Name: Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Impara a valutare la senescenza e la riprogrammazione in vivo nel muscolo scheletrico dopo lesione. Questo metodo consente di rilevare e quantificare le cellule senescenti per studiare la rigenerazione tessutale.

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Siamo grati a Clemire Cimper per il suo eccellente supporto tecnico. Lavoro nel laboratorio di H.L. è stato finanziato dal Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche scientifica e l'Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e la Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. e C.A. sono finanziate con il dottorato di ricerca e borse di studio post-dottorati dal Consorzio rivivere.

gli animali sono stati trattati secondo le linee guida della Comunità europea e il comitato etico, dei protocolli Institut Pasteur (CETEA) approvato.
 1. preparazione delle soluzioni Stock <ol><li>preparare i materiali per la fissazione del campione di muscolo. Sciogliere 0,5 g di adragante con 20 mL di acqua a temperatura ambiente per rendere il supporto l'incorporamento di congelamento per la fissazione del muscolo.</li>
	<li>Preparare le soluzioni per la colorazione del SA-β-gallone.
	<ol><li>Preparare le soluzioni di riserva di K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1m) sciogliendo le rispettive polveri in acqua distillata.</li>
		<li>Preparare la soluzione di riserva di 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (eosina) di diluirla in acqua.</li>
		<li>Non preparare la soluzione di riserva di C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) di dissoluzione della polvere di X-gal in C 3 H 7 nessun (dimetilformammide, DMF).</li>
		<li>Store K 3 Fe(CN) 6 e K 4 Fe(CN) 6 soluzioni a 4 ° C e MgCl 2 a RT. 
		Nota: il X-gal possono essere memorizzati nella aliquota a-20 ° C, fino a 6 mesi. Soluzione di eosina può essere mantenuto a RT e riutilizzato dopo aver filtrato se necessario. K 3 Fe(CN) 6 e K 4 Fe(CN) 6 soluzioni protectedfromthe luce. X-gal soluzione non è stabile in acqua e deve essere protetto dalla luce.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione delle soluzioni per la macchiatura Nanog: la soluzione di permeabilizzazione contiene 0.1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (citrato trisodico), 0,1% C 14 H 22 Oh (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) in acqua distillata, che deve essere conservato a 4 ° C. preparare la soluzione di blocco contenente 5% siero bovino fetale (FBS) in tampone fosfato salino (PBS), che deve essere conservato a RT.</li>
</ol> 2. SA-β-gallone colorazione su Frozen TA muscolare sezione <ol><li>preparare il materiale di fissaggio per il muscolo TA introducendo una piccola quantità della gomma adragante gomma su una fetta di sughero.</li>
	<li>Infortunato topi di entrambi i sessi (2 mese vecchio, C57/B6) sono rimasti feriti a 10 giorni prima con con (CDX) come descritto in precedenza 13. Uso non-ferito (iniezione di PBS) TA dallo stesso mouse come controllo negativo. Se in vivo riprogrammazione è desiderato, trattare ogni mouse con Dox (1 mg/mL) nell'acqua potabile nello stesso giorno (protetto dalla luce), subito dopo la ferita di CTX. 
	Nota: La soluzione di Dox deve essere cambiata ogni 3 giorni per una durata totale del trattamento di 7 giorni.
	<ol><li>Isolare entrambi i muscoli di TA (ferito e controllare) dai topi come descritto in precedenza ( Figura 1A) 13. Garantire le sezioni trasversale, inserire il tendine distale del muscolo TA la gomma adragante e lasciare circa ¾ parte del muscolo all'esterno ( Figura 1B) e congelare direttamente in azoto liquido raffreddato isopentano per &#60; 1 min. 
		Nota: Assicurarsi che il muscolo di TA è in posizione perpendicolare e nel centro del sughero. Campioni possono essere conservati a-80 ° C o direttamente cryosectioned in 10 sezioni µm.</li>
	</ol></li> <li>i muscoli di TA di processo come descritto in Figura 1B.
	<ol><li>Distribuisci 1 st -10 th sezioni nell'ordine corretto in dieci diverse diapositive presso la posizione superiore sinistra di ciascuna diapositiva. Posizionare la sezione th 11 adiacente alla sezione st 1 sulla prima diapositiva; la sezione di th 12 seguirà lo stesso ordine per essere posizionato a destra oltre alla sezione 2 nd della seconda diapositiva. Ripetere questo processo fino a 10 sezioni/diapositiva sono ottenuti per dieci diapositive (100 sezioni in totale) per garantire il minimo di 1 mm di distanza tra la prima e l'ultima sezione.</li>
	</ol></li> <li>Fissare le sezioni per 4 min in PBS contenente 1% di paraformaldeide e 0,2% glutaraldeide. Lavare con PBS, 2 x 10 min. Successivamente, incubare le sezioni in PBS (pH = 5.5) per 30 min. eseguire tutti i passaggi a RT. 
	Nota: La fissazione deve essere delicato per mantenere l'attività enzimatica. Eseguire questo passaggio sotto il cofano. Il pH della PBS è fondamentale e la soluzione X-gal dovrà essere protetti dalla luce.</li>
	<li>Sezioni Incubare il X-gal soluzione contenente: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4mm K4Fe(CN) 6, 2mm MgCl2 e X-Gal di 400 µ g/mL in PBS, pH = 5.5. Incubare al buio a 37 ° C per un minimo di 24 h. lavare i vetrini con PBS, 3 x 10 min, a RT. 
	Nota: L'incubazione richiede un minimo di 24 ore e può durare 48 ore massimizzare il segnale SA-β-gallone. La soluzione deve essere cambiato dopo 24 ore di incubazione. Le diapositive devono essere protetti dalla luce. Se solo SA-β-gallone macchiatura è desiderata, passare al punto 2.5. Se co-macchiatura con Nanog è desiderata, andare avanti a passaggio 3.1.</li>
	Paraformaldeide <li>fix diapositive in 1% in PBS per 30 min Lavaggio vetrini con PBS, 3 x 10 minuti controcolorazione con eosina 0,2%. Immergere i vetrini nella soluzione eosina per 1 min e sciacquare brevemente con acqua distillata. Infine, montare i vetrini con mezzo di montaggio acquoso non fluorescente (Vedi Tabella materiali). 
	Nota: È essenziale per eseguire la post-fissazione. Eseguire questo passaggio sotto il cofano. Tutti i passaggi sono eseguiti presso RT.</li>
</ol> 3. Immunoistochimica utilizzando anticorpi Anti-Nanog <ol><li>fissare le diapositive con PBS contenente paraformaldeide al 4% per 10 min. lavaggio con PBS, 2 x 10 minuti aggiungere 200 µ l della soluzione di permeabilizzazione direttamente sulle diapositive e incubare per 5 min. <ol><li>Wash scivoli con PBS, 2 x 5 min e nell'ultimo lavaggio, uso 200 µ l PBS contenente 0,25% BSA direttamente sulle diapositive. Eseguire questa procedura al RT. 
		Attenzione: Eseguire il passaggio di fissaggio sotto il cofano.</li>
	</ol></li> <li>Diapositive Incubate con l'anticorpo primario anti-Nanog (concentrazione finale: 1.25 ug/mL) durante la notte a 4 ° C in PBS contenente 5% FBS. Lavare i vetrini con PBS, 2 x 10 min e nell'ultimo lavaggio, uso 200 µ l PBS contenente 0,25% BSA per 5 min, eseguire tutto il bucato passi a RT. 
	Nota: Incubare i vetrini in una scatola con tovagliolo di carta bagnato per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Incubare diapositive con 100 µ l di anticorpo secondario rAb-HRP da un pronto per l'uso del kit (Vedi Tabella materiali) per 45 min. lavare le diapositive con PBS, 3 x 5 min, a rimuovere l'anticorpo secondario. Eseguire tutti i passaggi a RT con protezione dalla luce.</li>
	<li>Visualizzazione <ol><li>in primo luogo, diluire il 3,3 &#39;-diaminobenzidina (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) in tampone substrato fornito pronto per usare il kit (20 µ l di DAB per 1 mL di soluzione tampone del substrato). Aggiungere 100 µ l di soluzione di DAB direttamente su ogni diapositiva e incubare per un massimo di 10 min a RT. 
		Nota: La soluzione DAB diluita deve essere preparata fresca e possa essere memorizzata fino a una settimana a 4 ° C. Il tempo di incubazione può essere registrato per ridurre al minimo il segnale di fondo ma deve essere mantenuto lo stesso per tutte le diapositive.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione DAB risciacquando con acqua. Colorante di contrasto le diapositive con soluzione rosso veloce (pronto da utilizzare, vedere la Tabella materiali) per 20 min. lavare i vetrini con acqua ancora brevemente.</li>
		<li>Li disidrata con etanolo al 95% per 5 min seguito da etanolo al 100%, 2 x 5 min. Infine, montare i vetrini con mezzo di montaggio rapido indurimento (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Osservare i vetrini al microscopio in campo chiaro alle 20 X per evitare sfondo. 
		Nota: Soluzione rosso veloce può essere mantenuto a RT e riutilizzata dopo il filtraggio.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analisi e quantificazione <ol><li>SA-β-gallone quantificazione <ol><li>scansione di diapositive e scegliere le migliori sezioni su ogni diapositiva sulla base delle immagini acquisite. Utilizzare almeno 2 sezioni/TA per la quantificazione. Giudicare la sezione &#39; s qualità basata sull'integrità del tessuto, qualità della colorazione e colorazione di contrasto. Per la quantificazione, scegliere le due sezioni di più alte qualità con la massima distanza possibile tra campioni, che consente una migliore rappresentazione di quantificazione di SA-β-gallone in tutta l'intera muscolatura TA.</li>
		<li>Quantificazione delle cellule positive SA-β-gallone ( Figura 2).
		<ol><li>Determinare il grado della dimensione in pixel selezionando manualmente il più piccolo e il più grande cellule positive di SA-β-gallone.
			<ol><li>Aprire l'immagine digitale della diapositiva digitalizzata utilizzando software ImageJ.</li>
				<li>Nell'interfaccia, fare clic su &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; Strumenti &#39; &#62; &#39; ROI Manager &#39; &#62; &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; impostare misura &#39; &#62; &#39; selezionare Area &#39;. Usate lo strumento selezione e circondano il più piccolo e positivo SA-β-gallone più grande delle cellule e aggiungerlo al gestore di ROI cliccando su &#39; Aggiungi &#39;. Misurare le dimensioni utilizzando la &#39; misura &#39; pulsante e salvare i valori per un utilizzo successivo.</li>
			</ol></li> <li>Regolare il parametro di soglia per assicurarsi che siano selezionate tutte le celle visibili positive.
			<ol><li>Convertire l'immagine in scala di grigi cliccando &#39; immagine &#39; &#62; &#39; tipo &#39; &#62; &#39; 8-bit &#39; ( Figura 2A). Poi, vai a &#39; immagine &#39; &#62; &#39; regola &#39; &#62; &#39; soglia &#39;, spostare il cursore di secondo fino a quando tutte le celle di SA-β-gallone positive sono coperti in rosso ( Figura 2B), quindi fare clic su &#39; applica &#39;.</li>
				<li>Analizza particelle cliccando &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; analizzare particelle &#39; &#62; &#39; dimensioni (pixel ^ 2) &#39; e applicare il valore definito nel passaggio 4.1.2.1, immettere &#39; circolarità &#39;: &#39; 0.00-1.00 &#39;, fare clic su &#39; ok &#39;; un riepilogo di tutti il conteggiate particelle è mostrato nel gestore di ROI ( Figura 2D).</li>
			</ol></li> <li>Trasferire tutte le particelle selezionate l'immagine originale. Regolare la selezione manualmente per garantire accurata quantificazione. Aggiungere le cellule positive (freccia verde, Figura 2E) e/o rimuovere cellule positive false (freccia rossa, Figura 2E). Infine, misurare l'area delineando la sezione ( Figura 2D) utilizzando il &#39; strumento selezione &#39;. Fare clic su &#39; manager ROI &#39; &#62; &#39; Aggiungi &#39; &#62; &#39; misura &#39;.</li>
			<li>Importante, normalizzare il numero di cellule positive per l'area della sezione.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog quantificazione <ol><li>contare le cellule positive di Nanog sotto il microscopio nel campo luminoso manualmente a 20 ingrandimenti. 
		Nota: La colorazione di contrasto rosso veloce permette buona valutazione della morfologia del muscolo TA. Tuttavia, la colorazione è molto leggera e manca di un chiaro profilo della sezione. Spesso, lo scanner non riesce a identificare il contorno delle sezioni e non messa a fuoco correttamente. È possibile utilizzare il marcatore per i bordi delle sezioni del cerchio prima della scansione o utilizzare uno scanner più sensibile per rilevare la sezione. Per il protocollo attuale, è più efficiente per contare le cellule positive di Nanog manualmente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li>
<li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SA+beta+Gal+staining%3A+biomarker+or+delusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui, presentiamo un metodo per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico di topi riprogrammabili. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per valutare e quantificare sia senescenza e indurre la plasticità cellulare in vivoed esaminare il ruolo della senescenza in rigenerazione e riparazione tissutale.
Nel protocollo attuale, l'analisi di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è usata per rilevare in vivo le cellule sene...

La senescenza cellulare è una forma di risposta allo stress, caratterizzata da un arresto del ciclo cellulare stabile. Nell'ultimo decennio, la ricerca ha fermamente stabilito che la senescenza è associata con vari processi biologici e patologici, compreso lo sviluppo embrionale, la fibrosi e organismo invecchiamento1,2. La senescenza cellulare è stata identificata in fibroblasti umani alla fine della loro durata di vita ripetitiva innescato da3di riduzione del telomero. Oltre lo stress ripetitivo, ci sono molti altri stimoli che possono indurre senescenza, inclusi danni DNA, stress ossidativo, segnali oncogenici e alterazioni genomiche/epigenomic, che alla fine può attivare le vie p53/p21 e/o pRB stabilire e rafforzare la crescita permanente arresto1. Una delle caratteristiche importanti delle cellule senescenti è che essi rimangono metabolicamente attive e robustamente esprimere un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP): secrezione di molte citochine infiammatorie, fattori di crescita e matrice extracellulare fattori4. SASP fattori sono stati proposti a giocare un ruolo importante nel mediare e amplificando l'effetto di senescenza, dovuto i loro effetti potenti su attirando le cellule immuni e alterazione del tessuto locale e sistemica ambienti1. È interessante notare che, senescenza è stato recentemente proposto per essere importante per tessuto riparazione e rigenerazione5,6. Inoltre, i dati da diversi laboratori, compreso il nostro, ha suggerito che la senescenza indotta da danni del tessuto potrebbe migliorare la plasticità cellulare, via SASPs, per promuovere la rigenerazione7–9. Di conseguenza, tutti i dati emergenti evidenziano l'importanza di studiare la senescenza in vivo.
Nell'era post-(iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, plasticità cellulare è la capacità di una cellula di acquisire una nuova identità e di adottare un destino alternativo quando esposto a stimoli diversi nella cultura ed in vivo10. È noto che la riprogrammazione completa può essere raggiunto in vivo11,12, dove l'espressione della la cassetta contenente quattro fattori Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4e c-Myc (OSKM) può essere indotta in vivo per promuovere la formazione di teratomi negli organi multipli. Di conseguenza, un modello di topo riprogrammabile (i4F) utilizzabile come un potente sistema per identificare i regolatori critici e vie che sono importanti per plasticità cellulare11.
Un sistema adatto e sensibile in vivo è essenziale per capire la senescenza cellulare come regola la plasticità cellulare nell'ambito della rigenerazione dei tessuti. Qui, presentiamo un sistema robusto e un protocollo dettagliato per valutare il collegamento tra senescenza e plasticità cellulare nell'ambito della rigenerazione dei tessuti. Il danno muscolare di combinazione di con (CTX) indotta nel gruppo del muscolo tibiale anteriore (TA), un sistema ben consolidato per studiare la rigenerazione dei tessuti e il modello del mouse i4F, permette la rilevazione della senescenza cellulare sia in vivo riprogrammazione durante la rigenerazione del muscolo.
Per valutare il collegamento tra plasticità cellulare e senescenza, i4F topi sono feriti con CTX per indurre il danno muscolare acuto e trattati con doxiciclina (0,2 mg/mL) per 7 giorni per indurre in vivo riprogrammazione. Mentre un CTX indotta danno muscolare acuto e protocollo di rigenerazione è stato recentemente pubblicato13, per motivi etici, questa procedura verrà omesso nel protocollo corrente. Saranno raccolti campioni di muscolo TA a 10 giorni post infortunio13, quando il picco delle cellule senescenti sono state precedentemente osservate14. Qui, questo protocollo dettagliato descrive tutti i passaggi necessari per valutare il livello di senescenza (via SA-β-gallone) e riprogrammazione (via IHC che macchia di Nanog).
Dosaggio di beta-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è il test più comunemente usato per rilevare cellule senescenti entrambi nella cultura ed in vivo15. Rispetto ad altre analisi, il dosaggio di SA-β-gallone permette l'identificazione delle cellule senescenti nel loro ambiente nativo con architettura di tessuto intatto, che è particolarmente importante per lo Studio in vivo . Inoltre, è possibile accoppiare il saggio SA-β-gallone con altri marcatori utilizzando IHC. Tuttavia, il dosaggio di SA-β-gallone richiedono campioni freschi o congelati, che rimane una limitazione importante. Quando i tessuti freschi o surgelati sono ordinariamente disponibili, come i campioni di muscolo TA congelati, SA-β-gallone è ovviamente il dosaggio più adatto per rilevare cellule senescenti. Nanog è il marcatore utilizzato per rilevare le cellule riprogrammate per due motivi: 1) è un indicatore essenziale per la pluripotenza; 2) più importante, l'espressione non è guidato da doxiciclina (dox), pertanto si rileva pluripotenza indotta piuttosto che l'espressione forzata della cassetta Yamanaka.
È importante notare che i protocolli di colorazione presentati in questo studio possono essere condotto separatamente per semplificare la procedura di quantificazione, ma possono anche essere fatto in una procedura di co-colorazione per visualizzare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti sulla stessa sezione.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>Per SA-&beta; Soluzione colorante Gal</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>Per SA-&beta; Soluzione colorante Gal</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>Per SA-&beta; Soluzione colorante Gal</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>per SA-&beta; Soluzione colorante Gal</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>Per indurre la riprogrammazione in vivo</td></tr><tr><td>Cardiotossina</td><td>Lotaxan Valence, Francia</td><td>L8102</td><td>Per lesioni muscolari</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>Per soluzione di fissazione</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica scienza</td><td>50-980-487</td><td>Per soluzione di fissazione</td></tr><tr><td>NaCitrato : Citrato di sodio monobasico bioxtra, anidre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>Per soluzione di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Per soluzione di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Soluzione di lavaggio</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Nanog</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>8822S</td><td>Anticorpo monoclonale di coniglio</td></tr><tr><td>Kit EnVision+ (HRP. Coniglio. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>Per Nanog rivelazione</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Controcolorazione</td></tr><tr><td>Rosso veloce</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Controcolorazione</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Soluzione di montaggio</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio a indurimento rapido per microscopia : Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Soluzione di montaggio</td></tr><tr><td>Microscopio Contrasto di fase Campo chiaro CKX41: obiettivi 10X-20X-40X</td><td>Microscopio Olympus</td><td>CKX41</td><td>per quantificazione Nanog</td></tr><tr><td>Topo: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Modello di topo riprogrammabile</td></tr><tr><td>Muscolo scheletrico, tibiale Scanner per</td> vetrini anteriori <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>scansione di diapositive</td></tr></tbody></table>

valutazione delle lesioni-indotta senescenza e in vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

La senescenza cellulare è una risposta di sforzo che è caratterizzata da un arresto della crescita cellulare stabile, che è importante per molti processi fisiologici e patologici, quali il cancro e invecchiamento. Recentemente, la senescenza è stata implicata anche nella rigenerazione e riparazione tissutale. Di conseguenza, è diventato sempre più importante per identificare cellule senescenti in vivo. Analisi di β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è il test più ampiamente usato per rilevare le cellule senescenti, sia in coltura che in vivo. Questa analisi è basata sul contenuto lysosomal aumentato nelle cellule senescenti, che permette la rilevazione istochimica di attività lisosomiale della β-galattosidasi a pH trovata (6 o 5.5). In confronto con altri dosaggi, come la citometria a flusso, ciò permette l'individuazione delle cellule senescenti nel loro ambiente residente, che offre importanti informazioni come la posizione relativa all'architettura del tessuto, la morfologia e la possibilità di abbinamento con altri marcatori tramite immunoistochimica (IHC). La limitazione principale del saggio SA-β-gallone è il requisito di campioni freschi o congelati.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per comprendere la senescenza cellulare come promuove la rigenerazione di tessuto e plasticità cellulare in vivo. Utilizziamo SA-β-gallone per rilevare cellule senescenti in muscolo scheletrico dopo un danno, che è un sistema ben consolidato per studiare la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, utilizziamo IHC per rilevare Nanog, un marcatore delle cellule staminali pluripotenti, in un modello di topo transgenico. Questo protocollo consente di esaminare e quantificare la senescenza cellulare nel contesto della plasticità cellulare indotto e in vivo di riprogrammazione.

Rilevare la senescenza cellulare indotta da lesione muscolare
Recentemente è stato dimostrato che la lesione del muscolo induce senescenza cellulare transitoria14. A 10 giorni post-infortunio (DPI), la maggior parte dei myofibers danneggiati è in fase di rigenerazione con nuclei in posizione centrale, un segno distintivo della rigenerazione delle fibre muscolari, e l'architettura del muscolo viene ristabilit...

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico dopo un danno mentre induce in vivo riprogrammazione. Questo metodo è adatto per valutare il ruolo della senescenza cellulare durante rigenerazione tissutale e riprogrammazione in vivo.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è valutare sia la senescenza che il riprogrammamento in vivo nel muscolo scheletrico in seguito a lesione del tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, come ad esempio come potenziare la plasticità cellulare per favorire la rigenerazione muscolare. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un metodo affidabile per rilevare e quantificare le cellule senescenti nell'ambiente residente.Recentemente, la senescenza cellulare &egrave; stata implicata nel riparo e nella rigenerazione dei tessuti. Comprendere i meccanismi attraverso cui la senescenza contribuisce al riparo tissutale e alla rigenerazione avr&agrave; certamente un impatto sulla medicina rigenerativa. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo indagato l'impatto potenziale del danno tissutale sulla riprogrammazione in vivo nel muscolo scheletrico.Per iniziare questa procedura, fissare i vetrini dei campioni muscolari in paraformaldeide al 1% e glutaraldeide allo 0,2% in PBS per quattro minuti. Successivamente, lavare i vetrini con PBS due volte, per 10 minuti ciascuna. Poi, lava

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Biologia dello sviluppo

Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Il muscolo scheletrico è essenziale per la locomozione ed è il principale negozio di proteine ​​dei corpi. Muscle misure sanitarie all'interno C. elegans sono descritti. I potenziali modifiche alla struttura e la funzione muscolare, valutati in base GFP localizzate e coloranti cationici.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in C. elegans

Questo protocollo descrive un metodo affidabile, riproducibile e semplice di isolamento e la coltura di cellule progenitrici dei mioblasti dal muscolo scheletrico di adulti e persone anziane. I muscoli usati qui sono i muscoli della gamba e del piede. Questo approccio consente l'isolamento di una popolazione arricchita di mioblasti primari per studi funzionali.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Descriviamo una tecnica sperimentale che chiamiamo minimamente invasiva muscolo Embedding (MIME), che si basa sull'evidenza che il tessuto muscolare scheletrico contiene cellule miogeniche vitali che possono facilitare la miogenesi donatore-cellula-mediata quando impiantato nel un muscolo di host.

Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

Misurazione della funzione contrattile del muscolo scheletrico del roditore è uno strumento utile che può essere utilizzato per monitorare la progressione della malattia, nonché l'efficacia di intervento terapeutico. Descriviamo qui la valutazione non invasiva, in vivo dei muscoli dorsiflexor che può essere ripetuto nel tempo nello stesso mouse.

Valutazione non invasiva della funzione Dorsiflexor muscolare nei topi

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

In questo protocollo viene descritto un metodo di coltivazione e analisi funzionale in vitro per le cellule staminali muscolari, che conserva la maggior parte delle loro interazioni con la loro nicchia endogena.

Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

Il muscolo scheletrico comprende più tipi di cellule, comprese le cellule staminali residenti, ognuna con un contributo speciale all'omeostasi e alla rigenerazione muscolare. Qui vengono descritte la coltura 2D di cellule staminali muscolari e la nicchia delle cellule muscolari in un ambiente ex vivo che conserva molte delle caratteristiche fisiologiche, in vivo e ambientali.

Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali

L'obiettivo di questo protocollo è stabilire un modello di fibrosi muscolare orofacciale. Il confronto dell'istologia tra il massetere dei topi e il muscolo tibiale anteriore dopo la lesione da congelamento ha confermato la fibrosi del muscolo massetere. Questo modello faciliterà ulteriori indagini sul meccanismo alla base della fibrosi muscolare orofacciale.

Lesione da congelamento nel muscolo massetere del topo per stabilire un modello di fibrosi muscolare orofacciale

Impara a valutare la senescenza e la riprogrammazione in vivo nel muscolo scheletrico dopo lesione. Questo metodo consente di rilevare e quantificare le cellule senescenti per studiare la rigenerazione tessutale.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

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