Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

L'obiettivo generale dell'imaging time lapse multi-fotone è quello di catturare immagini tridimensionali ad alta risoluzione in tempo reale di popolazioni di cellule migratorie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come la mappatura dei percorsi di migrazione di diverse popolazioni cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla microscopia confocale tradizionale è che i laser multifotone hanno una penetrazione più profonda nei tessuti e una fototossicità ridotta.

Ciò aumenta l'usabilità nei tessuti più spessi e consente periodi più lunghi di acquisizione delle immagini. Per preparare la raccolta degli embrioni tra le 15:00 e le 21:00, assemblare le vasche di riproduzione e riempirle con osmosi inversa o acqua RO.

Trasferisci fino a tre femmine e tre maschi sui lati opposti della vasca divisa. La mattina dopo, rimuovi il divisorio poco dopo che le luci si sono accese nel vivaio. Lasciare l'accoppiamento indisturbato per 20 minuti o fino a quando non viene prodotto un numero sufficiente di embrioni.

Gli embrioni saranno sul fondo della vasca di riproduzione. Quando si osservano le uova, sollevare la vasca interna scanalata insieme ai pesci e posizionarli rapidamente in una vasca esterna pulita e solida riempita con acqua RO. Utilizzare uno schermo di raccolta delle uova per raccogliere le uova dal serbatoio esterno e trasferire le uova in piastre di Petri contenenti 30 millilitri di terreno embrionale 1X.

Incubare le uova raccolte a 28,5 gradi Celsius. Per gli embrioni transgenici, a 24 ore dalla fecondazione o HPF, rimuovere gli ovuli morti e valutare lo stadio di sviluppo degli embrioni. Usando una pinza, rimuovere i corioni da tre o quattro embrioni che esprimono GFP.

Sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza da dissezione con un filtro di eccitazione passa banda standard da 460 a 490 nanometri, screening per embrioni GFP positivi. Trasferisci questi embrioni in una capsula di Petri separata contenente 30 millilitri di terreno embrionale fresco 1X. Dopo 20 HPF, posizionare gli embrioni GFP positivi sottoposti a screening e dechorionati in una soluzione di PTU allo 0,003% per inibire la pigmentazione.

Evitare di iniziare il trattamento prima in quanto può avere effetti negativi sulla cresta neurale e sullo sviluppo neuroepiteliale. Aggiungi 0,4 grammi di polvere di agarosio LowMelt a 20 ml di terreno embrionale 1x. Scaldare la miscela per uno o due minuti o fino a quando la soluzione è limpida e tutte le particelle si sono sciolte.

Aliquotare circa 1 ml della soluzione di agarosio in provette da centrifuga fresche da 1,5 ml per la conservazione. Per allestire la camera del bagno aperta, posizionare una piccola quantità di grasso ad alto vuoto sulla base della camera del bagno aperta. Posizionare un vetrino circolare sulla base e avvitare la parte superiore della camera del bagno aperta sulla base finché non è ben stretta.

Pipettare circa 500-700 microlitri di soluzione di agarosio al 2% nella camera del bagno aperta fino a riempire la base per circa 3/4 di secondo. Attendere 30 secondi per permettere all'Agarosio di raffreddarsi leggermente senza polimerizzare completamente e successivamente trasferire un singolo embrione al centro della base. Sotto uno stereomicroscopio fluorescente, utilizzare una punta per micropipetta da 10 microlitri per orientare l'embrione e posizionarlo vicino al fondo dell'agarosio in modo che non galleggi via quando viene aggiunto il terreno embrionale.

Un passaggio fondamentale è assicurarsi che l'embrione sia posizionato correttamente nell'agarosio. In questi esperimenti, orientiamo l'embrione lateralmente, ma l'embrione può anche essere posizionato per concentrarsi sulle aree dorsali e ventrali. Monitorare e riposizionare l'embrione fino a quando l'agarosio non si è solidificato.

Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per riempire completamente la camera aperta assemblata con il terreno embrionale time-lapse. Dopo aver posizionato l'intero set up sul tavolino del microscopio, secondo il protocollo di testo, utilizzare l'obiettivo cinque volte per localizzare l'embrione. Quindi sollevare manualmente il tavolino nella posizione più alta e utilizzare la messa a fuoco fine per posizionare l'embrione al centro della gamma del microscopio.

Abbassa manualmente il livello e cambia l'obiettivo a cinque tempi con l'obiettivo a immersione in acqua a 25 volte. Solleva con cautela il tavolino per riportare l'embrione a fuoco. Nel software, fare clic sulla modalità XYTZ per ottenere più immagini a intervalli di tempo o T nel piano XY su una profondità di Z.Utilizzare l'epifluorescenza o la vista in campo chiaro per trovare la profondità di messa a fuoco nell'area di interesse che delimiterà lo z-stack.

Per questi esperimenti, il bordo laterale dell'occhio è l'inizio dello z-stack. Quando è stato messo a fuoco qui, nel software fare clic sul pulsante di avvio. Dopo aver messo a fuoco fino alla linea mediana dell'embrione, che è la fine della pila z, fai clic sul pulsante di fine.

Un passaggio fondamentale consiste nell'assicurarsi che il passaggio Z includa l'area di interesse. Nel nostro caso, vogliamo catturare la larghezza dell'occhio dai bordi laterali a quelli mediali. Fare clic sul menu per regolare il tempo di acquisizione e la frequenza di imaging.

Per un adeguato recupero del fluoro4 e la sopravvivenza dell'embrione, prevedere un rapporto di almeno uno a tre tra l'acquisizione dello z-stack quando l'alimentazione del laser è attiva e il tempo di recupero quando l'alimentazione del laser è spenta. Con il tempo appropriato per il recupero dell'embrione, impostare il tempo tra gli z-stack nella finestra designata. Impostare quindi la durata totale dell'esperimento nella finestra appropriata.

Ora, attiva l'impostazione dell'immagine dal vivo per apportare le regolazioni finali alle impostazioni del laser. Regola la trasmissione laser, il guadagno e le barre di scorrimento dell'offset all'interno del software per ottimizzare l'immagine a fluorescenza. Inoltre, regola l'orientamento dell'embrione secondo necessità a seconda della durata dell'esperimento, della crescita prevista dell'embrione, eccetera.

Assicurati che l'area di interesse rimanga all'interno dell'inquadratura per tutta la durata dell'esperimento. Durante l'acquisizione time-lapse, spegnere la sorgente luminosa per epifluorescenza, coprire il tavolino con la scatola di sicurezza laser adeguata per la protezione contro la luce di fondo, quindi premere start. Accedi alla camera del bagno aperta attraverso le porte scorrevoli sulla scatola di sicurezza laser per riempirla con il mezzo embrionale time lapse ogni 8-12 ore.

Dopo l'acquisizione delle immagini, aprire i file nel software di elaborazione delle immagini, evidenziare la serie di immagini corretta. Nel software, scegli il menu di processo, fai clic su Deconvoluzione 3D e applica per deconvolgere ogni z-stack. Importa i singoli file tif nel software di elaborazione video, quindi seleziona tutti i file tif e trascinali nell'editor video.

Regola la lunghezza di ogni immagine all'interno del video a 0,1 secondi. Infine, esporta il video come file mov o mp4. Osservati qui dall'imaging a fluorescenza multi-fotone sono i modelli di migrazione delle cellule della cresta neurale cranica che danno origine alle strutture facciali craniche e al segmento anteriore dell'occhio nelle linee transgeniche sox10:EGFP e foxd3:GFP zebrafish.

Sox 10 cellule positive della cresta neurale tra 12 e 30 hpf migrano dal bordo del tubo neurale nella regione cranica facciale. Le cellule del prosencefalo e del mesencefalo migrano dorsalmente e ventralmente verso l'occhio in via di sviluppo per popolare la mesencina perioculare. Come indicato qui, le cellule sox10 positive formano il processo nasale frontale.

Le cellule della cresta neurale del rombencefalo migrano ventralmente e danno origine agli archi faringei. L'imaging time lapse di cellule della cresta neurale positive foxd3 tra 30 e 60 hpf mostra che queste cellule sono migrate tra la coppa ottica e l'ectoderma di superficie e attraverso la fessura oculare contrassegnata dalla freccia e coalescente attorno alla lente contrassegnata dall'asterisco che forma lo stroma dell'iride. Una volta padroneggiata, questa tecnica dall'inizio alla fine può essere eseguita in quattro giorni se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di scegliere embrioni con un'elevata quantità di fluorescenza. La configurazione iniziale del software può essere impegnativa, ma una volta determinati i parametri, le modifiche aggiuntive sono in genere minime. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia time-lapse multi-fotone per visualizzare le cellule in migrazione nell'embrione.