Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

L'obiettivo generale di questo protocollo è valutare sia la senescenza che il riprogrammamento in vivo nel muscolo scheletrico in seguito a lesione del tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, come ad esempio come potenziare la plasticità cellulare per favorire la rigenerazione muscolare. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un metodo affidabile per rilevare e quantificare le cellule senescenti nell'ambiente residente.

Recentemente, la senescenza cellulare è stata implicata nel riparo e nella rigenerazione dei tessuti. Comprendere i meccanismi attraverso cui la senescenza contribuisce al riparo tissutale e alla rigenerazione avrà certamente un impatto sulla medicina rigenerativa. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo indagato l'impatto potenziale del danno tissutale sulla riprogrammazione in vivo nel muscolo scheletrico.

Per iniziare questa procedura, fissare i vetrini dei campioni muscolari in paraformaldeide al 1% e glutaraldeide allo 0,2% in PBS per quattro minuti. Successivamente, lavare i vetrini con PBS due volte, per 10 minuti ciascuna. Poi, lavare i vetrini con PBS, pH 5,5 per 30 minuti.

Successivamente, incubare i campioni con la soluzione di X-gal al buio a 37 gradi Celsius per un minimo di 24 ore. Successivamente, lavare i vetrini con PBS tre volte, ogni volta per 10 minuti. Quindi, fissare ulteriormente i vetrini con PBS contenente paraformaldeide al 1% per 30 minuti.

Infine, lavare i vetrini con PBS per tre volte. Successivamente, eseguire la contrastazione con eosina 0,2% immergendo i vetrini nella soluzione di eosina per un minuto. Quindi, risciacquarli brevemente con acqua distillata.

Montare i vetrini con un mezzo di montaggio acquoso non fluorescente. Fissare i vetrini con PBS contenente paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Lavare due volte con PBS, ogni volta per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere la soluzione di permeabilizzazione e incubare per cinque minuti. Successivamente, lavare i vetrini con PBS due volte, ogni volta per cinque minuti. Nell'ultimo lavaggio, aggiungere direttamente sui vetrini 200 microlitri di PBS contenente BSA allo 0,25% per cinque minuti.

Incubare i vetrini con l'anticorpo primario anti-Nanog a 1,25 microgrammi per millilitro durante la notte a 4 gradi Celsius in PBS contenente FBS al 5%. Lavare i vetrini con PBS due volte, ogni volta per 10 minuti. Nell'ultimo lavaggio, utilizzare 200 microlitri di PBS contenente BSA allo 0,25% per cinque minuti.

Successivamente, incubare i vetrini con 100 microlitri di anticorpo secondario RAB-HRP proveniente da un kit pronto all'uso per 45 minuti. Quindi, lavare i vetrini con PBS tre volte, ogni volta per cinque minuti, per rimuovere l'anticorpo secondario. Successivamente, diluire il DAB nel tampone substrato fornito nel kit pronto all'uso.

Agitare vigorosamente. Aggiungere 100 microlitri di soluzione DAB direttamente su ogni vetrino e incubare per un massimo di 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione DAB lavando i vetrini con acqua.

Contrastare i vetrini con la soluzione di rosso rapido per due minuti. Successivamente, lavare nuovamente i vetrini con acqua, brevemente. Dopodiché, disidratarli con etanolo al 95% per cinque minuti, seguito da etanolo al 100% due volte, ogni volta per cinque minuti.

In seguito, montare i vetrini con un mezzo di montaggio a rapida polimerizzazione. Osservare i vetrini al microscopio in campo chiaro a 20x per evitare interferenze di fondo. In questa procedura, esaminare i vetrini e selezionare le due sezioni di migliore qualità su ciascun vetrino, poste alla massima distanza possibile tra loro, in base all'integrità del tessuto, alla qualità della colorazione e della controcolorazione.

Contare le cellule positive per SA-Beta-Gal in queste due sezioni e calcolare il valore medio. Quindi, determinare il rango della dimensione dei pixel selezionando manualmente la cellula positiva per SA-Beta-Gal più piccola e quella più grande. Nell'interfaccia di ImageJ, fare clic su Analizza, Strumenti, Gestore ROI, Analizza, Imposta misurazione.

Quindi, selezionare Area. Utilizzare lo strumento di selezione e delimitare la cellula SA-Beta-Gal positiva più piccola e quella più grande, quindi aggiungerle al Gestore ROI cliccando su Aggiungi. Successivamente, misurare le dimensioni utilizzando il pulsante Misura e salvare i valori per un uso successivo.

Successivamente, regolare il parametro di soglia per assicurarsi che tutte le cellule positive visibili siano selezionate. Convertire l'immagine in scala di grigi cliccando su Immagine, Tipo, quindi 8 bit. In seguito, andare su Immagine, Regola e Soglia.

Spostare il secondo cursore finché tutte le cellule SA-Beta-Gal positive non sono coperte di rosso, quindi fare clic su Applica. Analizzare le particelle facendo clic su Analizza, Analizza particelle, seguito da Dimensione e applicare il valore definito in precedenza. Inserire Circolarità, 0,00-1,00, quindi fare clic su OK. Un riepilogo di tutte le particelle contate verrà visualizzato nel Gestore ROI.

Ora, trasferire tutte le particelle selezionate nell'immagine originale. Regolare manualmente la selezione per garantire una quantificazione accurata. Aggiungere cellule positive o rimuovere le cellule falsamente positive.

Infine, misurare l'area delineando la sezione mediante lo strumento di selezione. Fare clic su Gestore ROI, Aggiungi, quindi Misura. Al microscopio, contare manualmente le cellule positive a Nanog in campo chiaro a un ingrandimento di 20x.

Qui è mostrata una rappresentazione schematica per valutare il riprogrammazione in vivo e il livello di senescenza dopo un danno muscolare. Di seguito sono riportate immagini rappresentative della colorazione SA-Beta-Gal e di Nanog su sezioni congelate di muscolo scheletrico leso. Queste immagini mostrano la colorazione SA-Beta-Gal, contrastata con eosina, e la colorazione di Nanog, contrastata con rosso rapido.

I muscoli non lesi sono mostrati nella parte superiore, mentre i muscoli lesi sono mostrati nella parte inferiore. Questo grafico mostra la quantificazione e la correlazione tra cellule positive per SA-Beta-Gal e cellule positive per Nanog in sezioni consecutive a 10 giorni dal trauma. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di includere sempre un controllo negativo per garantire la specificità della colorazione.

Seguendo questa procedura, tutti i metodi, come l'immunofluorescenza o la scelta di diversi marcatori della senescenza, possono essere eseguiti su ogni tipo cellulare al fine di rispondere a ulteriori domande, come l'identità cellulare delle cellule senescenti. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della senescenza o della riparazione e rigenerazione dei tessuti, permettendo di esplorare come la senescenza cellulare possa promuovere la plasticità cellulare per facilitare la riparazione e la rigenerazione dei tessuti nei mammiferi. Pertanto, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare in vivo sia le cellule senescenti che quelle riprogrammate.