Name: Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara a modificare la penetranza di mutanti scheletrici letali in Danio rerio mediante allevamento selettivo e test di progenie. Questo metodo consente di generare ceppi ad alta e bassa penetranza per studi genetici.

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Vorremmo ringraziare Chuck Kimmel per l'orientamento, John Dowd aiuto nello sviluppo di questa strategia di allevamento, Macie Walker per il suo lavoro nel perfezionare la macchia scheletrica e Charline Walker e Bonnie Ullmann per zebrafish utili consigli. Questo lavoro è stato supportato da K99/R00 DE024190 a JTN.

tutti gli esperimenti descritti nel presente protocollo sono stati completati in conformità e rispetto dell'Università del Colorado e la University of Oregon istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC).
 1. preparare il brodo non selezionati a partire <ol><li>identificare portatori eterozigoti dell'allele del mutante di interesse da pinna clip 11 e genotipizzazione uno stock di animali pieno-fratello germano di un metodo di scelta, come KASP 12 , 13 , 14. Questo protocollo è stato effettuato con il ceppo mef2ca b1086 zebrafish.</li>
	<li>Genotipizzazione KASP 
	Nota: Il primer specifico Allele per KASP è progettato dalla società che fornisce i reagenti (Vedi Tabella materiali). Per ottenere la concentrazione di colorante (ROX) 6-carbossi-X-rodamina corretta per la specifica macchina PCR in tempo reale visitare il sito Web aziendale.
	<ol><li>Luogo il tessuto di coda di zebrafish in 50 µ l di tampone di lisi (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, tensioattivo non ionico di 0,3%, 0,3% Octylphenyl-polietilenglicole). Aggiungere 10 µ l di proteinasi K 10 mg/mL per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e digest in un termociclatore a 55 ° C per 2-5 h seguita da una fase di inattivazione di 94 ° C 20 min. Refrigerare il prodotto di lisi dopo digestione. Nota: Lisi prodotti possono essere utilizzati con successo per diversi mesi dopo la preparazione. Quando il tessuto è stato lisato utilizzando 50 mM NaOH, le reazioni di KASP erano infruttuosi. Questi risultati suggeriscono che il metodo di NaOH di preparazione di DNA genomico non è compatibile con KASP.</li>
		<li>Quantificare il DNA genomic usando uno spettrofotometro. Diluire il modello di DNA genomico utilizzando acqua di grado di biologia molecolare, in modo che ogni reazione contiene circa 20-30 ng. 
		Nota: Quantificare 4 o 5 campioni, li, quindi preparare diluizioni per tutti i campioni sulla base della media. Quando si utilizza questo protocollo per tessuto adulto coda, spesso è sufficiente una diluizione di 1: 100. Non è necessaria la quantificazione precisa della concentrazione di DNA.</li>
		<li>Aggiungi 0,14 µ l di primer KASP mescolare e 5 µ l di master KASP mescolare per campione su ghiaccio in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare bene prima brevemente centrifugazione per raccogliere contenuti nella parte inferiore del tubo. 
		Nota: Mix master KASP è calore e luce sensibile, tenere scorte sul ghiaccio ed eviti la luce diretta.</li>
		<li>Pipettare 5 µ l di primer/master mescolare la soluzione nei pozzetti di una piastra PCR 96 pozzetti ottico adatto per la macchina PCR in tempo reale in uso.</li>
		<li>Pipettare 5 µ l di diluito (circa 5-7 ng / µ l) esempi di modelli di DNA in ogni bene e aspirare con una pipetta per mescolare.</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di acqua priva di nucleasi di 3 pozzi per servire come modello di no controlli (NTC) e aggiungere 5 µ l di tipo selvaggio omozigotico confermato diluito, eterozigotico e omozigotico modello DNA mutante per controlli positivi.</li>
		<li>Posto un sigillo di film otticamente chiaro sopra il piatto, verificando che il film è completamente sigillato su ciascun pozzetto.</li>
		<li>Centrifugare brevemente la piastra a 600 x g per raccogliere il contenuto nella parte inferiore e per rimuovere le bolle dal mix. 
		Nota: Tenere la piastra su ghiaccio e scudo dalla luce fino al momento di procedere.</li>
		<li>Utilizzare il programma ciclismo illustrato nella tabella 1 per eseguire la reazione principale di KASP.</li>
		<li>Mostra il grafico a dispersione risultante prodotto da computer analysis. Una reazione successo mostrerà 4 distinti raggruppamenti di punti sul terreno ( Figura 3): tre raggruppamenti corrisponde al genotipo e un raggruppamento di NTCs vicino all'origine di esempio. I controlli positivi dovrebbero separare con il raggruppamento di campione appropriato.</li>
		<li>Se il programma del computer non riconosce la trama possono essere raggruppamenti come corrispondenti ai genotipi specifici, ulteriori set di ciclismo necessaria (tabella 2). Ripetere il programma aggiuntivo fino a quando il computer riconosce raggruppamenti stretti dal genotipo.</li>
		<li>Esportare i risultati della genotipizzazione in un file di foglio di calcolo per analisi e uso più facile.</li>
	</ol></li> <li>Gli animali eterozigoti identificati insieme sul sistema acqua principale della casa.</li></ol>
 2. the primo Round di progenie segnando <ol><li>Croce Pairwise heterozygotes di pari livello <ol><li>dopo gli animali recupero dalla clip pinna, impostare intercrosses pairwise. Utilizzare divisori affinché gli embrioni sono sincroni 16.</li>
		<li>Raccogliere gli embrioni e tenere le coppie parentali isolate in gabbie di allevamento.</li>
		<li>Monitor adulti isolati in modo che pesci aggressivi possono essere separati o fornito con coperchio (pesce tagliuzzato reti lavoro ben). Dovrebbero essere alimentati con pesce e loro acqua cambiata seguendo linee guida IACUC mentre in acqua statica.</li>
	</ol></li> <li>Embrione allevamento <ol><li>palco e sollevare gli embrioni di zebrafish alle larve sotto condizioni standard 17.</li>
		<li>Raccogliere fenotipico selvaggio-tipo animali usando una pipetta di vetro il giorno 5 o 6 quando la vescica natatoria è gonfiata nel 75% della frizione. Posto fenotipici tipi selvatici nel vivaio di registrazione di cui i genitori hanno reso loro. 
		Nota: Con alleli mutanti che sono recessivo letale, che è vero per molti mutanti scheletrici, mutanti omozigoti non forma vesciche natatorie 18 , 19. Pertanto, fenotipici tipi selvatici possono essere facilmente individuabile dal mutante di pari livello basati su gonfiato vesciche natatorie.</li>
	</ol></li> <li>Alcian blu/alizarina rosso della cartilagine e dell'osso colorazione <ol><li>anestetizzare le larve che non gonfiano loro vesciche natatorie utilizzando 0,17 g/L tricaina-S media dell'embrione. Raccogliere gli animali in provette per microcentrifuga da 1,5 mL con un bicchiere di wide-bore pipetta Pasteur. Aggiungere non più di 100 larve per tubo.</li>
		<li>Rimuovere l'embrione acqua da ciascuna provetta e difficoltà animali in 1 mL di 2% paraformaldeide in PBS 1X per provetta. 
		Attenzione: Acquosa PFA è infiammabile e causerà grave irritazione cutanea e oculare. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale come guanti e occhiali di protezione e lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso.</li>
		<li>Rock per 1h; fissazione più altera la macchiatura dell'osso. Controllare i tubi regolarmente durante questo e tutti i passaggi successivi a dondolo affinché nessun larve hanno diventare bloccati al lato o raggruppati nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Rimuovere il fissativo da tubi usando una pipetta di vetro, aggiungere 1 mL di etanolo al 50% e rock per 10 min.</li>
		<li>Preparare fresco macchiatura soluzione aggiungendo 20 µ l di 0,5% rosso alizarina per 1 mL di Alcian premix (0,04% Alcian blu/10mm MgCl 2 / 80% di etanolo). Eliminare l'etanolo di 50%, aggiungere 1 mL di soluzione per ogni tubo e roccia di colorazione durante la notte. Le larve possono rimanere nella macchia fino a 5 giorni.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di macchia dai tubi e aggiungere 1 mL di 80% etanolo/10mm MgCl 2 soluzione ad ogni provetta. Rock le provette per almeno 1 h; risciacquo pernottamento può produrre una più chiara macchia blu di Alcian.</li>
		<li>Rimuovere l'80% etanolo/10mm MgCl 2 soluzione dai tubi e aggiungere 1 mL di etanolo al 50%; rock per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di etanolo 50% dai tubi e aggiungere 1 mL di etanolo al 25% e rock per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di etanolo al 50% dai tubi e aggiungere 1 mL di preparato fresco 3% H 2 O 2 /0.5% soluzione sbiancante di KOH. Lasciare il tappi aperto e lasciare che i tubi di stare in un rack di micro-tubo per circa 10 minuti o fino a quando una debole colorazione marrone può essere visto nella parte superiore della soluzione. 
		Nota: Uno strato di forma di bolle in cima la soluzione. Attenta temporizzazione è necessario a questo punto, come sopra lo sbiancamento si tradurrà in un povero macchia double.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione sbiancante e aggiungere 1 mL di 25% glycerol/0.1% KOH; rock per 10 min a 1 h.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di KOH glycerol/0.1% 25% dai tubi, aggiungere 1 mL di soluzione KOH glycerol/0.1% 50% in ogni provetta, roccia per 10 min a tutta la notte.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione KOH glycerol/0.1% 50% dai tubi e nuovamente aggiungere 50% glycerol/0.1% soluzione di KOH in ogni provetta. A dondolo durante la notte vi aiuterà a rimuovere le bolle d'aria che può accumularsi all'interno di larve. Archivio macchiato scheletrici preparazioni a 4 ° C quando non in uso.</li>
	</ol></li> <li>Fenotipo segnando <ol><li>Punteggio macchiato prole mutante per la penetranza del fenotipo selezionato. In Nichols et al. 1 mutanti sono stati segnati per qualsiasi occorrenza dell'osso ectopico. 
		Nota: Poiché i genitori di zebrafish sono in acqua statica e la macchia di colore rosso di alizarina può scomparire col tempo, è importante segnare gli scheletri in pochi giorni di completare la preparazione scheletrica.</li>
		<li>Penetranza è la proporzione di un genotipo che ha un fenotipo. Calcolare la percentuale penetranza dalla seguente formula: % penetranza = (mutanti con fenotipo) / (numero totale di mutanti) × 100</li></ol></li></ol> 3. Selezione della famiglia <ol><li>Scegli due alta penetranza e due famiglie di penetranza bassa per la prossima generazione. Oltre a penetranza, è importante considerare la fecondità e vigore quando si sceglie quali famiglie di propagare; vedere la discussione per maggiori dettagli su questo.</li>
	<li>Dare ogni coppia genitoriale un identificatore stock sub: famiglia,01,,02, ecc</li>
	<li>Casa parentale coppie sul sistema principale con diversi sesso misto &#39; compagno &#39; pesce. Compagno pesce può essere qualsiasi linea di zebrafish con permanente, evidenti caratteristiche distintive, come struttura alterata pigmentazione o fin. 
	Nota: Mentre molti ricercatori mantenere con successo solo allevamento coppie in un serbatoio, i risultati favorevoli sono visti da alloggiamento coppie con parecchi pesci compagno. Questo passaggio facoltativo consente allevamento coppie di animali per essere tenuti nelle scuole più grandi e facilmente recuperate in modo da può essere attraversati più volte se necessario. Coppie dei genitori possono essere attraversate più volte per generare famiglie numerose pieno di pari livello; attendere almeno una settimana prima ripetizione attraversando la stessa coppia genitoriale.</li>
	<li>Abbattere le famiglie larvale dal punto 2.2.2. che non sono stati selezionati per la prossima generazione.</li>
	<li>Etichettare i serbatoi che contengono le larve di pari livello di selvaggio-tipo da famiglie selezionate con la penetranza dai loro fratelli germani mutante e sollevare fino all'età adulta come normale.</li>
	<li>La prossima generazione avrà almeno quattro famiglie di pieno-sibling, due per la linea verso l'alto e due per la linea verso il basso.</li>
	<li>Quando le larve raggiungono la maturità sessuale, ripetere il protocollo partendo dal punto uno con la nuova generazione.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Allevamento selettivo svela sottigliezze della funzione del Gene
Lo spostamento di fenotipi mutanti per essere più o meno gravi di allevamento selettivo è un modo semplice per acquisire nuove conoscenze in funzione del gene. Quando confrontato con i metodi standard di allevamento non selezionato, il protocollo qui presentato può produrre una comprensione più completa dei fenotipi mutanti. In particolare, tramite la generazione di ceppi che sono gravi, può essere rivelata l'int...

Zebrafish è un sistema potente modello per comprendere lo sviluppo scheletrico. Con ceppi mutanti di zebrafish, biologi possono decifrare la funzione del gene durante skeletogenesis. Tuttavia, zebrafish fenotipi mutanti scheletrico possono presentare con penetranza variabile1,2,3,4 che può ostacolare l'analisi evolutiva e genetiche. Lo scopo di questo metodo è triplice. In primo luogo, generando linee mutanti di zebrafish che costantemente producono fenotipi gravi consente studi evolutivi a valle come registrazione time-lapse trapianto e5 6. Questi tipi di studi possono essere paralizzati dal tentativo di studiare fenotipi che si manifestano solo in modo incoerente. In secondo luogo, l'inbreeding zebrafish ceppi può diminuire variazione background genetico, favorendo così la riproducibilità e consistenza sperimentale. Ad esempio, corso tutti in situ analisi di ibridazione su uno sforzo selettivamente inbred possono ridurre la variabilità confondenti e rafforzare le conclusioni. In terzo luogo, generando gravi e lievi ceppi rivelerà tutta la serie fenotipica che può derivare da una mutazione particolare.
A prima vista, l'allevamento selettivo di mutanti letali sembra impossibile. Come può una razza per penetranza quando gli animali che sono segnati per la selezione sono morti? Fortunatamente, metodi di allevamento selettivo di selezione della famiglia, in particolare progenie test, hanno dimostrato efficacia in allevamento programmi per molti anni7,8. Questi programmi sono utilizzati principalmente per l'allevamento selettivo per tratti che presenti solo in uno dei due sessi, come la produzione di latte delle vacche o produzione di uova nelle galline. I maschi di queste specie non possono essere segnati direttamente, ma loro progenie sono segnati e quindi viene assegnato un valore ai genitori. Prendendo in prestito da questa strategia, il protocollo presentato qui coinvolge segnando la prole mutante fissa e macchiata da una coppia di zebrafish che sono eterozigoti per un gene mutante di interesse. La penetranza di un fenotipo nella prole mutante letale omozigotico è assegnata ai genitori quando si decide quali individui produrrà la prossima generazione in linea. Troviamo che questo metodo è un efficace mezzo di spostamento penetranza in zebrafish mutanti scheletrica letale1.
Simile ad altri studi, questo protocollo di allevamento selettivo prende sotto criteri di considerazione come la nidiata, sopravvivenza della prole, normale sviluppo di embrioni e di rapporto del sesso9. Tuttavia, questi fattori sono considerati nel contesto di uno sfondo mutante con l'obiettivo di trasferire la penetranza mutante. Pertanto, il presente protocollo estende precedenti paradigmi di allevamento selettivo, offrendo un metodo per rafforzare analisi mutante inerente allo sviluppo, nonché di aumentare l'omogeneità di fondo.
Questo protocollo richiede vasta genotipizzazione, quindi è importante sviluppare un protocollo affidabile, rapido genotipizzazione in anticipo. Ci sono molti genotipizzazione protocolli disponibili10,11, tuttavia troviamo il KASP genotipizzazione12,13,14 è più veloce, costo più efficiente e più affidabile rispetto ai metodi basato sulla fenditura di enzima di restrizione di sequenze amplificate10. Di conseguenza, includiamo un protocollo KASP in questo lavoro. Inoltre, ci concentriamo sui fenotipi mutanti scheletrici in questo protocollo e includono una procedura per colorazione modificate da precedenti protocolli15Alcian blu/alizarina rossa.
Il metodo qui descritto è una strategia semplice per letale mutante penetranza di spostamento verso l'alto o verso il basso. Mentre questo protocollo si concentra sui fenotipi mutanti scheletrici, crediamo che sarà una strategia utile per allevamento di tutte le linee di zebrafish mutanti. Infatti, l'utilità di questa strategia di allevamento probabile si estende di là di zebrafish. Prevediamo che questo protocollo può essere modificato per spostare penetranza in una vasta gamma di organismi. Lo spostamento di penetranza letale progenie test può aiutare a spingere in avanti il progresso di qualsiasi genetista inerente allo sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeide, pellettato, solido</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>PFA pellettato è un'alternativa più sicura al cloruro di magnesio PFA in polvere</td></tr><tr><td>, solido</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, acquoso</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solido</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Deve provenire da Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solido</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerolo, liquido</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno, liquido</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio,&nbsp; solido</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Macchina per PCR in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp Fast con codice a barre (0,1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione Microseal 'B'</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solido</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio, solido</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquido</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Pastore a goccia controllata Pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>per la quantificazione del DNA</td></tr></tbody></table>

lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di zebrafish progenie test

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Fenotipi mutanti di zebrafish sono spesso in modo incompleto con liquidi penetranti, solo che si manifesta in alcuni mutanti. Fenotipi interessanti che compaiono in modo incoerente possono essere difficili da studiare e possono portare a risultati di confondimento. Il protocollo descritto qui è un paradigma di allevamento semplice per aumentare e diminuire la penetranza nei mutanti scheletrica letale zebrafish. Perché mutanti letali non possono essere selettivamente allevati direttamente, la strategia di allevamento selettivo classico di progenie test è impiegata. Questo metodo include anche protocolli per Kompetitive Allele specifico PCR (KASP) genotipizzazione zebrafish e colorazione zebrafish larvale della cartilagine e dell'osso. Applicare la strategia di allevamento descritta qui può aumentare la penetranza di un fenotipo scheletrico interessante consentendo ulteriori risultati riproducibili in applicazioni a valle. Inoltre, diminuendo la penetranza mutante attraverso questa strategia di allevamento selettivo può rivelare i processi di sviluppo che richiedono più fondamentalmente la funzione del gene mutato. Mentre lo scheletro in particolare è considerato qui, proponiamo che questa metodologia sarà utile per tutte le linee mutanti di zebrafish.

Questo protocollo è una tecnica di allevamento a lungo termine utile per mutanti di comprensione zebrafish scheletrico (Figura 1). Allevamento selettivo di progenie test dovrebbe produrre un cambiamento in generale penetranza sia verso il basso e verso l'alto in poche generazioni (Figura 2). Nel nostro lavoro precedente, due turni di allevamento selettivo ha guidato la penetranza media verso il basso dal 17% al 3%<sup class="xref...

L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

L'obiettivo generale di questa strategia di allevamento è manipolare la penetranza del mutante verso l'alto o verso il basso. Questo metodo di allevamento selettivo permette una comprensione più completa dei fenotipi mutanti. Generando ceppi mutanti con alta e bassa penetranza, è possibile comprendere l'intera serie fenotipica di una mutazione.La maggior parte dei mutanti di zebrafish sono recessivi letali, quindi i mutanti omozigoti muoiono prima di poter essere incrociati direttamente. Pertanto, utilizziamo la classica strategia di selezione genetica basata sul test della prole, che qui illustriamo. Abbiamo avuto per la prima volta la necessità di questo metodo quando abbiamo tentato di registrare con un'acquisizione temporizzata lo sviluppo di cellule ossee ectopiche.Con grande frustrazione, cellule ossee aggiuntive apparivano spesso nel tessuto, quindi abbiamo deciso di modificare la penetranza dei mutanti attraverso un allevamento selettivo. Sebbene applichiamo questo metodo su scala di pesce zebra con una linea mutante, esso può essere utilizzato anche per altri fenotipi mutanti del pesce zebra e probabilmente per altri organismi. Dopo aver preparato la linea iniziale di pesc

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Biologia dello sviluppo

Qui vi presentiamo un approccio sistematico per lo sviluppo fisiologicamente rilevanti, sensibile e...

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

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Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

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Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em&gt; In Vitro</em&gt; Concimazione

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Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

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Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

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Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

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