Name: Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara a quantificare la chemiotassi dei monociti in tempo reale e a tracciare la migrazione dei linfociti in vivo utilizzando cellule THP-1 e modelli murini. Questi protocolli avanzati permettono analisi quantitative multiple per studi immunologici.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma di Bernard L. Schwartz per gli scienziati di medico presso la Rockefeller University, il fondo di sviluppo terapeutico Robertson presso la Rockefeller University e la Sackler Center per la biomedicina e nutrizione ricerca presso la Rockefeller University.

tutte le procedure sono state approvate dal Rockefeller University &#39; s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche.
 1. chemiotassi In Vitro <ol><li>cultura THP-1 cellule 6 nel 1640 di Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 mM) (completo di media), mantenendo la densità tra 0,5-1,0 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Coltura di cellule in un 35 mm piatto, etichetta 3,5 x 10 5 THP-1 cellule per condizione con calceina acetossimetil (calceina-AM; 2,5 µM) o altre adatta tintura fluorescente nei media completi a 37 ° C per 30 min. 
	Nota: Coloranti devono essere permeabile della membrana cellulare e compatibile con cellule vive etichettatura.</li>
	<li>Pre-caldo un lettore di piastra a 37 ° C. 
	Nota: Oltre a controllo di temperatura, funzione inferiore-lettura è anche richiesto. Vedere il punto 1.10.2 per un'alternativa a un lettore di piastra per la quantificazione della migrazione cellule.</li>
	<li>Mentre le cellule sono etichettatura, preparare la piastra di dosaggio e la camera bassa.
	Piastra <ol><li>uso una cultura di tessuto 24 pozzetti, con una condizione per pozzetto. Eseguire ogni condizione in triplice copia.</li>
		<li>Aggiungere 750 µ l di Hank &#39; s soluzione salina tamponata (HBSS) tamponata con 25mm HEPES e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) per la piastra a 24 pozzetti. Questo serve come la condizione basale di controllo.
		<ol><li>Uso altri pozzi per le condizioni di comparatore, mantenendo sempre il volume totale nel vano inferiore a 750 µ l. 
			Nota: In questo esempio, umano monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) serve come controllo positivo per chemiotassi 7.
			<ol><li>Assemblare la miscela reagente combinando HBSS con 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Utilizzare siero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 come un controllo positivo aggiuntivo. 
				Nota: Concentrazione delle chemochine e chemochine dipenderà l'asse chemiotattica sotto studio. Liofilizzato di MCP-1 è risospeso in acqua distillata con BSA (0,1%) per fare una soluzione di riserva con una concentrazione finale di 50 μg/mL. Questo può essere diluito in acqua per una soluzione di lavoro di 10 μg/mL. Aggiungere 5,6 μL della soluzione per la camera inferiore.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Dopo aver completata la composizione delle sezioni inferiore, collocare un inserto poroso in ciascun pozzetto, assicurando che le schede dell'inserto allineano con le tacche della piastra. 
		Nota: Scegliere il formato del poro appropriato per gli inserti. Per i monociti e linfociti, un diametro dei pori di 3 μm si comporta bene. Alcuni tipi di cellule e/o sistemi di chemokine possono richiedere una superficie verniciata a matrice per migrazione ottimale. Ad esempio, per misurare la chemiotassi di monociti THP-1 verso MCP-1, fibronectina o rivestite con collagene inserti sono raccomandati. Per il lettore per la quantificazione, l'inserto deve avere un rivestimento luce-impermeant, come polietilene tereftalato, per impedire il rilevamento di migrazione non celle nella parte superiore dell'alloggiamento 8.</li>
	</ol></li> <li>Dopo incubazione le cellule per 30 min con calceina-AM, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15mL. Cellule di centrifugare a 1.000 x g per 2 min. Ispezionare visivamente le cellule per confermare l'assorbimento di calceina-AM ( Figura 1).</li>
	<li>Rimuovere con cautela il supernatante utilizzando un aspiratore. Lavare le cellule con etichettate in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 minuti e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Contare le celle e regolare il volume in modo che le cellule sono ad una concentrazione finale di 1.0-1.5 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Dispensare 250 μL della sospensione delle cellule nell'inserto (camera superiore).</li>
	<li>Dopo che tutte le camere superiori sono state riempite, delicatamente sollevare la piastra e ispezionare la parte inferiore per la presenza di bolle d'aria che potrebbero interferire con la migrazione e la rilevazione. Per rimuovere una bolla, prima di provare a rimuovere poi ri-posizionamento dell'inserto. In caso contrario, utilizzare un ago 27G per bucare la bolla e quindi riposizionare l'inserto.</li>
	<li>Collocare la piastra nel lettore di piastra preriscaldata 37 ° C.
	<ol><li>Letture di fluorescenza di acquisire dal fondo ad intervalli di 1-3 min. Quando si utilizza calceina-AM, impostare la fluorescenza lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. A seconda del sistema di tipo e chemochine cella, chemiotassi si verifica in genere oltre 1-4 h ( Figura 2A).</li>
		<li>Come alternativa alle misurazioni continue di immagine utilizzando un lettore di piastra, pozzi usando un microscopio fluorescente invertito ( Figura 2B), in grado di eccitazione e di rilevamento della luce a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. Utilizzare un basso ingrandimento per acquisire la maggior parte della parte inferiore dell'inserto. Quantificare le cellule di elaborazione delle immagini con ImageJ o simili software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Trasferimento adottivo di linfociti murini <ol><li>preparazione delle cellule erogarici <ol><li>Anesthetize 8-12 settimana-vecchi topi di donatore maschio C57BL/6J con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore. Confermare appropriata profondità dell'anestesia di punta-pizzico.</li>
		<li>Posizionare il mouse nella posizione supina. Fare un'incisione del midline con un bisturi e individuare la milza nello spazio peritoneale superiore di sinistra. Asportare la milza intera e metterli in media completi (RPMI completato con 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/milza) su ghiaccio. Eutanasia di animali anestetizzati donatori per decapitazione.</li>
		<li>Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media (1ml /spleen) usando l'estremità di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento di una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi di lisi di ammonio cloruro potassio (ACK) buffer e incubare per 5 min a temperatura ambiente per lisare gli eritrociti.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Se gli eritrociti rimangono nel pellet, risospendere in buffer di lisi ACK, incubare per 5 min a temperatura ambiente, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min e gettare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in completa per i media ad una concentrazione di 2-5 x 10 7 cellule/mL, quindi colare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon di 40 µm per rimuovere i detriti cellulari.</li>
		<li>Etichetta 1 x 10 7 mouse di cellule/destinatario con un colorante fluorescente compatibile con cellule vive e che sarà mantenuto anche dopo la fissazione successiva, ad esempio 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentrazione finale 2 μM) 10 . Incubare a 37 ° C per 30 min. 
		Nota: Per tenere traccia di più di una popolazione di cellule, utilizzare altri coloranti fluorescenti con popolazioni di altre cellule. Se, ad esempio, una porzione delle cellule erogarici possa essere etichettata con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoile) ammino) tetrametilrodamina (concentrazione finale 2 μM) 11.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi HBSS completati con 25mm HEPES, poi Centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e scartare surnatante. Risospendere il pellet in HBSS completati con 25mm HEPES ad una concentrazione finale di 1 x 10 8 cellule/mL.
		<ol><li>Se si utilizza più di un colorante fluorescente, mantenere popolazioni cellulari separate fino al momento immediatamente precedente iniezione.</li>
			<li>Trasferire una piccola aliquota (10 μL) delle cellule di ogni colore a una soluzione fissante (1 mL) per compensazione di cytometry di flusso successivo.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Trasferimento dei linfociti <ol><li>anestetizzare 8-12 settimana-vecchio C57BL/6J topi maschi destinatari con isoflurano (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Applicare unguento veterinario animale &#39; gli occhi per evitare l'essiccazione.</li>
		<li>Brevemente le cellule erogarici vortice (1 s) e trasferimento a siringa di iniezione da 1 mL con 27 G, 0,5 in ago, combinando le popolazioni delle cellule differenzialmente etichettati, se applicabile.
		<ol><li>Una piccola aliquota (10 μL): trasferimento di cellule miste a una soluzione fissante (1 mL) per le analisi di citometria a flusso successivo.</li>
		</ol></li> <li>Posto animali donatori in posizione prona. Applicare pressione caudale lieve sulla pelle dorsale per l'occhio, causando il bulbo oculare a sporgere leggermente.</li>
		<li>Dirigere l'ago medialmente e iniettare 100 µ l di sospensione cellulare donatore retrò-orbitally in ogni destinatario mouse. Cellule possono anche essere iniettate tramite vena caudale.</li>
		<li>, Gradualmente, ritirare l'ago per iniezione e posizionare il mouse da solo in una gabbia di recupero. Animale di monitor fino a quando ha riacquistato coscienza; una volta completamente recuperato ritorno l'animale all'housing sociale.</li>
	</ol></li> <li>Raccolta e l'analisi <ol><li>dopo 1 h, anestetizzare destinatari topi con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Raccogliere la milza (o altri tessuti di interesse) (punto 2.1.2.) da ogni destinatario mouse e posto in un supporto completo (1 mL/destinatario). Eutanasia di animali anestetizzati per decapitazione. 
		Nota: Gli intervalli più lunghi prima del raccolto del tessuto aumenterà accumulo di tessuto attraverso almeno 24 h.</li>
		<li>Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media usando la parte di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento per provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi di lisi ACK buffer e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in colorazione buffer (tampone fosfato salino completato con 1% FBS). Contare le celle e regolare a una concentrazione finale di 3 x 10 7 cellule/mL. Trasferire 100 µ l di sospensione cellulare a un 96 pozzetti fondo piatto rotondo.</li>
		<li>Cellule di macchia per marcatori desiderati (vedere la tabella materiali) per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere anticorpi coniugati fluoroforo (Vedi la tabella materiali) contro marcatori desiderati e incubare a 4 ° C per 20 min al buio. Aggiungere 100 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 200 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in macchiatura di 125 µ l tampone e acquisire campioni usando un cytometer di flusso utilizzando le procedure standard. 
		Nota: Il colorante verde viene eccitato da un laser a 488 nm e l'emissione viene rilevata con filtri dicroici 505 e 530/30. Il colorante arancio viene eccitato da un 561 nm e l'emissione viene rilevata da un filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvato le cellule dalla 2.1.8.2 per compensare ogni tintura fluorescente. 
			Nota: Utilizzando la compensazione basata sul tallone con fluorofori l'eccitazione e spettri di emissione delle tinture d'etichettatura corrispondenti si tradurrà in compensazione suboptimali.</li>
			<li>Utilizzare le celle di input salvate dal punto 2.2.2.1 per determinare con precisione il rapporto tra differenzialmente etichettato celle di input se si utilizza più di una popolazione con etichetta ( Figura 3). Calcolare la migrazione specifica del tessuto sulla base del rapporto di etichettati alle cellule senza etichetta ( Figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
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<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Quantificazione della migrazione delle cellule immuni può essere compiuta usando semplice e veloce saggi sia in vitro che in vivo. Dimostriamo la chemiotassi in vitro di monociti umani in risposta un gradiente di MCP-1 e l'aumento di siero. In vivo, gli splenocytes murini donatore differenzialmente sono stati etichettati e a seguito di trasferimento adottivo, sono stati recuperati dal destinatari animali.
Utilizzando un lettore di piastra ha il vantaggio di ...

Robusta immunità richiede il complesso coordinamento temporale e spaziale di una miriade di tipi di cellule al fine di rispondere in modo appropriato alla lesione, infezione e generare auto-tolleranza. Parecchi dozzina recettori per le chemochine e loro corrispondenti ligandi sono stati scoperti e caratterizzati fornendo meccanismi molecolari da cui le cellule specifiche possono essere diretto in un tessuto specifico in un momento specifico. Pertanto, studiare chemiotassi e migrazione è una componente indispensabile di ricerca in immunologia. Infatti, l'analisi descritta in vitro è stata recentemente usata come uno strumento di screening per identificare un cofattore chemiotattico che accelera la chemiotassi delle cellule T verso C-C chemochine 19 e 213. Lo scopo dei metodi descritti qui sono per consentire valutazioni quantitative della chemiotassi delle cellule immuni in vitro e in vivo.
L'analisi della camera di Boyden (migrazione cellulare e invasione) è un metodo poco costoso, riproducibile e rapido per valutare la migrazione cellulare4,5. In analisi standard, camera superiore è seminata con le cellule ed è separata da un inserto poroso da un alloggiamento più basso, in cui le cellule migrano. Al momento desiderato, le cellule che hanno migrato alla parte inferiore dell'inserto possono essere fissa e macchiate per quantificazione di microscopia chiara. Tuttavia, tali misure vincolano la raccolta di dati di un singolo punto di fine, che preclude la raccolta di dati dinamica e possono richiedere la vasta ottimizzazione per determinare il punto di tempo ottimale per l'analisi. Qui, diversi adattamenti sono descritti che consentono misurazioni in tempo reale, quantitative e multiplex di chemiotassi in vitro.
Per in vivo gli studi, viene utilizzato un punto di fine funzionale, vale a dire l'accumulo specifico delle cellule in un vano dato tessuto. Le cellule erogarici pre-etichettata vengono introdotti in animali destinatari attraverso trasferimento adottivo. Queste cellule del donatore possono essere identificate successivamente tramite flusso cytometry dopo il raccolto di destinatario del tessuto. È anche presentata una strategia co-etichettatura che consente per la determinazione del traffico di tipi differenti delle cellule all'interno di un singolo animale destinatario. Questo metodo elimina la variazione inter-animale da iniezione di cellule e conti per fisiologica variabilità.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Eccitazione: 485 nm, Emissione: 520 nm</td></tr><tr><td>Cella piatto di coltura</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Inserto in fibronectina</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumina</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino adulto</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con calcio e magnesio; senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre SpectraMax M2e</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein salute animale</td><td>11695-6776-2</td><td>Anestesia isofluorana</td></tr><tr><td>Filtro cellulare 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampone di lisi</td><td>Qualità Biologico</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Colorante CMTMR arancione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Eccitazione: 541nm, Emissione: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Colorante CMFDA verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Eccitazione: 485nm, Emissione: 520nm</td></tr><tr><td>siringa da 5 ml</td><td>Siringa BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Siringa TB da 1 ml</td><td>Siringa BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anticorpo CD3 anti-topo</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Eccitazione: 405 nm, Emissione: 421 nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-topo CD19</td><td>Antibody Biolegend</td><td>115540</td><td>Eccitazione: 405 nm, Emissione: 603 nm</td></tr><tr><td>Piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citometro a flusso</td></tr></tbody></table>

quantificazione del linfocita murino traffico in vivo e chemiotassi del monocito umano in vitro

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

La chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico specifico1. Le chemochine sono citochine chemiotattiche che promuovono il traffico cellulare con specificità anatomiche e temporale2. La chemiotassi è una funzione critica dei linfociti e altre cellule immuni che possono essere quantitativamente valutata in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi che consentono la valutazione della chemiotassi, sia in vitro che in vivo, per tipi cellulari diversi tra cui linee cellulari e cellule native. Lo in vitro, formato basato su piastra permette il confronto delle diverse condizioni contemporaneamente in tempo reale e può essere completato entro 1-4 h. In vitro analisi condizioni possono essere manipolate per introdurre gli agonisti e antagonisti, come bene come differenziare la chemiotassi da chemokinesis, che è il movimento casuale. Per le valutazioni traffico in vivo , le cellule immuni possono essere contrassegnate con le tinture fluorescenti più e utilizzate per trasferimento adottivo. L'etichettatura differenziale delle cellule consente di popolazioni di cellule miste ad essere introdotti nello stesso animale, quindi diminuendo la varianza e riducendo il numero di animali necessari per un esperimento adeguatamente alimentato. Migrazione nel tessuto linfoide si verifica in meno di 1 h e compartimenti multipli possono essere campionati. Citometria a flusso successivo vendemmia del tessuto permette un'analisi rapida e quantitativa dei flussi migratori di più tipi di cellule.

Quando si utilizza il colorante calceina-AM, ispezione visiva delle cellule confermerà l'assorbimento etichetta (Figura 1). Letture di fluorescente automatizzate terrà traccia migrazione come transito di cellule sulla parte inferiore dell'inserto nel corso del tempo. Questi dati mostrano chiaramente un'induzione della migrazione cellulare verso MCP-1, così come un aumento di questa risposta dal siero (Figura 2A). A seconda della ...

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Gli obiettivi generali di questi saggi sono quantificare la chemotassi dei monociti in vitro in tempo reale e tracciare la migrazione dei linfociti in vivo. Il metodo in vitro può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, ad esempio quali sono gli effetti dei fattori sierici sulla chemotassi delle cellule immunitarie. Il principale vantaggio della tecnica in vitro è che consente misurazioni quantitative e multiplex in tempo reale.Il metodo in vivo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia riguardo al modo in cui specifici tipi cellulari migrano all'interno di un animale ricevente. La tecnica in vivo è particolarmente utile per la valutazione quantitativa della migrazione di più tipi cellulari all'interno dello stesso animale. Prima di iniziare l'esperimento, etichettare le cellule THP-1 con un colorante fluorescente in una piastra per colture cellulari da 35 millimetri in mezzo completo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Mentre le cellule sono in incubazione, aggiungere 750 microlitri di HBSS tamponato con 25 millimoli di HEPES e 0,1% di BSA nei pozzetti di controllo di fondo e di controllo positivo di una piastra a 2

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Questo video mostra un'indagine sperimentale sulla trasmigrazione dei linfociti attraverso un modello di endotelio della barriera emato-encefalica (BBB). Un monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HBMEC) viene generato in vitro e al monostrato vengono aggiunte cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) contenenti linfociti. Le cellule vengono quindi incubate per consentire la trasmigrazione dei linfociti e le cellule migrate vengono quantificate utilizzando la...

Studio della trasmigrazione dei linfociti attraverso un monostrato di cellule endoteliali microvascolari

Descriviamo un protocollo per misurare trasmigrazione dai monociti attraverso strati monomolecolari endoteliali umani e la loro successiva maturazione in cellule della gomma piuma. Questo fornisce un metodo versatile per valutare le proprietà atherogenic dei monociti isolati da persone con diverse patologie e per valutare i fattori nel sangue che possono migliorare questa propensione.

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Qui, presentiamo un protocollo integrato che misura sottopopolazione del monocito traffico sotto flusso in vitro mediante uso di specifici marcatori di superficie e microscopia a fluorescenza confocale. Questo protocollo consente di esplorare reclutamento sequenziale passaggi anche per quanto riguarda il profilo di altri sottotipi del leucocita utilizzando altri specifici marcatori di superficie.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Qui presentiamo un protocollo per quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue nei modelli murini, per valutare gli effetti degli interventi nutrizionali, farmacologici e genetici sul monocito del sangue e per caratterizzare i monociti del sangue derivati dai macrofagi in modelli murini che utilizzano tappi di gel derivati dalla membrana del basato monocite-chemoattractant-1 (MCP-1).

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

In questo protocollo, i linfociti sono collocati nella camera superiore di un sistema di trasmigrazione, separato dalla camera inferiore da una membrana porosa. La chemiochina viene aggiunta alla camera inferiore, che induce una migrazione attiva lungo un gradiente di chemiochina. Dopo 48 h, i linfociti vengono contati in entrambe le camere per quantificare la trasmigrazione.

Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia a contrasto temporale e a contrasto di fase per immagini di macrofagi peritoneici residenti nel gradiente C5a di complemento chemiotattico. I protocolli possono essere estesi ad altre cellule immunitarie.

Immagine time-lapse di Mouse Macrophage Chemotaxis

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

Impara a quantificare la chemiotassi dei monociti in tempo reale e a tracciare la migrazione dei linfociti in vivo utilizzando cellule THP-1 e modelli murini. Questi protocolli avanzati permettono analisi quantitative multiple per studi immunologici.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

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