Name: Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Scopri l'imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale negli embrioni di Danio rerio. Questa tecnica ad alta risoluzione consente l'osservazione in tempo reale con minore fototossicità rispetto alla microscopia confocale.

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Gli autori ringraziano Thomas Schilling per gifting gentilmente il pesce di Tg (sox10:eGFP) e Mary Halloran per gifting gentilmente il pesce(foxd3:GFP) Tg.

Il protocollo qui descritto è stato eseguito in conformità con le linee guida per il trattamento umano degli animali da laboratorio stabilite dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan (UCUCA).
1. Raccolta di embrioni per l'imaging time-lapse
<ol>
	<li>Tra le 15 e le 21, allestisci un maschio e una femmina di pesce zebra transgenico adulto Tg(sox10:EGFP) o Tg(foxd3:GFP) in una vasca di riproduzione divisa per l'accoppiamento a coppie. 
	NOTA: I pesci Tg(sox10:EGFP) e Tg(foxd3:GFP), doni gentili di Thomas Schilling e Mary Halloran, rispettivamente, sono stati incrociati nel fondo Casper (roy -/-, madreperla -/-) per ridurre l'autofluorescenza e l'interferenza con la pigmentazione.
	<ol>
		<li>Assemblare la vasca di allevamento (vasca interna scanalata + vasca esterna solida) e riempirla con acqua del sistema ad osmosi inversa (RO).</li>
		<li>Trasferisci fino a 3 femmine e 3 maschi sui lati opposti della vasca separati da un divisorio; fino a 6 pesci possono essere allevati a coppie in un'unica vasca di riproduzione.</li>
		<li>La mattina dopo, rimuovi il divisorio poco dopo l'accensione delle luci nel vivarium. 
		NOTA: Nel presente studio, le luci sono accese su un ciclo di luce di 14 ore (acceso alle 9 del mattino) e buio di 10 ore (spento alle 23</li>).
		<li>Consentire l'accoppiamento indisturbato per 20 minuti o fino a quando non viene prodotto un numero sufficiente di embrioni; gli embrioni saranno sul fondo della vasca di riproduzione. Quando si osservano le uova, sollevare la vasca interna scanalata insieme ai pesci e posizionarli rapidamente (pesci e vasca interna) in una vasca esterna solida e pulita riempita con acqua RO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare il terreno embrionale standard 1X aggiungendo quanto segue per 1 L di acqua RO: 0,287 g (4,9 mM) NaCl, 0,127 g (0,17 mM) KCl, 0,048 g (0,33 mM) CaCl2,2H 2O, 0,04 g (0,33 mM) MgSO4 (anidro). Mescolare la soluzione fino a quando i sali non sono completamente sciolti.
	<ol>
		<li>Aggiungere 100 μl di blu di metilene allo 0,1% come fungicida. Aggiungere 0,25 g di bicarbonato di sodio per regolare il pH a 7,75. Conservare il terreno a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccogliere le uova dal serbatoio esterno utilizzando uno schermo per la raccolta delle uova e trasferire le uova in piastre di Petri (~50 embrioni per piastra) contenenti 30 ml di terreno embrionale 1X. Incubare le uova raccolte a 28,5 °C.</li>
	<li>Preparazione dell'embrione
	<ol>
		<li>Embrioni Tg(sox10:EGFP).
		<ol>
			<li>Per gli embrioni Tg(sox10:EGFP), a 12 ore dopo la fecondazione (hpf), rimuovere gli ovuli morti e valutare lo stadio di sviluppo degli embrioni. Screening per embrioni GFP-positivi utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente da dissezione con un filtro di eccitazione passa-banda standard da 460-490 nm. Usando una pinza, rimuovere i corioni da 3-4 embrioni che esprimono GFP e trasferire questi embrioni in una capsula di Petri separata contenente 30 ml di terreno embrionale fresco 1X.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Embrioni Tg(foxd3:GFP). 
		<ol>
			<li>Per gli embrioni Tg(foxd3:GFP), a 22-24 hpf, rimuovere gli ovuli morti e valutare lo stadio di sviluppo degli embrioni. Screening per embrioni positivi utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente da dissezione con un filtro di eccitazione passa-banda standard da 460-490 nm. Usando una pinza, rimuovere i corioni da 3-4 embrioni che esprimono GFP.</li>
			<li>Preparare la soluzione madre 1000X di feniltiourea (PTU) sciogliendo 0,75 g (3%) di PTU in 25 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Aliquotare e conservare la soluzione madre a 4 °C. Aggiungere 30 μL di soluzione madre 1000X PTU (3%) a 30 mL di terreno embrionale 1X per generare una soluzione di PTU allo 0,003%.</li>
			<li>Posizionare gli embrioni GFP-positivi sottoposti a screening e dechorionati in una soluzione di PTU allo 0,003% per inibire la pigmentazione. Non iniziare il trattamento degli embrioni con PTU prima di 20 hpf, poiché il trattamento precoce (a <20 hpf) può avere effetti negativi sulla cresta neurale e sullo sviluppo neuroepiteliale. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prima di condurre l'esperimento time-lapse, monitorare gli embrioni attraverso l'imaging dal vivo utilizzando uno stereomicroscopio standard a intervalli di 12-24 ore in confronti di pari età come controllo per la deriva della temperatura.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montaggio dell'embrione per l'imaging time-lapse
<ol>
	<li>Preparazione di terreni embrionali time-lapse
	<ol>
		<li>Preparare la soluzione madre standard di tricaina allo 0,4% aggiungendo 0,004 g di tricaina a 100 ml di acqua RO. Aliquotare (~1 mL) la soluzione madre in provette da centrifuga fresche da 1,5 mL e conservare a -20 °C.</li>
		<li>Preparare il terreno embrionale time-lapse (50 ml di terreno embrionale 1X, tricaina 0,016%) aggiungendo 2 ml di soluzione di tricaina 0,4% a 48 ml di terreno embrionale 1X. Se si utilizzano embrioni >22 hpf, aggiungere anche 50 μl di soluzione madre PTU al 3% (concentrazione finale.003% PTU) al terreno embrionale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione di agarosio a basso punto di fusione al 2%
	<ol>
		<li>Aggiungere 0,4 g di polvere di agarosio a basso punto di fusione a 20 ml di terreno embrionale 1X. Riscaldare per 1-2 minuti o fino a quando la soluzione è limpida e tutte le particelle sono disciolte. 
		NOTA: L'aumento della percentuale di gel di agarosio diminuisce la porosità della matrice, che può ostacolare fisicamente la crescita e lo sviluppo dell'embrione. Pertanto, la soluzione di agarosio può essere ridotta all'1,5% per ridurre al minimo questi effetti. Tuttavia, quando il fascio di eccitazione viene tenuto fermo durante la microscopia a scansione laser, può verificarsi un maggiore riscaldamento, che aumenta rapidamente in una relazione logaritmica con il tempo. In questo protocollo, il riscaldamento dovuto all'assorbimento del fluoroforo è altamente localizzato nella regione focale. Pertanto, nella regione di interesse, la temperatura potrebbe aumentare fino a un valore sufficientemente alto (≥ 30 °C) da fondere soluzioni di agarosio prodotte a percentuali inferiori a 1,5, esponendo così direttamente l'embrione al laser o consentendo condizioni in cui l'embrione fluttua fuori dal piano focale. Per questo motivo si sconsiglia l'uso di soluzioni di agarosio inferiori all'1,5%.</li>
		<li>Aliquotare (~1 mL) la soluzione di agarosio in provette da centrifuga fresche da 1,5 mL per la conservazione. Conservare la soluzione di agarosio in eccesso in forma liquida su un blocco termico (60-70 °C) per 2-3 settimane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaggio dell'embrione
	<ol>
		<li>Per allestire la camera del bagno aperta, posizionare una piccola quantità di grasso ad alto vuoto sulla base della camera del bagno aperta. Posizionare un vetrino coprioggetti circolare sulla base e avvitare la parte superiore della camera del bagno aperta sulla base fino a quando non è ben stretta ( Figura 1A, B).</li>
		<li>Pipetta (~500-700 μL) di soluzione di agarosio al 2% (60-70 °C) nella camera del bagno aperta fino a riempire la base con ~3/4 ( Figura 1C). Si noti che una volta che la soluzione di agarosio si trova nella camera a bagno aperta sul banco del laboratorio, la temperatura della soluzione diminuisce di circa 1 °C/s.</li>
		<li>Attendere 30 s per consentire all'agarosio di raffreddarsi leggermente (~30-40 °C), senza polimerizzare completamente, e successivamente trasferire un singolo embrione al centro della base ( Figura 1D, E).</li>
		<li>Sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza, posizionare l'embrione utilizzando una punta per micropipetta da 1-10 μL, assicurandosi che l'embrione sia posizionato vicino al fondo dell'agarosio, poiché l'embrione potrebbe galleggiare via se coperto da terreno embrionale se viene posizionato troppo vicino alla superficie dell'agarosio><.
		NOTA: Nei video presentati (Video 1-3), gli embrioni sono orientati lateralmente, ma a seconda dell'area di interesse, gli embrioni possono essere orientati ventralmente o dorsalmente.</li>
		<li>Monitorare e riposizionare l'embrione fino a quando l'agarosio non si è solidificato. Una volta che l'agarosio si è solidificato, utilizzare una pipetta di trasferimento per riempire completamente la camera aperta assemblata con terreno embrionale time-lapse ( Figura 1F).</li>
		<li>Posizionare la camera del bagno aperta nella piattaforma di scambio rapido, che si adatta all'adattatore del tavolino ( Figura 1G). Posizionare l'intera configurazione (embrione, camera da bagno aperta, piattaforma di scambio rapido e adattatore per tavolino) sul tavolino del microscopio immediatamente sopra il condensatore ( Figura 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Configurazione del microscopio per l'imaging time-lapse
<ol>
	<li>Determinazione delle impostazioni del laser
	<ol>
		<li>Determinazione della lunghezza d'onda del laser da utilizzare. Utilizzare una lunghezza d'onda che sia il doppio della lunghezza d'onda di eccitazione del fluoroforo di interesse (ad es. lunghezza d'onda compresa tra 880 e 940 nm per GFP). 
		NOTA: Nel presente studio, l'impostazione della lunghezza d'onda per GFP era compresa tra 880 e 940 nm. Maggiore è la lunghezza d'onda, minore è la potenza di uscita del laser.</li>
		<li>Determinare la trasmissione laser. Un'alta percentuale di trasmissione laser ucciderà l'embrione, utilizzare il livello di trasmissione più basso (consigliato). Per gli studi time-lapse da 24 a 48 ore, come qui presentato, mantenere la trasmissione al di sotto del 5%.</li>
		<li>Determinare i sistemi di rilevamento al microscopio e assicurarsi che siano presenti i filtri corretti per il fluoroforo. 
		NOTA: Per i microscopi multifotonici, esistono più sistemi di rilevamento con varie sensibilità per la fluorescenza emessa. In generale, un sistema di rilevamento interno ha una sensibilità inferiore rispetto a un sistema di rilevamento esterno. Per le linee transgeniche con alti livelli di espressione di GFP, il sistema di rilevamento interno è adeguato. Per le linee transgeniche con bassi livelli di espressione di GFP o con altri fluorofori (ad esempio, proteina fluorescente rossa), può essere necessario un sistema di rilevamento esterno per mantenere la percentuale di trasmissione laser a un livello ragionevole. Indipendentemente dal sistema di rilevamento utilizzato, devono essere presenti i filtri corretti per il fluoroforo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regolazione delle impostazioni del software sul microscopio multifotone
	<ol>
		<li>Utilizzando l'obiettivo 5X, localizzare l'embrione. Sollevare manualmente il tavolino nella posizione più alta e utilizzare la messa a fuoco fine per posizionare l'embrione al centro della gamma del microscopio.</li>
		<li>Abbassare manualmente il tavolino e cambiare l'obiettivo 5X con l'obiettivo a immersione in acqua 25X (apertura numerica NA, 0,95). Solleva con cautela il tavolino per riportare l'embrione a fuoco.</li>
		<li>Nel software, fare clic sulla modalità "xyzt" per ottenere più immagini a intervalli di tempo (t) nel piano x-y su una profondità di "z". Usa l'epifluorescenza o la vista in campo chiaro per trovare la profondità di messa a fuoco nell'area di interesse, che delimiterà lo Z-stack.
		<ol>
			<li>Nel software, fare clic sul pulsante "inizia"; per questi esperimenti, il bordo laterale dell'occhio era l'inizio della pila Z. Fare clic sul pulsante "fine"; la linea mediana dell'embrione era la fine della pila Z. 
			NOTA: La dimensione del passo era 0,3-0,6 μm e c'era un totale di ~200 passi per una dimensione z-stack da 60 a 120 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Fare clic sul menu per regolare il tempo di acquisizione e la frequenza di imaging. Per il sistema attuale, ~200 passi richiedono circa 5 minuti per ogni acquisizione z-stack. Per un adeguato recupero del fluoroforo e la sopravvivenza dell'embrione, tenere conto di un rapporto di almeno 1:3 tra l'acquisizione dello z-stack (accensione del laser) e il tempo di recupero (spegnimento del laser). 
		NOTA: Ad esempio, gli z-stack vengono acquisiti ogni 20 minuti con 5 minuti di acquisizione z-stack e 15 minuti di recupero. Per questo protocollo, è possibile ottenere z-stack più grandi, ma aumenterebbe in modo appropriato il tempo tra le acquisizioni z-stack, con conseguente minor numero di immagini nel corso del time-lapse.
		<ol>
			<li>Con il tempo appropriato per il recupero dell'embrione, impostare il tempo tra gli z-stack nella finestra designata. Imposta la durata totale dell'esperimento nella finestra appropriata.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Software finale, laser e regolazioni dell'embrione.
		<ol>
			<li>Attivare l'impostazione dell'immagine dal vivo per apportare le regolazioni finali alle impostazioni del laser. Regola la trasmissione laser (vedi 3.1.2), il guadagno e le barre di scorrimento dell'offset all'interno del software per ottimizzare l'immagine fluorescente. Inoltre, regolare l'orientamento dell'embrione, se necessario, a seconda della durata dell'esperimento, della crescita prevista dell'embrione, ecc. Assicurati che l'area di interesse rimanga all'interno dell'inquadratura per tutta la durata dell'esperimento.</li>
			<li>Spegnere la sorgente luminosa epifluorescente in quanto non è più necessaria durante l'acquisizione time-lapse. Copri il tavolino con la scatola di sicurezza laser ( Figura 1I). Quando si utilizza il sistema di rilevamento interno, la scatola di sicurezza laser è sufficiente per la protezione contro la luce di fondo. Premere "start". 
			NOTA: Tuttavia, con sistemi di rilevamento esterni più sensibili, la scatola di sicurezza laser non blocca una quantità sufficiente di luce di fondo e sono necessarie coperture aggiuntive per evitare l'interruzione dell'acquisizione dell'immagine.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Durante l'acquisizione time-lapse
<ol>
	<li>Riempire la camera del bagno aperta con il terreno embrionale time-lapse ogni 8-12 ore (almeno 2 volte al giorno) durante l'acquisizione time-lapse attraverso le porte scorrevoli sulla scatola di sicurezza del laser ( Figura 1I).</li>
	<li>Prima di aprire gli sportelli della cassetta di sicurezza laser, assicurarsi che il microscopio non stia acquisendo attivamente un'immagine. 
	NOTA: L'uso di riscaldatori e sistemi di mezzi di circolazione non è necessario per esperimenti di imaging time-lapse della durata di 24-48 ore. Infatti, le temperature sia dello stadio che dei riscaldatori in linea sono difficili da controllare e durante l'acquisizione dell'immagine l'embrione mostra un tasso di sviluppo adeguato a un intervallo di temperatura compreso tra 25 e 28 °C. Inoltre, i sistemi di circolazione dei fluidi tendono a traboccare e potenzialmente a danneggiare l'apparecchiatura. Pertanto, tutti gli embrioni vengono regolarmente messi in scena dopo l'acquisizione.</li>
</ol>
5. Elaborazione post-acquisizione
<ol>
	<li>Nel software, fare clic sul menu "file" e scegliere "salva".</li>
	<li>Aprire il file nel software di elaborazione delle immagini (vedere la Tabella dei materiali). Evidenzia la serie di immagini corretta. Nel software, selezionare il menu "Processo". Fare clic su Deconvoluzione 3D e su "Applica" per deconvolgere ogni z-stack. 
	NOTA: Il file è di grandi dimensioni; Pertanto, questo passaggio potrebbe richiedere molte ore.</li>
	<li>Nel software, nel menu "Processo", fare clic su "proiezione massima". Fare clic su "Applica" per avviare la proiezione massima per generare 1 immagine per z-stack. Esportate ogni file proiettato massimo (1 immagine per z-stack) come tiff.</li>
	<li>Importa singoli file tiff nel software di elaborazione video. Seleziona tutti i file tiff e trascinali nell'editor video. Regola la lunghezza di ogni immagine all'interno del video a 0,1 secondi. Esporta video come file mov o mp4.</li>
</ol>

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</ol>

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente attraverso borse di studio dal National Eye Institute del National Institutes of Health (K08EY022912-01) e Vision Research Core (P30 EY007003).

Time-lapse di immagini multi-fotone consente il monitoraggio in vivo di popolazioni cellulari transitori e migratori. Questa potente tecnica può essere utilizzata per studiare i processi embrionali in tempo reale, e nello studio presente, i risultati di questo metodo ha migliorato la conoscenza attuale di sviluppo e migrazione delle cellule neurali della cresta. Precedenti studi di imaging time-lapse in genere utilizzano la microscopia a scansione laser confocale. 29 , <sup cla...

Malattie congenite dell'occhio possono causare la cecità di infanzia e spesso sono dovuti ad anomalie della cresta neurale cranica. Cellule della cresta neurale sono cellule staminali transitorie che derivano dal tubo neurale e formano numerosi tessuti in tutto il corpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 cellule della cresta neurale, derivate dal prosencefalo e mesencefalo, danno luogo all'osso e la cartilagine del midface e regioni frontali e l'iride, cornea, trabecolato e sclera nel segmento anteriore dell'occhio. 4 , 6 , 7 , 8 cellule neurali della cresta da romboencefalo forma che il pharyngeal arches, mascella e tratto di efflusso cardiaco. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studi hanno evidenziato i contributi della cresta neurale all'oculare e perioculare sviluppo, sottolineando l'importanza di queste cellule in sviluppo dell'occhio dei vertebrati. Infatti, la rottura di differenziazione e migrazione delle cellule neurali della cresta condurre ad anomalie cranio-facciali ed oculari come osservato nella sindrome di Axenfeld-Rieger e sindrome di Peters Plus. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 in tal senso, una comprensione globale della migrazione, proliferazione e differenziazione di queste cellule della cresta neurale fornirà approfondimenti le complessità sottostanti malattie congenite dell'occhio.
Zebrafish è un organismo potente modello per studiare lo sviluppo oculare, come le strutture dell'occhio zebrafish sono simili alle loro controparti dei mammiferi, e molti geni sono evolutivamente conservate tra zebrafish e mammiferi. 18 , 19 , 20 inoltre, embrioni di zebrafish sono trasparenti e ovipari, facilitando la visualizzazione di sviluppo dell'occhio in tempo reale.
Espansione sul lavoro precedentemente pubblicato,6,7,20 il modello migratore delle cellule della cresta neurale è stata descritta usando la fluorescenza multi-fotone time-lapse di imaging su linee di zebrafish transgenici etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo trascrizionale di SRY (regione dideterminazione Y)-scatola 10 (sox10) o Forkhead Box D3 nelle regioni regolatrici del gene (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. fluorescenza multi-fotone time-lapse imaging è una tecnica potente che combina le avanzate tecniche ottiche di microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d'onda di catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale di esemplari con fluorofori etichettati di scansione laser. 25 , 26 , 27 l'uso del laser multi-fotone presenta chiari vantaggi rispetto la microscopia confocale standard, tra cui aumentata del tessuto vaginale e candeggio fluoroforo in diminuzione.
Utilizzando questo metodo, due popolazioni distinte delle cellule della cresta neurale varia in tempi di migrazione e percorsi migratori erano cellule della cresta neurale discriminata, vale a dire foxd3-positivo nel mesenchima periocular e occhio in via di sviluppo e le cellule di cresta neurale sox10-positivi nel mesenchima craniofacial. Con questo metodo, viene introdotto un approccio per visualizzare la migrazione della migrazione oculare e craniofacial cresta neurale in zebrafish, che lo rende facile osservare regolamentato dalla cresta neurale migrazione in tempo reale durante lo sviluppo.
Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante lo sviluppo iniziale di occhio in Tg (sox10:EGFP) e zebrafish transgenici Tg (foxd3:GFP), ad esempio. Questo protocollo possa essere applicato per la visualizzazione ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale dello sviluppo iniziale di qualsiasi struttura oculare e craniofacial derivato dalle cellule della cresta neurale in zebrafish. Inoltre, questo metodo possa essere applicato per la visualizzazione dello sviluppo di altri tessuti ed organi in zebrafish e altri modelli animali.

<table><tbody><tr><td>Vasche di allevamento con divisori</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Set di vasche di attraversamento (1,0 litri) Policarbonato trasparente con coperchio e inserto</td></tr><tr><td>M205 FA Combi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Microscopio a stereofluorescenza - FusionOptics e TripleBeam</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Doppio sacco in PE. N. CAS 7647-14-5, numero CE 231-598-3</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Millipore (EMD)</td><td>1049380500</td><td>Cloruro di potassio 99.999 Suprapur. N. CAS 7447-40-7, numero CE 231-211-8.</td></tr><tr><td>Cloruro di Calcio Diidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Flacone in polietilene; 500 g. Codice CAS 10035-04-8</td></tr><tr><td>Solfato di Magnesio (Anidro)</td><td>Millipore (EMD)</td><td>MX0075-1</td><td>Flacone in polietilene; 500 g. Codice CAS 7487-88-9, Numero CE 231-298-2</td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Milliporo (EMD)</td><td>284-12</td><td>Flacone in vetro; 25 g. in polvere, colorante biologico certificato</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Millipore (EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Flacone in polietilene; 500 g. Polvere, GR ACS. N. CAS 144-55-8, numero CE 205-633-8</td></tr><tr><td>N-feniltiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. Numero CAS 103-85-5, Numero CE 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ML</td><td>Grado di biologia molecolare. Numero CAS 67-68-5, Numero CE 200-664-3</td></tr><tr><td>Tricaina Metanansolfonato</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td>Tricaine-S</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>Setaccio GeneMate GQA Agarosio a basso punto di fusione, 25 g</td></tr><tr><td>Camera da bagno aperta</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto in vetro</td> ad alto profilo <td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Vetro di copertura circolare. Grasso per alto vuoto diametro 25 mm</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>Tubo da 2,0 libbre. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>Piattaforma di sostituzione rapida</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td> Adattatore per palco <td>da 35 mm</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td><td>16,5 x 10 cm</td></tr><tr><td>TC SP5 MP Microscopio multifotone</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scatola</td> <td>di sicurezza laserLeica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)&nbsp; Software</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Versione 13.0 x64 Software</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Versione 10.1.4 Software</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-fotone time lapse imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di zebrafish

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Occhio congenita e anomalie craniofacciali riflettono imprevisti nella cresta neurale, una popolazione transitoria di migratori cellule staminali che danno origine a numerosi tipi di cellule in tutto il corpo. Comprensione della biologia della cresta neurale è stata limitata, che riflette una mancanza di modelli geneticamente trattabili che possono essere studiati in vivo e in tempo reale. Zebrafish è un modello di sviluppo particolarmente importante per lo studio di popolazioni di cellule migratorie, come la cresta neurale. Per esaminare la migrazione dalla cresta neurale nell'occhio in via di sviluppo, una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare video ad alta definizione, tridimensionali, in tempo reale dell'occhio in via di sviluppo negli embrioni di zebrafish transgenici, vale a dire Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), come sox10 e foxd3 è stati dimostrati in numerosi modelli animali di regolare differenziazione iniziale dalla cresta neurale e probabilmente rappresentano gli indicatori per le cellule della cresta neurale. Time-lapse di immagini multi-fotone è stato utilizzato per discernere il comportamento e schemi migratori delle due popolazioni di cellule neurali della cresta che contribuiscono al precoce sviluppo dell'occhio. Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante la migrazione dalla cresta neurale di zebrafish, come esempio e possa essere applicato per visualizzare lo sviluppo precoce di molte strutture in zebrafish e altri organismi di modello.

Time-lapse imaging multi-fotone di fluorescenza generata una serie di video che ha rivelato i modelli di migrazione delle cellule neurali craniche della cresta che danno origine alle strutture craniofacial e segmento anteriore dell'occhio nel Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) linee di zebrafish. Ad esempio, sox10 -positivo dalla cresta neurale cellule tra 12 e 30 hpf migrano dal bordo del tubo neurale nella regione craniofacial (Video 1, <strong...

Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

L'obiettivo generale dell'acquisizione temporale a fotoni multipli è catturare immagini tridimensionali ad alta risoluzione in tempo reale di popolazioni cellulari migratorie. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo, come la mappatura dei percorsi di migrazione di diverse popolazioni cellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla microscopia confocale tradizionale è che i laser a fotoni multipli permettono una maggiore penetrazione nei tessuti e riducono la fototossicità.Questo aumenta l'usabilità in tessuti più spessi e consente periodi più lunghi di acquisizione delle immagini. Per predisporre la raccolta di embrioni tra le 15:00 e le 21:00, assemblare i contenitori per l'accoppiamento e riempirli con acqua ottenuta tramite osmosi inversa, o acqua RO.Trasferire fino a tre femmine e tre maschi nei lati opposti del serbatoio diviso. La mattina seguente, rimuovere il divisore poco dopo l'accensione delle luci nel vivario. Consentire l'accoppiamento indisturbato per 20 minuti o fino a quando non vengono prodotti un numero sufficiente di embrioni.Le uova si troveranno sul fondo del serbatoio di riproduzione. Q

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di...

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Fonte: Williams, A. L., et al. Imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione delle cellule neurali in cresta in migrazione negli embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un protocollo di imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di zebrafish in tempo reale con alta risoluzione.

Visualizzazione della migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di pesce zebra utilizzando l'imaging time lapse multi-fotone

Visualizzazione dei dati sperimentali è diventata un elemento chiave per la presentazione dei risultati alla comunità scientifica. Generazione di live time-lapse di embrioni in crescita contribuisce a una migliore presentazione e la comprensione dei processi di sviluppo complessi. Questo protocollo è una guida passo-passo per l'etichettatura cellulare tramite fotoconversione di proteine ​​Kaede in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Qui, viene fornito un protocollo per l'imaging time-lapse della morfogenesi oculare utilizzando un microscopio lightsheet disponibile in commercio e una workstation di elaborazione delle immagini per analizzare i dati risultanti. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per l'anestesia embrionale, l'incorporamento nell'agarosio a bassa temperatura di fusione, la sospensione nella camera di imaging, l'impostazione dei parametri di imaging e infine l'analisi dei dati di imaging...

Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Dimostriamo un metodo che sfrutta la microscopia confocale a scansione rapida per eseguire l'imaging dal vivo delle cellule della microglia nel tectum ottico del pesce zebra in via di sviluppo, consentendo l'analisi della dinamica di queste cellule in vivo.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Scopri l'imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale negli embrioni di Danio rerio. Questa tecnica ad alta risoluzione consente l'osservazione in tempo reale con minore fototossicità rispetto alla microscopia confocale.

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish (Video) | JoVE Journal

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

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