Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Gli obiettivi generali di questi saggi sono quantificare la chemiotassi dei monociti in vitro in tempo reale e monitorare la migrazione dei linfociti in vivo. Il metodo in vitro può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio quali sono gli effetti dei fattori sierici sulla chemiotassi delle cellule immunitarie. Il vantaggio principale della tecnica in vitro è che consente misurazioni quantitative e multiplex in tempo reale.

Il metodo in vivo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia su come specifici tipi di cellule migrano all'interno di un animale ricevente. La tecnica in vivo è particolarmente utile per la valutazione quantitativa della migrazione di più tipi cellulari all'interno dello stesso animale. Prima di iniziare l'esperimento, etichettare le cellule THP-1 con un colorante fluorescente in una piastra di coltura cellulare da 35 millimetri in terreno completo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Mentre le cellule sono in incubazione, aggiungere 750 microlitri di HBSS tamponato con HEPES da 25 millimolari e 0,1% BSA ai pozzetti di fondo e di controllo positivo di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere l'appropriata concentrazione di MCP-1 nell'acqua integrata con BSA ai pozzetti di controllo sperimentale e positivo. E posizionare gli inserti porosi in ogni pozzetto, facendo attenzione che le linguette degli inserti siano allineate con le tacche della piastra.

È fondamentale rimuovere eventuali bolle dai pozzetti inferiori dopo aver posizionato gli inserti, poiché le bolle interferiscono con le misurazioni della fluorescenza. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule marcate in una provetta conica da 15 millilitri per la loro raccolta mediante centrifugazione. E ispezionare visivamente il pellet risultante per confermare l'assorbimento del colorante.

Successivamente, aspirare con cura il surnatante sottovuoto e lavare le cellule in terreno RPMI-1640 privo di siero integrato con HEPES da 25 millimolari nelle stesse condizioni di centrifuga. Risospendere il pellet in un terreno fresco privo di siero con HEPES per il conteggio. E regolare il volume a una concentrazione finale da uno a 1,5 volte da 10 a sei cellule per millilitro.

Aggiungere 250 microlitri di cellule nella camera superiore di ciascun pozzetto e posizionare la piastra in un lettore di piastre a 37 gradi Celsius. Quindi acquisire le letture della fluorescenza delle camere inferiori a intervalli da uno a tre minuti alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione della fluorescenza appropriate per il colorante. Per preparare le cellule del donatore per il loro trasferimento adottivo, in primo luogo, prelevare l'intera milza da un maschio anestetizzato di età compresa tra 8 e 12 settimane C57 black six in un filtro a rete di nylon da 40 micrometri in una capsula di coltura cellulare contenente un terreno completo su ghiaccio.

Usando l'estremità di uno stantuffo della siringa, macerare delicatamente la milza attraverso la rete. Quando è stata ottenuta una sospensione a singola cellula, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungere quattro volumi di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio per esaurire i globuli rossi. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere le celle mediante centrifugazione e risospendere il pellet in terreno completo a una concentrazione da due a cinque volte da 10 a settima cella per millilitro.

Filtrare le cellule attraverso una nuova rete di nylon da 40 micrometri per rimuovere i detriti cellulari. Ed etichettare una volta per 10 su sette cellule per topo ricevente con un colorante fluorescente compatibile con cellule vive che verrà trattenuto dopo la successiva fissazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in quattro volumi di HBSS integrati con HEPES.

E risospendere il pellet in HBSS fresco più HEPES a una concentrazione di una volta 10 fino all'ottava cella per millilitro. Quindi, agitare brevemente le cellule del donatore e caricarle in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 27 gauge da 0,5 pollici. Posizionare i topi riceventi neri C57 di età compresa tra 8 e 12 settimane anestetizzati in posizione prona e applicare una leggera pressione caudale sulla pelle dorsale all'occhio del primo animale, provocando una leggera sporgenza del bulbo oculare.

Dirigere l'ago medialmente per l'iniezione retro-orbitale di 100 microlitri di cellule donatrici. Quindi, ritirare gradualmente l'ago e posizionare il topo in una gabbia di recupero individuale con monitoraggio fino al completo recupero. È fondamentale che gli animali siano adeguatamente anestetizzati e che la procedura di iniezione sia stata ben praticata per garantire una consegna coerente delle cellule tra gli animali e tra gli esperimenti.

Fino a 24 ore dopo il trasferimento adottivo, raccogliere la milza in un millilitro di terreno completo per ricevente. E generare una sospensione unicellulare priva di globuli rossi come appena dimostrato. Dopo il conteggio, regolare la sospensione cellulare a una concentrazione di tre volte 10 per sette cellule per millilitro nel tampone di colorazione.

E trasferire 100 microlitri di cellule in pozzetti individuali di una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti. Colorare le cellule per i marcatori di interesse secondo i protocolli standard di analisi citofluorimetrica. Dopo 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce, lavare le celle in 100 microlitri di tampone colorante e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone colorante fresco per una seconda centrifugazione.

Quindi risospendere il pellet in 125 microlitri di tampone di colorazione fresco e analizzare i campioni cellulari su un citometro a flusso secondo i protocolli standard. Le letture fluorescenti automatizzate per tracciare la migrazione dimostrano chiaramente un'induzione della migrazione cellulare verso MCP-1 che aumenta in presenza di siero. A seconda dell'intensità dello stimolo migratorio, c'è un ritardo di almeno 15 minuti prima di un aumento del segnale fluorescente che può raggiungere il picco e diminuire gradualmente man mano che le cellule passano in soluzione nella camera inferiore dalla parte inferiore dell'inserto a una velocità maggiore rispetto a quella delle cellule che migrano dalla camera superiore.

Se più di una popolazione cellulare marcata in fluorescenza viene trasferita in modo adottivo, è importante quantificare la proporzione relativa delle popolazioni cellulari all'interno del materiale in ingresso per tenere conto di eventuali variazioni nella miscelazione delle popolazioni cellulari. Ad esempio, in questo esperimento, il rapporto tra celle fluorescenti verdi e arancioni era di 0,97 a uno. Il traffico è stato quantificato dividendo il numero di cellule marcate recuperate per il numero totale di cellule recuperate.

Mentre c'è una notevole varianza nel numero di cellule recuperate tra gli animali, per ogni dato animale il rapporto tra celle fluorescenti verdi e arancioni è in genere approssimativamente uguale. Una volta padroneggiata, la tecnica in vitro può essere completata in quattro ore e la tecnica in vivo può essere completata in sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare di creare bolle nelle camere sperimentali e di cercare la coerenza durante l'iniezione retro-orbitale delle cellule trasferite in modo adottivo.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la chemiotassi in vitro e in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre e monitorare un test di chemiotassi in vitro in tempo reale e isolare i linfociti nativi per il loro trasferimento adottivo e per tracciare la loro migrazione in vivo. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.