltre, potrebbero esserci frammenti di vetro provenienti dai capillari di vetro che avete spezzato e che dovrebbero anch'essi depositarsi sul fondo.Successivamente, possiamo utilizzare aliquote di questo campione per seminare su coprioggetti o piatti completamente rivestiti con lisina. Sto seminando 80 microlitri su questo coprioggetto di vetro precedentemente rivestito con polilisina, formando una bella bolla. Le cellule alla fine si depositeranno e aderiranno al coprioggetto di vetro.Dopo circa un'ora, le cellule si sono depositate e aggiungerò molto delicatamente ulteriore mezzo all'intera piastra. Si può dare una leggera rotazione in questo modo. Successivamente, queste cellule vengono poste nell'incubatrice a 37 gradi e domani verranno nutrite con mezzo condizionato.Bene, queste sono le cellule corticali. Hanno poco meno di un giorno di vita. Sono state seminate ieri e si può osservare che ci sono molti neuroni, tutti con abbondanti prolungamenti neuronali, e sono presenti anche alcuni detriti cellulari.Queste sono le cellule che non sono sopravvissute. Verranno eliminate con i prossimi cicli di alimentazione. Le cellule morte sono le cellule rotonde molto piccole con membrane ondulate.Vi ho appena mostrato come preparare queste colture corticali dissociate. È importante ricordare che, quando si rimuove la corteccia dai tagli di tessuto cerebrale, bisogna separarla dai corpi genicolati laterali poiché quest'ultimi contengono moltissime cellule non neuronali. Inoltre, quando si triturano le cellule, non bisogna esagerare con la triturazione perché ciò ucciderebbe la maggior parte delle cellule isolate ottenute fino a quel momento.Quindi trattate con delicatezza le sezioni di tessuto e otterrete una coltura splendida. Buona fortuna nei vostri esperimenti.

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