Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere come utilizzare la microirradiazione laser per indurre diversi tipi di danno al DNA, inclusi semplici rotture del filamento e danni complessi, al fine di studiare in vivo il rilevamento del danno al DNA e l'assemblaggio dei fattori di riparazione. Negli anni '60 e '70, focalizzavamo un fascio laser attraverso un microscopio, che potete vedere dietro di me, riuscendo a danneggiare una piccola regione di un cromosoma. La cellula si divideva, sopravviveva, e non riuscivamo a capire il motivo.

Bene, 40 anni dopo, stiamo utilizzando questo metodo per studiare selettivamente la riparazione del DNA, ed è proprio ciò che vedrete oggi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione del DNA, come ad esempio in che modo il danno al DNA viene riconosciuto ed elaborato e come il segnale di danno si propaga all'interno della cellula. La microirradiazione laser permette un'analisi in tempo reale, con elevata risoluzione e a livello di singola cellula, della dinamica dei macromolecole in risposta a un danno al DNA confinato in una regione di alcune micrometri all'interno del nucleo cellulare.

Tuttavia, sono state utilizzate diverse condizioni laser senza tenere conto delle differenze nei tipi di danno indotti, causando inconsistenze nelle risposte cellulari, nel reclutamento dei fattori e nelle modifiche. Per esprimere proteine marcate con fluorofori in cellule HeLa, al primo giorno, seminare da sei a otto volte 10 alla quarta cellule in 0,5 millilitri di mezzo di coltura in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari.

Al secondo giorno, eseguire la trasfezione del DNA mediante liposomi diluendo 0,3 microgrammi di un DNA plasmidico per l'espressione in cellule di mammifero, codificante un fattore di riparazione del DNA marcato con fluorocromo, in 25 microlitri di mezzo di coltura senza siero. In questo caso, utilizziamo il dominio di localizzazione ai siti di danno della proteina 53BP1 fuso alla GFP per i danni da rottura del doppio filamento, oppure la DNA glicosilasi NTH1 fusa alla GFP per i danni alle basi. In un altro tubo da 1,5 millilitri, diluire un microlitro di reagente per trasfezione del DNA a base di liposomi in 25 microlitri di mezzo di coltura senza siero, quindi mescolare il contenuto dei due tubi, ossia il DNA diluito e il reagente per trasfezione, e incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti al fine di formare complessi DNA-lipidi.

Sciacquare le cellule una volta con 0,5 millilitri di mezzo di coltura, quindi rimuovere il mezzo e aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di coltura fresco alle cellule. Aggiungere i complessi DNA-lipidi alle cellule e mescolare delicatamente oscillando la piastra alcune volte. Successivamente, reinserire le cellule nell'incubatore.

Dopo quattro a sei ore, rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule e aggiungere 300 microlitri di tripsina-EDTA al 0,5%. Rimuovere la soluzione, quindi aggiungere 200 microlitri di tripsina-EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre o quattro minuti. Dopo aver confermato che le cellule si sono staccate, aggiungere 800 microlitri di mezzo di coltura e risospendere le cellule pipettando delicatamente per rompere gli aggregati cellulari.

Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura da 35 millimetri con un coprivetro a griglia e aggiungere mezzo di coltura fino a un volume finale di due millilitri. Dopo 48 ore, le cellule raggiungeranno una confluenza del 30-60% con espressione della proteina fluorescente, ed essere pronte per l'induzione del danno laser. Accendere il laser a infrarossi vicino (NIR) e lasciare riscaldare il sistema laser per un'ora prima dell'uso.

Posizionare una piastra di cellule su un palchetto riscaldato a 37 gradi Celsius in una camera che permetta il controllo dell'anidride carbonica e dell'umidità. Per l'analisi in tempo reale di proteine marcate con fluorescenza, utilizzare un obiettivo ad immersione in olio ad alto ingrandimento e una combinazione appropriata di filtri a fluorescenza in base al marcatore. Cercare cellule che presentino un'espressione comparabile della proteina fluorescente.

Evitare cellule con espressione troppo debole o troppo intensa al fine di ridurre la variabilità tra cellula e cellula nelle misurazioni della fluorescenza. Per la microscopia confocale, utilizzare un obiettivo ad immersione in olio da 100x con apertura numerica 1,3 e la funzione di sbiancamento del software per mirare tracce lineari all'interno del nucleo cellulare. Regolare la percentuale di trasmissione del laser al 5% senza modificare alcuna altra impostazione.

Quindi posizionare una cellula al centro del campo. Fare clic sulla regione di interesse e, utilizzando il mouse, tracciare un segmento o una casella nel nucleo di dimensioni approssimative di 50 per quattro pixel. Evitare di toccare la membrana nucleare o i nucleoli.

Quindi fare clic sul pulsante di bleaching per indurre danni al DNA. In questo caso, la differenza tra il reclutamento massimo di GFP-53BP1 e GFP-NTH1 è evidente. Per eseguire un'analisi quantitativa della fluorescenza di cellule vive mediante microscopio confocale, utilizzare un'ingrandimento 1x e un laser ad argon per GFP FITC.

Impostare una risoluzione di 512 x 512 pixel, una velocità di scansione pari a cinque e il numero uno per la scansione rapida oppure due più per effettuare una media su più scansioni al fine di migliorare il rapporto segnale-rumore. Quindi acquisire le immagini. Disegnare la regione di interesse (ROI) per l'induzione del danno, quindi selezionare la sottovoce Serie Temporale acquisita, impostare il numero a 20 e il ritardo tra i cicli a 30 secondi.

Scegliere la candeggina una volta dopo la prima scansione, quindi fare clic su avvia B. In questo caso, la prima immagine viene acquisita immediatamente prima dell'induzione del danno, seguita dall'acquisizione di altre 19 immagini a intervalli di 30 secondi. Qui si può osservare che GFP-NTH1 viene reclutata rapidamente e in modo transitorio nei siti di danno, mentre GFP-53BP1 si accumula lentamente e permane nei siti di danno. Alcuni fattori di riparazione possono essere reclutati nei siti di danno in maniera specifica del ciclo cellulare.

Per identificare le cellule in fase G1 per l'induzione del danno, utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo 10x e oculari 10x per individuare le cellule in metafase, che appaiono leggermente sollevate e arrotondate. Acquisire immagini per registrare la posizione delle cellule in metafase sul coverslip con griglia. Dopo tre o quattro ore, verificare che la divisione cellulare abbia prodotto due cellule figlie pronte per l'induzione del danno nella posizione registrata.

Per preparare cellule in fase SG2, utilizzare un protocollo di blocco doppio con timidina. Confermare l'efficienza della sincronizzazione mediante profilazione del DNA e/o rilevamento di Rad51 nei siti di danno. Con danni indotti da laser ad alta potenza in ingresso, il raggruppamento dei danni UV CPD e della glicosilasi del DNA GFP-NTH1, che riconosce specificamente i danni alle basi, è stato osservato in modo più chiaro rispetto alla bassa potenza in ingresso.

Inoltre, sono stati osservati livelli più elevati di XRCC1 e CtIP, a riflessione del numero aumentato di rotture a singolo e doppio filamento, indicando così che è stato indotto un danno complesso al DNA. Come dimostrato qui, la variazione della potenza in ingresso del laser provoca modifiche nella segnalazione del danno. PARP1 media la poli ADP-ribosilazione o PAR delle proteine bersaglio nei siti di danno, processo fortemente indotto da alta potenza del laser ma solo debolmente da bassa potenza del laser.

53BP1 viene reclutato sui siti di danno indotti da potenza in ingresso bassa, ma non su quelli ad alta potenza in ingresso. In modo interessante, il reclutamento nei siti di danno a bassa potenza in ingresso è stato soppresso dalla presenza di un secondo danno ad alta potenza in ingresso all'interno dello stesso nucleo cellulare. L'inibizione è stata attenuata dall'inibitore di PARP.

Al contrario, l'inibitore di PARP che degrada PAR ha potenziato il segnale di PAR e ha efficacemente soppresso il reclutamento di 53BP1 anche nei siti di danno con bassa potenza di ingresso. Ciò indica che è il segnale di PARP, e non la natura del danno in sé, a determinare il reclutamento di 53BP1. Questo rappresenta un esempio in cui la titolazione con laser ha rivelato un'attivazione differenziale di PARP1, che misura la quantità e la complessità del danno al DNA, controllando così l'accessibilità del sito di danno.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque giorni, inclusa la preparazione delle cellule, l'allestimento del sistema laser, l'induzione di danni al DNA, l'acquisizione di immagini di cellule vive o immunosilent, e l'analisi dei dati. Potrebbero volerci più tempo per la sincronizzazione delle cellule o per l'analisi dei costi temporali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la taratura della potenza laser in ingresso può variare nel tempo, anche nello stesso sistema laser, specialmente dopo un nuovo allineamento del sistema; pertanto, è fondamentale verificare periodicamente il profilo di reclutamento dei fattori di riparazione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire e confrontare i risultati ottenuti con altri metodi di danneggiamento del DNA, come l'analisi dell'irradiazione, di agenti chimici o dell'espressione di endonucleasi, al fine di confermare che i risultati non siano dovuti ad artefatti specifici del laser. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della riparazione del DNA per esplorare la risposta al danno del DNA in relazione alla cromatina nucleare, e per identificare nuovi fattori e vie coinvolte nel riconoscimento, elaborazione e segnalazione del danno al DNA.