Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli
22 agosto 2017
Qui presentiamo un metodo per misurare direttamente il RNA di trasferimento carica livelli da purificato Escherichia coli RNA così come un modo per confrontare i livelli relativi di RNA di trasferimento, o qualsiasi altri RNA breve, attraverso diversi campioni basati sull'aggiunta di spike-a cellule che esprimono un gene di riferimento.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare l'abbondanza e i livelli di carica degli RNA di trasferimento in Escherichia coli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come ad esempio come cambiano i livelli di carica del tRNA nei diversi stati di crescita. Il vantaggio principale di questo metodo è che i livelli di RNA possono essere confrontati quantitativamente anche tra stati di crescita che alterano drasticamente la composizione dell'RNA nelle cellule.
Inizia questo esperimento coltivando colture sperimentali e spike-in di E.coli secondo il protocollo di testo. Coltiva la coltura spike-in a 37 gradi Celsius, agitando a 160 giri/min. Quando la coltura spike-in ha raggiunto un OD436 di circa 0,1, indurre l'espressione della cellula C di tRNA aggiungendo IPTG.
Coltiva la coltura fino a raggiungere un OD436 di circa 0,5. Quindi, sposta la coltura sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono stati raccolti. Successivamente, preriscaldare un pallone di coltura da 100 millilitri contenente quattro millilitri di TCA al 10% per ciascun campione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Misurare e registrare l'OD436 delle colture sperimentali direttamente prima della raccolta delle cellule. Quindi, trasferire quattro millilitri di coltura in un pallone preriscaldato contenente TCA. Mescolare il campione a mano facendo roteare il pallone per cinque secondi, in modo da disabilitare immediatamente tutte le attività enzimatiche preservando i livelli di carica dei tRNA.
Quando tutti i campioni sono stati raccolti, aggiungere il 5% di celle spike-in a ciascun campione. Preparare anche un campione di controllo costituito solo da celle spike-in come descritto nel protocollo di testo. Per avviare l'estrazione dell'RNA, versare otto millilitri di ciascun campione, compresi i controlli, in una provetta da centrifuga raffreddata con ghiaccio.
Centrifugare i campioni a 9, 500 x G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver rimosso completamente il surnatante, risospendere il pellet in 0,3 millilitri di acetato di sodio freddo, contenente 10 millimolari di EDTA. Trasferire ogni campione in una provetta da microcentrifuga fredda da 1,5 millilitri e aggiungere 0,3 millilitri di fenolo bilanciato con il tampone, utilizzato per risospendere il pellet.
Quindi, agitare ogni campione 10 volte per 15 secondi ogni volta. Con almeno un minuto a zero gradi Celsius tra ogni vortice, per mantenere i campioni freddi. Quindi, centrifugare i campioni a 20.000 x G a quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Trasferire la parte superiore o la faccia dell'acqua in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,3 millilitri di fenolo freddo alla faccia dell'acqua e agitare i campioni quattro volte 15 secondi ciascuno, come descritto in precedenza. Quindi, centrifugare i campioni a 20.000 x G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Trasferire il fronte d'acqua in una nuova provetta da microcentrifuga fredda da 1,5 millilitri e aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo al 96%. Quindi, incubare le provette a 20 gradi Celsius per un'ora per far precipitare l'RNA. Centrifugare i campioni a 20.000 x G a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere con cura un millilitro di etanolo freddo al 70% al pellet di RNA, facendo attenzione a non disturbarlo. Capovolgere delicatamente il tubo una volta, per lavarlo con etanolo. Infine, centrifugare a 20.000 x G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere completamente il surnatante e asciugare il pellet all'aria fino a rimuovere completamente l'etanolo. A 20 microlitri di acetato di sodio freddo contenente 1 millimolare di EDTA, vorticare energicamente per risospendere il pellet. Per iniziare l'elettroforesi, mescolare quattro microlitri di ciascun campione con sei microlitri di tampone di caricamento.
Caricare i campioni, compresi i controlli, su un gel di poliacrilammide 6,5 di 0,4 millimetri di spessore contenente otto molari di ureale e 0,1 molari di tampone di acetato di sodio. Quindi, separare l'RNA eseguendo l'elettroforesi a 10 volt per centimetro di gel a quattro gradi Celsius per circa 20 ore fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel. Separare accuratamente le due lastre di vetro in modo che il gel rimanga su una di esse.
Utilizzare l'area del gel dal colorante xilene cianolo e 20 centimetri verso il basso verso il colorante bromofenolo per tamponare. Tagliare un sottile pezzo di carta da filtro della dimensione dell'area di tamponamento desiderata. Posizionare la carta da filtro sopra la parte del gel che verrà utilizzata per il tamponamento.
Tagliare ed eliminare le parti del gel non ricoperte con carta da filtro. Quindi utilizzare la carta da filtro per sollevare con cautela il gel dalla lastra di vetro. Posizionare una membrana di nylon caricata positivamente sopra il gel e tamponarla con elettropulsione nel buffer di trasferimento a 20 volt per 90 minuti.
Termina collegando l'RNA alla membrana usando la luce UV. Quindi, posizionare la membrana reticolata in un tubo di ibridazione e aggiungere sei millilitri di soluzione di ibridazione. Ruotare il tubo a 42 gradi Celsius per un'ora per pre-ibridare la membrana.
Quindi, aggiungere 30 sonde di oligoDNA radioattivo molare a picco, cinque prime e marcate con P32. Ruotare per incubare la membrana con la sonda a 42 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta monouso da 10 millilitri per rimuovere la sonda.
Successivamente, lavare rapidamente la membrana due volte nel tubo di ibridazione, in 15 millilitri di soluzione di lavaggio a temperatura ambiente. Spostare la membrana in un contenitore di plastica piatto, coprirla con la soluzione di lavaggio e chiudere il coperchio. Incubare la membrana su uno shaker a temperatura ambiente per 30 minuti.
Cambiare la soluzione e continuare il lavaggio fino a raggiungere un rapporto segnale/rumore soddisfacente. Utilizzare un tubo di muller geiger per ottenere il rapporto segnale/rumore, confrontando la radiazione proveniente dall'area in cui la sonda si è ibridata con il tRNA, con la radiazione proveniente da un'area vuota. Successivamente, avvolgere strettamente la membrana in un involucro di plastica e sigillarla ermeticamente mediante saldatura.
Posizionare questa membrana su uno schermo di fosforaging. Dopo un adeguato tempo di esposizione, scansionare lo schermo utilizzando uno scanner laser e salvare il file in formato gel. Quindi, caricare il file gel nel software di imaging.
Disegna una linea verticale lungo ciascuna delle corsie di campionamento in modo che si estenda per la maggior parte della larghezza della corsia, escludendo i bordi delle bande in cui il segnale può essere irregolare. Per visualizzare i conteggi di ciascuna corsia, fare clic su analisi e quindi su Crea grafico. Definisci manualmente i due picchi che rappresentano il tRNA carico e quello non carico da ciascuna corsia.
Successivamente, fai clic su analisi e quindi su rapporto area per ottenere conteggi da ogni picco. Infine, registra l'area sotto ciascuna delle due cime. Calcola i livelli di tRNA come descritto nel protocollo di testo.
Questo metodo è stato utilizzato per misurare l'abbondanza di vari tRNA ed E.Coli nf915 prima e durante la nostra carenza di arginina. Sul grafico settentrionale ibridato con diverse sonde di tRNA, c'è una netta separazione tra le bande che rappresentano il tRNA carico dalle bande che rappresentano il tRNA non caricato. Il profilo di radiazione lungo ogni corsia è stato ottenuto dalle macchie settentrionali utilizzando un software di imaging.
Il segnale di radiazione da ciascuna corsia è stato quantificato isolando ciascuna dal blot. Un grafico che rappresenta la quantificazione del segnale proveniente da una singola corsia, mostra due picchi. Il picco sinistro proviene dal tRNA amminoacilato e quello destro dal tRNA deacilato.
L'area sotto ogni picco viene esportata per ulteriori analisi. La quantificazione delle bande del northern blot mostra che l'abbondanza relativa di tutte le specie di tRNA testate è diminuita rapidamente e significativamente durante la carenza di aminoacidi. D'altra parte, i livelli di carica del tRNA dell'arginina che accetta il tRNA sono diminuiti rapidamente dopo la rimozione dell'arginina e poi sono leggermente aumentati durante il periodo di fame.
Tuttavia, i livelli di carica degli altri tRNA sono aumentati leggermente dopo la fame e poi sono diminuiti fino a quasi i livelli pre-fame. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare l'RNA in modo da quantificare la carica e l'abbondanza di tRNA e come utilizzare le cellule spike-in per la normalizzazione. Durante questa procedura, è importante ricordare di mantenere l'RNA freddo e acido per prevenire l'idrolisi dell'RNA.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per quantificare i livelli di carico dell'RNA di trasferimento (tRNA) in Escherichia coli. L'approccio consente un'analisi comparativa dei livelli di tRNA in diversi stati di crescita, fornendo informazioni sulle dinamiche dell'RNA cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Biologia dell'RNA
- Fisiologia microbica
Sfondo
- I livelli di carico degli tRNA sono fondamentali per la sintesi proteica.
- Comprendere la dinamica degli tRNA può fornire informazioni sulle dinamiche di crescita cellulare e sul metabolismo.
- L’analisi comparativa tra diversi stati di crescita risulta complessa a causa dei cambiamenti nella composizione dell’RNA.
- Questo metodo utilizza cellule spike-in per una quantificazione accurata.
Scopo dello studio
- Quantificare i livelli di carico degli tRNA in E. coli.
- Valutare come il carico degli tRNA vari in diverse condizioni di crescita.
- Stabilire un metodo affidabile per il confronto dei livelli di RNA tra campioni.
Metodi Utilizzati
- Coltivare colture sperimentali e colture di E. coli di controllo.
- Indurre l'espressione degli tRNA utilizzando IPTG in condizioni specifiche di crescita.
- Misurare l'OD436 per monitorare la crescita della coltura.
- Analizzare i livelli di carico degli tRNA mediante tecniche di misurazione diretta.
Risultati principali
- Quantificazione riuscita dei livelli di carico dell'tRNA.
- Dimostrata la variabilità del carico dell'tRNA in diversi stati di crescita.
- Convalidato l'uso di cellule spike-in per l'analisi comparativa.
- Forniti spunti sul rapporto tra il carico dell'tRNA e le condizioni di crescita cellulare.
Conclusioni
- Il metodo offre un approccio solido per lo studio della dinamica degli RNA di trasferimento.
- I risultati migliorano la comprensione del comportamento degli RNA nei sistemi microbici.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi studi sugli RNA in vari organismi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione dell'abbondanza e dei livelli di carico dei tRNA consente una valutazione precisa della capacità traduzionale in diverse condizioni fisiologiche, supportando la validazione degli obiettivi nella ricerca su antimicrobici e vie metaboliche. Questo metodo offre una riduzione del rischio meccanicistica collegando la dinamica dei tRNA alla fedeltà della sintesi proteica, un fattore chiave negli screening fenotipici e negli sforzi di identificazione di composti promettenti. La strategia di normalizzazione con aggiunta di standard interni migliora la riproducibilità tra diversi stati di crescita, aumentando l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici della risposta allo stress batterico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Misura i livelli di carico degli tRNA per esaminare ipotesi traduttive e chiarire le dipendenze specifiche del percorso nei sistemi batterici.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale degli obiettivi correlando l'abbondanza degli tRNA ai cambiamenti dello stato di crescita in condizioni di stress.
- Valore scientifico: Supporta la previsione affidabile nella priorizzazione degli obiettivi quantificando l'efficienza traduttiva come biomarcatore della fitness cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la standardizzazione di saggi successivi, preservando l'amminoacilazione del tRNA durante il prelievo.
- Valore operativo: Permette il confronto quantitativo dei livelli di tRNA tra diversi campioni mediante normalizzazione con controllo interno (spike-in), migliorando la riproducibilità del saggio.
- Valore scientifico: Facilita la predisposizione per lo screening fornendo letture specifiche per lo stato di carica del tRNA che riflettono l'attività traduzionale in seguito al trattamento con composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la dinamica del caricamento degli tRNA a modelli di stress rilevanti per le malattie, come la carenza di aminoacidi, al fine di allineare biomarcatori traduzionali.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, normalizzando le misurazioni degli tRNA in diverse condizioni di crescita.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio identificando colli di bottiglia traduzionali attraverso il depletamento o la mala-accilazione degli tRNA.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo dati quantitativi sul tRNA che informano le fasi di convalida della proteina bersaglio e di sviluppo dei saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando l'abbondanza e il carico degli tRNA come indicatori della capacità traduttiva.
- Screening: Fornisce una quantificazione degli tRNA pronta per saggi e riproducibile, grazie alla normalizzazione con spike-in e al rilevamento specifico per lo stato di carica.
- Analisi: Genera dati di area dei picchi da blot di Northern che permettono il confronto tra frazioni di tRNA carichi e non carichi in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando le risposte degli tRNA allo stress nutrizionale, rilevanti per studi sull'efficacia degli agenti antimicrobici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un metodo normalizzato e compatibile tra piattaforme per l'analisi degli tRNA, applicabile a diverse ceppi batterici e modelli di stress.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore Scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella regolazione traduttiva.
- Valore Operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie alla normalizzazione con cellule di controllo aggiunte (spike-in), che tiene conto della variabilità nella lisi ed estrazione.
- Valore Strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione collegando i livelli di carico degli tRNA al fitness cellulare e all'adattamento allo stress.
- Impatto sul Portafoglio: Consente una priorizzazione dei target aggiustata rispetto al rischio, basata sulla robustezza traduttiva in condizioni rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA, nel Northern blotting e nell'ibridazione con sonde radioattive.
- Necessita di strumentazione per elettroforesi su gel, elettrotrasferimento, incrocio UV e autoradiografia mediante fosforimager.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione delle cellule di controllo aggiunte e per le procedure di misurazione dell'OD436.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse specie di tRNA e modelli batterici diversi da E. coli.
- Presenta limitazioni pratiche come tempi prolungati di elettroforesi (~20 ore) e requisiti di sicurezza legati all'uso di materiali radioattivi.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Preparation of Spike-in Cells, Harvesting of Experimental Samples and Addition of Spike-in Cells
9:59
Conclusion
8:32
Results: Quantification of the Abundance and Charging Levels of tRNAs
2:17
RNA Preparation
4:44
Gel Electrophoresis, Northern Bloting, and Hybridization
7:43
Quantifying tRNA and Charging Levels
