Name: Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Impara la microirradiazione laser per studiare i segnali di danno al DNA e il reclutamento dei fattori di riparazione in vivo. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale delle dinamiche molecolari nelle cellule.

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Si ringraziano il Dr. Akira Yasui Università di Tohoku, Giappone per il plasmide di espressione di GFP-NTH1 e Dr. Eros Lazzerini Denchi al Scripps Research Institute, La Jolla, in California, per la TRF2-YFP e plasmidi di espressione di EGFP-53BP11220-1711 . Questo lavoro è stato supportato da Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) e la Fondazione di Beckman Laser Institute Inc (a M.W.B), la Ford Foundation Fellowship presso l'Accademia nazionale delle scienze (a B.A.S) e NSF MCB-1615701 e CRCC CRR-17-426665 (per K. Y.).

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I vantaggi dell'utilizzo di laser microirradiation per la ricerca DDR sono:
1. è fattibile per indurre diversi tipi e quantità di DNA danni da rotture del filo semplice complesso danno del DNA, e per rilevare riparazione diversi fattori al DNA danno siti regolando i parametri di irradiazione del laser. È anche possibile di infliggere danni più volte nel nucleo della cellula stessa al fine di valutare gli effetti di trans (come in Figura 3).
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In Vivo Segnalazione di danni del DNA non è ben compreso In vivo, il DNA è complessato con istoni ed altri fattori a fibre di cromatina forma. Regolamento della struttura della cromatina è di fondamentale importanza per il metabolismo del DNA. Ad esempio, la variante dell'istone H2AX viene fosforilata da atassia-teleangectasia mutato (ATM) e altre chinasi seguente doppio-filo si rompe ad induzione (DSB) ed è importante per amplificazione del segnale DSB danni, nonché a fornire un sito di aggancio per altro fattori. Diffusione della scelta di pathway di segnalazione e riparazione danni sembrano essere criticamente influenzati dalla struttura della cromatina locale a danni siti1. Una serie di fattori, istone chaperoni e modificando gli enzimi istone di rimodellamento della cromatina sono infatti reclutato per danneggiare siti e sono importante per la riparazione del DNA efficiente, evidenziando l'importanza della regolazione della cromatina nella DDR e riparazione2 , 3 , 4. Inoltre, sito danno clustering o il riposizionamento è stato osservato in lievito e drosofila5,6,7,8, ricordano la rilocalizzazione di loci genici nella subnucleare vano associato gene regolamento9,10. Recenti studi nel topo e cellule umane anche rivelato mobilitazione dei siti DSB, quali influenze ripristino fedeltà e via scelta11,12. Ciò solleva la possibilità che DDR/riparazione può anche essere intimamente legato al architettura nucleare, l'organizzazione di ordine superiore della cromatina e cromosoma dynamics nel nucleo della cellula. Quindi, è fondamentale per sviluppare metodi ad alta risoluzione per studiare DDR e processi nel contesto dell'ambiente endogeno nucleare in una cellula viva di riparazione al fine di comprendere le conseguenze a breve e a lungo termine di danno del DNA.
Ruolo critico di PAR polimerasi (PARP) nel valutare l'entità e il tipo di danno e regolamentare proteina Assemblea presso il sito di danni PARP1 è un sensore di nick DNA rapidamente attivato da danno del DNA che svolge un ruolo critico nel DNA riparazione13. PARP1 è stato originariamente pensato per funzionare insieme con raggi x riparare Cross completando 1 (XRCC1) per facilitare la riparazione bassa di asportazione (BER), ma gli studi recenti rivelano il suo ruolo in altre vie di riparazione del DNA, compreso DSB riparazione14. Attivato PARP1 usi nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+) da un substrato ad ADP-ribosylate più proteine bersaglio, compreso se stesso. Questo enzima e altri membri della famiglia hanno attirato molta attenzione negli ultimi anni come inibitori PARP sono emersi come promettenti farmaci terapeutici per i tumori. Sebbene gli inibitori PARP inizialmente sono stati trovati per essere efficace nel gene del cancro al seno (BRCA)-mutato di cellule di cancro al seno, ora c'è una pletora di prova per i loro effetti nelle terapie di combinazione e mono - insieme offensivi agenti/irradiazione contro del DNA un ampio spettro di tumori con mutazioni non limitate a BRCA15,16,17,18,19,20.
A livello molecolare, l'attivazione di PARP è stata indicata per giocano un ruolo critico nell'organizzare la struttura locale della cromatina nei siti di danno. Assunzione di PAR-dipendente di enzimi di modificazione della cromatina facilita la riparazione DSB e dettami ripristino scelte di percorso, suggerendo il ruolo importante dell'armatura di PAR modifica presso siti di danno. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , recentemente abbiamo dimostrato l'esclusione della p53-binding protein 1 (53BP1) da danni siti di PAR 32, fornendo una spiegazione alternativa per 53BP1-dipendente iperattivazione di endjoining non-omologo ( NHEJ) di PARP inibitore e mettendo in evidenza l'importanza di PARP in DSB riparazione via scelta33,34. PARP1 anche direttamente PARylates e colpisce l'attività del DNA più riparare fattori14.
Usando il Laser Microirradiation come strumento per studiare DDR/riparazione In Vivo Microirradiation laser per produrre alterazioni di sub-micron sui singoli cromosomi era in primo luogo descritto nel 196935 ed esaminate dettagliatamente nel 198136. Alcuni decenni più tardi, laser microirradiation è stato indicato per indurre il danno del DNA in una regione definita submicrometrici nel nucleo della cellula ed è stato dimostrato di essere una tecnica importante per lo studio di reclutamento o modifiche dei vari fattori per DNA lesioni in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. questo metodo permette la rilevazione di quei fattori che non fanno i fuochi indotta per irradiazione distinti (Martina) a danni siti39,42. È anche possibile esaminare la dinamica spazio-temporale dei cambiamenti strutturali della cromatina sia a siti di danno che nel resto del nucleo. Abbiamo confrontato con attenzione il DDR indotto da sistemi laser diversi e poteri per valutare la relazione tra il tipo di danno del DNA e il microirradiation condizioni32,43,44, di input 45. I modelli di reclutamento aberrante di 53BP1 e telomerica ripetere fattore legante 2 (TRF2) sono stati osservati negli studi precedenti danni laser, che ha fornito la base per la ricorrente preoccupazione per la natura "non fisiologica" del danno indotto da laser46 ,47,48,49. Abbiamo trovato che queste apparenti discrepanze ora potrebbero essere spiegate da PARP differenziale che misura la quantità e la complessità del danno indotto32di segnalazione. Abbiamo confermato che: 1) laser-microirradiated cellule (anche dopo irradiazione di potenza di ingresso alta) vengono arrestate in interfase in un modo di controllo-dipendente di checkpoint danni e rimanere vitali (almeno fino a 48 h)32,50; e 2) riparazione fattore reclutamento/modifiche ricapitolare fedelmente quelle osservate con il trattamento con agenti offensivi del DNA convenzionali ed induzione di DSB da endonucleasi32,39,42, 44,50,51,52. Questi risultati sostengono fortemente la rilevanza fisiologica di studiare laser indotta da danno risposte cellulari.

<table><tbody><tr><td>Ti:Sapphire NIR laser a femtosecondi pulsato Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito&nbsp;</td><td>Obiettivo Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stadio di rotazione compatto&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di riscaldamento</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di incubazione del gas</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Contatore laser di potenza ed energia (RoHS)</td><td>Campo</td><td>coerenteMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD digitale ORCA-R2</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Microscopi a scansione laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Piastre a griglia&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 cellule epiteliali renali</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Celle HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo indipendente da CO2&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>MEM avanzato</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>integrato con L-Glutammina, 4% FBS</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Fisher Scientific 25030081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Timidina&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>terreni senza siero &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Terreni di siero ridotti)</td><td>Fisher Scientific 11058021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimero pirimidina anti-cicolbutanza (CPD) (topo)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (topo)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (coniglio)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (coniglio)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Polimeri anti-PAR (topo)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (coniglio)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (topo)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (topo)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Coniglio)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (per il rilevamento della coesina)</td>generato nel laboratorio <td></td><td></td><td>di Yokomori (KY)</td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Coniglio)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (topo)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-ossiguanina&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Coniglio)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generato nel laboratorio</td><td></td> KY <td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-hCAPG (Coniglio)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (per il rilevamento della condensa)</td><td>generato in laboratorio KY</td><td></td><td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Reagente di trasfezione</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 linea cellulare stabile&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generato in laboratorio KY</td><td></td><td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>Linea cellulare stabile GFP-NEIL2</td><td>generata nel laboratorio</td><td></td> KY <td>ref 54</td></tr><tr><td>Linea cellulare stabile GFP-NTH1</td><td>generata nel laboratorio</td><td></td> KY <td>ref 32</td></tr><tr><td>Plasmide GFP-SMC1</td><td>generato nel laboratorio</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Plasmide GFP-Ku</td><td>generato nel laboratorio</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Anti-MDC1 (coniglio)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (coniglio)</td><td>&nbsp; Millipore</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1 (1220-1711) Linea cellulare stabile PtK2</td><td>generata nel laboratorio</td><td></td> Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP Linea cellulare stabile PtK2</td><td>generata nel laboratorio</td><td></td> Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; Inibitore della PKcs&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ATM KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>MICROSCOPIA ELETTRONICA SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Quantità Uno Software di analisi 1D Versione 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>programma di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Excel</td><td>programma per</td><td>fogli di calcolo</td>microsoft <td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente</td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) 10X senza calcio e magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>diluito a 1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

laser microirradiation per lo studio in vivo delle risposte cellulari al danno al dna semplici e complesse

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Danno al DNA induce risposte specifiche di segnalazione e riparazione nella cella, che è fondamentale per la protezione dell'integrità del genoma. Laser microirradiation è diventato un prezioso strumento sperimentale per studiare il DNA danni risposta (DDR) in vivo. Permette analisi unicellulare ad alta risoluzione in tempo reale delle dinamiche macromolecolari in risposta al danno indotto da laser relegato a una regione submicrometrici nel nucleo della cellula. Tuttavia, varie condizioni di laser sono state utilizzate senza apprezzamento delle differenze nei tipi di danno indotto. Di conseguenza, la natura del danno spesso non è ben caratterizzato o controllata, causando evidenti incoerenze nei profili di reclutamento o modifica. Abbiamo dimostrato che condizioni di irradiazione diversi (cioè, diverse lunghezze d'onda come pure diverse potenze di ingresso (irradiances) di un laser a femtosecondi (fs) vicino infrarosso (NIR)) ha indotto gli assembly distinti di proteina DDR e riparazione. Ciò riflette il tipo di danno del DNA prodotto. Questo protocollo descrive come titolazione input di potere del laser permette di induzione di diverse quantità e complessità del danno al DNA, che può essere facilmente monitorato tramite rilevazione di danni base e reticolazione, differenziale poly (ADP-ribosio) (PAR) di segnalazione, e riparazione di percorso specifico assembly fattore presso siti di danno. Una volta che le condizioni di danno sono determinate, è possibile studiare gli effetti di danno differenti complessità e segnalazione differenziali danni nonché deplezione di fattori a Monte su qualsiasi fattore di interesse.

Utilizzando PtK2 le cellule che esprimono EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP, titolazione di alimentazione in ingresso di laser è stato effettuato per determinare la condizione ottima per la loro assunzione (Figura 1)32.
Siti di danno del laser di alta potenza di ingresso, il clustering significativo della CPD (reticolazione danno tipicamente generato da danno ultravioletto (UV)) così come GFP-NTH1 DNA glicosilasi che riconosce speci...

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere come utilizzare la microirradiazione laser per indurre diversi tipi di danno al DNA, inclusi semplici rotture del filamento e danni complessi, al fine di studiare in vivo il rilevamento del danno al DNA e l'assemblaggio dei fattori di riparazione. Negli anni '60 e '70, focalizzavamo un fascio laser attraverso un microscopio, che potete vedere dietro di me, riuscendo a danneggiare una piccola regione di un cromosoma. La cellula si divideva, sopravviveva, e non riuscivamo a capire il motivo.Bene, 40 anni dopo, stiamo utilizzando questo metodo per studiare selettivamente la riparazione del DNA, ed è proprio ciò che vedrete oggi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione del DNA, come ad esempio in che modo il danno al DNA viene riconosciuto ed elaborato e come il segnale di danno si propaga all'interno della cellula. La microirradiazione laser permette un'analisi in tempo reale, con elevata risoluzione e a livello di singola cellula, della dinamica dei macromolecole in risposta a un danno al DNA confinato in una regione di alcune micrometri all'interno del nucleo cellulare.Tuttavia,

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