Name: Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri come monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta ipossica di S. cerevisiae utilizzando RNA-seq. Questo metodo permette di analizzare la dinamica dell'espressione genica in risposta allo stress ambientale.

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Ringraziamo l'Istituto Lewis-Sigler per Integrative Genomics Sequencing Core Facility all'Università di Princeton per consulenza tecnica e per il sequenziamento e preparazione di RNA biblioteca. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Rowan University e NIH NIGMS R15GM113187 a Boy

1. indurre ipossia
<ol><li>Un giorno o più prima del corso di tempo di ipossia: preparare l'incubatrice, cellula filtraggio sistema, vuoto, serbatoio di gas, boccette, tappi, tubazione di vetro e tubi, come indicato nella Tabella dei materiali.</li>
	<li>Posizionare il serbatoio2 N, incubatrice, sistema di aspirazione e filtraggio nelle immediate vicinanze, per attivare l'elaborazione rapida delle cellule.</li>
	<li>Preparare terreno YPD liquido sterile (1%, Estratto di lievito, 2% di peptone, 2% glucosio) con i componenti in una bottiglia di vetro e la sterilizzazione in autoclave.</li>
	<li>Planimetria di boccette in incubatrice. Nota: Dal serbatoio N2 , il primo pallone sarà una trappola d'acqua, la seconda beuta sarà l'ultimo punto di tempo, il terzo pallone sarà il punto di secondo all'ultimo momento e così via fino al ultimo pallone che è una trappola finale dell'acqua. La figura 1 Mostra l'ordine e le connessioni tra le boccette.</li>
	<li>Il giorno prima del corso di tempo, inoculare una Colonia del lievito in una cultura di 5 mL di liquido YPD all'interno di una provetta sterile. In particolare, di raccogliere una colonia completa da una piastra con un bastoncino sterile. Inserire la chiavetta nel YPD liquido e agitare il bastone fino a quando la maggior parte delle cellule sono in sospensione.</li>
	<li>Ruotare i tubi a 30 ° C durante la notte (~ 16 h). Nota: Dopo le 16h, wildtype cellule raggiungerà saturazione (~ 2 x 108 cellule/mL), indicato da una cultura molto nuvolosa. Altri ceppi potrebbero richiedere più tempo per raggiungere la saturazione e dovrebbero essere testati misurando la concentrazione cellulare con uno spettrofotometro, come indicato nel passaggio 1.9.4.</li>
	<li>Il giorno del corso di tempo, dopo 16 h di incubazione, diluire la cultura saturata 01:50 utilizzando una pipetta da 5 mL per porre 4 mL di pernottamento cultura in 196 mL di YPD liquido all'interno di un pallone da mL 500 sterile. Crescere con agitazione a ~ 200 giri/min per 4 ore a 30 ° C. Nota: Dopo 4 h, una cultura di wildtype raggiungerà una concentrazione di Mid-registro di ~ 1-2 x 107 cellule/mL.</li>
	<li>Durante l'incubazione di 4 h, etichettare le beute (per ipossia e acqua trappole) e i 50 mL provette per il prelievo. Se l'incubatore nel passaggio 1.7 sopra non viene utilizzato per il corso di tempo di ipossia, accendere l'altro incubatore e impostato su 30 ° C.</li>
	<li>
Appena prima di sottoporre le cellule ad ipossia:
	<ol>
<li>Aggiungere ~ 50 mL di acqua a due delle beute sterili 250 mL che serviranno come le trappole di acqua.</li>
		<li>Riempire 1/3 di un ghiaccio secchio con azoto liquido e immergere un rack di polistirolo espanso per contenere provette centrifuga da 50 mL.</li>
		<li>Impostare il sistema di filtro per la raccolta di cellule. Aggiungere un filtro sterile disco sull'unità di fondo del sistema di filtrazione con pinzette sterili, facendo attenzione a toccare solo i bordi del disco filtro. Posizionare l'unità superiore filtro sul gruppo filtro inferiore e fissarlo con le fascette fornite con il sistema. Assicurarsi che l'unità superiore e inferiore siano allineati in modo che vi sia una tenuta ottimale e senza perdite.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di cellule con uno spettrofotometro. Diluire le cellule in modo che possono essere misurati in campo lineare dello spettrofotometro – OD600 tra ~0.2 - 0.6, a seconda dello spettrofotometro. Nota: Un'unità di600 OD è ~ 3 x 107 cellule/mL, a seconda della morfologia delle cellule e spettrofotometro. È prevista una concentrazione di ~ 1-2 x 107 cellule/mL, corrispondenti a OD600 di ~0.33 - 0,66.</li>
		<li>
Ottenere rapidamente il campione di tempo 0.
		<ol>
<li>Collegare il sistema di filtro a un vuoto forte (~ 10 mbar) tramite tubo del vuoto e una trappola di boccetta di 1.000 mL. Applicare il vuoto. La cultura (solitamente ~ 20 mL) versare il sopralzo e attendere per liquido di essere tirato attraverso il filtro (~ 10 s, a seconda della forza del vuoto).</li>
			<li>Rimuovere il disco filtro con pinzette pulite delicatamente e posto in una provetta da centrifuga 50 mL. Posizionare immediatamente la provetta nel rack immerso in azoto liquido. D'importanza, non pre-raffreddare i tubi prima di inserire il filtro come i tubi esploderà.</li>
			<li>Dopo > 30 s, posto il tubo in un congelatore-80 ° C per la successiva estrazione del RNA. Dopo ogni filtrazione, pulire e rimontare il sistema filtrante. Sciacquare il sistema tirando acqua attraverso per 10 s senza un disco di filtro. Infine, asciugare il sistema con un tovagliolo di carta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Diluire la cultura di 4h in boccette differenti per i vari punti di tempo, affinché ciascuna beuta raggiunge metà log concentrazione (~ 1-2 x 107 cellule/mL) presso il punto di tempo indicato di ipossia. Nota: La tabella 1 Mostra le diluizioni che sono state utilizzate per il ceppo aploide di selvaggio-tipo S288C HAP1+ . Si consiglia di testare ogni ceppo in queste condizioni ipossiche cultura e regolare di conseguenza le diluizioni.</li>
		<li>Una volta che le cellule e i media vengono aggiunti a boccette, sostituire il foglio di alluminio che copre il matraccio di apertura con tappo contenente due tubi di vetro inseriti.</li>
		<li>Posizionare le beute nell'incubatore nel layout determinato in precedenza.</li>
		<li>Collegare saldamente il tubo come illustrato nella Figura 1.</li>
		<li>Verificare che tutti i tappi sono strettamente inseriti nelle aperture del pallone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al tempo 0, aprire la valvola del regolatore. Quindi impostare il misuratore di portata a 3 L/min. Nota: Bubbling sarà osservato in due flaconi di acqua, che indica il flusso di gas corretto. Se questo non è il caso, verificare che tutti i tappi sono stretti e tubazione sia collegata correttamente.</li>
	<li>Chiudere l'incubatrice e impostare la velocità di agitazione a ~ 200 giri/min. Avviare un timer.</li>
	<li>Prima di ogni punto del tempo, è possibile impostare il sistema di filtro come descritto sopra al punto 1.9.3.</li>
	<li>
Ogni punto di tempo (ad es., 5min, 10min, ecc.), sono due persone di elaborare rapidamente le cellule come segue:
	<ol>
<li>Prima persona: togliere il matraccio appropriato da parte del titolare e togliere il tappo (con tubo di vetro collegato). Nota: Questo non interromperà il flusso di N2 a uno qualsiasi dei restanti matracci di cultura ma interromperà temporaneamente il flusso all'ultima trappola di acqua.</li>
		<li>Seconda persona: dispensare 1 mL di coltura e pipettare in una provetta. Ricollegare il tubo nel matraccio di cultura che è ora alla fine della riga all'ultima trappola di acqua (un tubo e un tappo volontà essere rimossi nel processo.). Quindi, misurare la concentrazione di cellule in provetta, come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.4.</li>
		<li>Prima persona: versare il resto della cultura il sistema di filtrazione sotto vuoto e quindi eseguire il filtro e congelamento come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al termine tutti i punti di tempo, spegnere il gas2 N. Prima chiudere il regolatore e attendere che la pressione rilasciare e quindi spegnere il misuratore di portata. Infine, smontare il sistema e pulire tutti i materiali con acqua e poi con etanolo al 70%.</li>
</ol>2. estrazione del RNA
<ol><li>Preparare il tampone di RLT per purificazione di RNA colonna, come descritto nella Tabella dei materiali.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro di dnasi aggiungendo 10 µ l di soluzione madre dnasi a 70 µ l di tampone RDD per campione (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Rimuovere le provette da 50 mL contenente filtri e cellule dal congelatore-80 ° C e metterli su ghiaccio a scongelare (~ 15 min). Procedere come segue con tubi sul ghiaccio.</li>
	<li>Etichetta 2 mL provette con tappo a vite e metterli sul ghiaccio, una provetta per ogni campione. Aggiungere mL ~0.6 di perline lavata con acido in ogni provetta, utilizzando un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL di scoop e misurare le perline.</li>
	<li>Aggiungere 0,6 mL di tampone di RLT refrigerato per le provette da 50 mL.</li>
	<li>Dispensare su e giù per rimuovere le cellule dal filtro e sospendere in soluzione. Evitare di lasciare il filtro rimangono nella soluzione come il filtro sarà assorbire la soluzione. Rimuovere tutte le soluzione assorbita nel filtro utilizzando il puntale per spremere il filtro contro la parete del tubo.</li>
	<li>Trasferire tutto il liquido dal tubo 50 mL nelle provette con tappo a vite contenente microsfere.</li>
	<li>Disporre le provette con tappo a vite in un omogeneizzatore del mulino di perlina e correre per un minuto. Posizionare immediatamente le provette in ghiaccio per tre minuti. Ancora una volta, inserire i tubi l'omogeneizzatore e correre per un minuto.</li>
	<li>Rimuovere i tubi dal omogeneizzatore e posto in ghiaccio per 5 min. Le perline si depositano alla parte inferiore dei tubi.</li>
	<li>Eseguire il resto dei passaggi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con una pipetta, trasferire solo il lisato (~ 350 µ l), evitando le perle, ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Microcentrifuga per 2 min a velocità massima e quindi trasferimento il surnatante in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% (fatto da 200 etanolo di biologia molecolare-grado della prova). Mescolare bene il pipettaggio.</li>
	<li>Trasferire la soluzione e dell'eventuale precipitato a una colonna di RNA che è stata inserita all'interno di un tubo di raccolta da 2 mL.</li>
	<li>Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo (il liquido nel tubo).</li>
	<li>Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l dnasi I mix di incubazione per la membrana di colonna (non fare i lati del tubo) e lasciar per riposare per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Microcentrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Flusso continuo del microcentrifuge per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Microcentrifuga per 2 min a ≥ 12, 000 x g.</li>
	<li>Rimuovere la colonna delicatamente e inserire un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Microcentrifuga a tutta velocità per 1 minuto (per asciugare completamente la membrana).</li>
	<li>Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna.</li>
	<li>Eluire il RNA dalla colonna di microcentrifuging per 1 min ≥ 12, 000 x g. Quando si caricano le colonne in microcentrifuga, assicurarsi che i coperchi del tubo di raccolta si trovano ad affrontare in direzione centrifuga giri, per evitare che i coperchi di rottura.</li>
	<li>Aggiungere un altro 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna, mantenendo la colonna nello stesso tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Microcentrifuga per 1 min ≥ 12, 000 x g, affinché il volume finale eluato è 60 µ l.</li>
	<li>Memorizzare ogni provetta da 1,5 mL contenente 60 µ l di RNA nel congelatore-80 ° C.</li>
</ol>3. determinare la qualità e la concentrazione di RNA
<ol><li>Misurare la concentrazione di RNA e DNA in ogni campione di RNA, utilizzando (a) un fluorimetro, (b) fluorescente a DNA e RNA specifico coloranti e (c) provette, come elencato nella Tabella dei materiali. Seguire le istruzioni del fluorimetro e i coloranti.</li>
	<li>In alternativa, misurare la concentrazione di acido nucleico con uno spettrofotometro di UV a 260 nm. Nota: Una260 una lettura di 1.0 è equivalente a ~ 40 µ g/mL single-stranded RNA.</li>
	<li>Verificare la qualità di RNA eseguendo il RNA su un analizzatore di acido nucleico commerciale (Vedi Materiali tavolo) o su una valore standard di formaldeide / dell'agarosi gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq analisi
<ol><li>Dallo stock di RNA totale, compongono 21 µ l di 100 ng / µ l RNA in acqua RNAsi-libera. Utilizzare 1 µ l di questo 21 µ l per testare la concentrazione di RNA come sopra. Presentare i rimanenti 20 µ l (2 µ g) RNA totale ad un centro di sequenziamento esterno per arricchimento di mRNA, preparazione libreria strand-specifica (con otto o più codici a barre per multiplexing) e sequenziamento (Vedi Materiali tavolo). In alternativa, eseguire localmente mRNA arricchimento e preparazione di libreria e quindi inviare la libreria per il sequenziamento.</li>
	<li>Piscina otto o più campioni di multiplexati e sequenza in una corsia di un sequencer di prossima generazione.</li>
	<li>Scaricare il file FASTQ che contiene tutte le letture di sequenza e l'indice corrispondente legge. Inoltre, scaricare il file di testo contenente i codici a barre multiplex. Nota: Le letture di indice possono essere presenti in un file FASTQ separato. Inserire tutti questi file in una directory.</li>
	<li>Inserire lo script di shell fornito qui, "fastq_pipeline.sh", nella stessa directory. Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer. Nota: questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, la qualità di script taglia le letture, mappe le letture al genoma e genera un file delimitato da tabulazioni contenente il numero di letture al gene per ogni campione.</li>
	<li>Depositare i file FASTQ e crudo conteggio lettura dati in Omnibus di espressione di Gene di NCBI prima pubblicazione 27. Seguire le istruzioni per "Invio dati di sequenza di high-throughput di GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importare i dati di lettura conteggio nell'ambiente statistico R ed effettuare analisi statistiche, utilizzando lo script di R fornito qui, "time_course_script. R". Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer. Nota: Questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, questo script consente di importare i dati letti, normalizza le letture, individua i geni che cambiano in modo significativo nel corso del tempo, esegue analisi PCA e grafici l'espressione di geni selezionati.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, i livelli di mRNA per tutti i geni è stata misurata durante l'ipossia nel lievito S. cerevisiae. L'obiettivo era di analizzare i cambiamenti di espressione genica globale a causa della crescita in un ambiente controllato vicino-anossico. Sono state adottate numerose misure per garantire che il metodo qui descritto è stato attentamente controllato e riproducibile. In primo luogo, le cellule sono state esposte ad un ambiente ipossico precisamente definito: 99,999% N2 in contenuti multi...

Molti organismi rispondono all'ipossia, o basso O2, alterando gene expression 1,2,3. Questa risposta aiuta le cellule a fronte della mancanza di un substrato fondamentale per la respirazione aerobica e per parecchie reazioni biosintetiche, ma anche con un cambiamento di stato redox 4. Parecchi studi di microarray eseguiti in S. cerevisiae mostrano che i livelli di mRNA di centinaia di geni cambiano in risposta all'ipossia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq è stata utilizzata per caratterizzare i cambiamenti di espressione genica nel corso del tempo durante l'ipossia 13. Qui, i dettagli sperimentali sono presentati e discussi.
L'ipossia può essere realizzato in vari modi, ciascuno producendo un diverso livello di O2. Qui, l'ipossia è stato stabilito dal continuo fluire ultra-alto-purezza N2 in boccette, che abbassa [O2] dissolto immediatamente con cinetica riproducibile 10. È possibile che ci sono alcune molecole di2 O presenti che contribuiscono al metabolismo e nell'espressione genica ma questo ambiente è considerato molto vicino anaerobica. In assenza di O2, cellule di lievito non possono biosintetizzare eme, ergosterolo e acidi grassi insaturi 4,12,14. Così, gli studi precedenti hanno incluso questi metaboliti quando crescente lievito senza ossigeno 5,10,15. Tuttavia, molte risposte ipossiche sono mediate da svuotamento di questi metaboliti e così loro reintegro inverte il gene hypoxic espressione risposte 12,16. Al fine di imitare naturale ipossia, questi metaboliti non sono stati aggiunti ai media. Nel breve tempo che le cellule sono state esposte all'ipossia senza la presenza di questi metaboliti essenziali, non c'era nessun notevole aumento della morte cellulare (dati non mostrati) né una risposta di stress prolungato 13.
La risposta dipende anche il ceppo e il suo genotipo. Particolarmente importanti sono gli alleli dei regolatori noti di risposte ipossiche 2. Sullo sfondo di ceppo S288C è altamente desiderato in modo che risultati possono essere confrontati agli altri studi genomici eseguite con questo ceppo. Tuttavia, S288C contiene un allele di perdita-de-funzione parziale del HAP1 gene 17, un regolatore trascrizionale critico per la risposta hypoxic. Questo allele è stato riparato in S288C utilizzando un wildtype copia dal Σ1278b ceppo sfondo 11.
Espressione genica è altamente dipendente l'ambiente cellulare. Così, quando si esegue l'analisi del mRNA di genoma, è importante mantenere un ambiente costante pur variando un altro parametro come tempo, stimolo o genotipo. Per ottenere risultati altamente riproducibili, considera queste tre pratiche per lo studio e tutte le sue repliche biologiche o tecnici. In primo luogo, il experimenter(s) stesso dovrebbe svolgere lo studio, poiché pratiche tecniche possono variare tra gli sperimentatori. In secondo luogo, la stessa serie di ingredienti da utilizzarsi nei media crescita quanto ogni partita ha una composizione leggermente differente che possa influenzare l'espressione genica. In terzo luogo, per ridurre al minimo gli effetti del ciclo cellulare, ogni punto di tempo dovrebbe consistere asincrone cellule nella fase di Mid-registro di crescita (1-2 x 107 cellule/mL).
Quando che caratterizzano una risposta complessa come la risposta di espressione genica all'ipossia, un corso di tempo è vantaggioso per determinare la cinetica di vari eventi. Intervalli di tempo specifici dovrebbero essere scelti che catturerà i principali cambiamenti della risposta. In questo studio, sono stati osservati punti di tempo compreso tra 0 e 4 h, perché ultimi esperimenti ha rivelato i cambiamenti diffusi nell'espressione genica durante questo periodo 13.
Per misurare l'espressione genica globale, RNA-seq è stato usato 18,19. Questo metodo utilizza il sequenziamento di nuova generazione per determinare l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene. Rispetto all'analisi di microarray del DNA, il RNA-seq esibisce maggiore sensibilità (per rilevare le trascrizioni meno abbondanti), una maggiore gamma dinamica (per misurare le variazioni di piega maggiore) e riproducibilità superiore (a seguire con precisione l'espressione genica nel corso del tempo). In genere, più cellulare del RNA è RNA ribosomiale così molti metodi sono stati sviluppati per arricchire per specifici RNA specie 20. Qui, poli-T sfere sono stati utilizzati per purificare poli-A-contenenti trascrizioni del mRNA, però i vari commercialmente - Kit di svuotamento di rRNA disponibili potrebbe anche essere efficace nel arricchimento di mRNA.
Qui, la risposta di espressione del gene di S. cerevisiae all'ipossia è stata caratterizzata. Le cellule erano esposti ad ipossia e poi provate a otto punti di tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Per confermare la riproducibilità e per identificare le trascrizioni statisticamente modificate, sono stati effettuati tre replicati biologici. RNA è stato estratte da rottura meccanica e purificazione di colonna e poi elaborato per l'analisi di RNA-seq. La pipeline di post-sequenziamento è descritta e sono gli script di programmazione che consentono di eseguire la replica esatta delle analisi. In particolare, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l' ambiente statistico R 24e il DESeq2 pacchetto 25 sono stati utilizzati per elaborare i dati di RNA-seq e per identificare 607 geni che cambiano in modo significativo durante ipossia. Analisi delle componenti principali (PCA) e l'espressione genica dei replicati indicato la riproducibilità della tecnica. Clustering e heatmaps ha rivelato la cinetica di espressione ad ampio raggio, mentre l'analisi del gene ontology (GO) ha mostrato che molti processi cellulari, come respirazione aerobica, sono arricchiti nel set di geni regolati da ossigeno.

<table><tbody><tr><td>Incubatore a secco chiuso</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set a 30 &deg;C. Modificare la porta per consentire l'ingresso di un tubo Tygon. In alternativa, utilizzare l'incubatrice New Brunswick G25, che contiene una porta per tubi. Non utilizzare un agitatore d'acqua all'aperto, poiché la condensa si accumulerà nei tubi tra i palloni, potendo contaminare in modo incrociato le colture.</td></tr><tr><td>Portafiltro per microanalisi</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>diametro 25mm, supporto in acciaio inox, n. 5 tappi in silicone perforato montati in pallone filtrante standard da 125 mL</td></tr><tr><td>Forte vuoto</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>Il " casa" Il vuoto potrebbe essere troppo debole. In alternativa, utilizzare una pompa per vuoto portatile ad alimentazione elettrica come quella elencata qui.</td></tr><tr>Pallone <td></td><td></td> da <td>1.000 ml</td><td>Per fungere da trappola per vuoto.</td></tr><tr><td>~ 2 piedi di lunghezza del tubo a vuoto a parete pesante, diametro interno 3/8 in, diametro esterno 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Due pezzi: il primo collega il vuoto alla trappola e il secondo collega la trappola al sistema di filtraggio.</td></tr><tr>Serbatoio <td></td><td></td><td>del gas N2 ad alta pressione</td><td>Purezza del 99,999%, >1.000 psi, con regolatore e regolatore di flusso del gas</td></tr><tr><td>Pallone</td><td></td><td></td> autoclavato da 500 mL <td>Apertura coperta con foglio di alluminio. Uno per ogni ceppo di lievito.</td></tr><tr>Palloni <td></td><td></td><td>autoclavati da 250 mL</td><td>Aperture ricoperte da un foglio di alluminio. Uno per ogni punto temporale più due per le trappole d'acqua.</td></tr><tr><td>Tappi per palloni (misura 6, due fori con diametro di 5 mm)</td><td></td><td></td><td>Sterilizzati con etanolo al 70%. Uno per ogni pallone.</td></tr><tr><td>Tubo di vetro, lunghezza 9 cm o 17 cm, diametro interno 2 mm, diametro esterno 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilizzato con etanolo al 70%. Due tubi per ogni pallone. Mettere nei fori di ogni tappo. Vedere la Figura 1 per il posizionamento di tubi da 9 e 17 cm.</td></tr><tr><td>~25 cm di lunghezza del tubo di plastica, diametro interno 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>Un pezzo per ogni pallone. Sterilizzato con etanolo al 70%.</td></tr><tr><td>Dischi filtranti sterili</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>diametro 25 mm, 0,45 &; m dimensione dei pori, uno per ogni punto temporale</td></tr><tr><td>Cuvette sterili dH2O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL</td><td>Per misurare OD600 (cioè la concentrazione cellulare)</td>50 mL provette da centrifuga sterili Una per ogni punto temporale Pinzette pulite e sterili Azoto liquido Per il congelamento delle cellule <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perline lavate con acido</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Conservare a 4 gradi C per cellule di lisi</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Per la purificazione della colonna di RNA</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> Qiagen RLT <td>Preparare aggiungendo 10 &micro; L di &beta;-mercaptoetanolo per 1 mL di tampone RLT, mantenere a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Provette di raccolta da 2 mL</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluse nel Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluse nel Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluse nel Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock e soluzioni di lavoro</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>L'enzima DNasi I si presenta sotto forma di polvere liofilizzata in una fiala di vetro. Utilizzando un ago e una siringa sterili, iniettare 550 &micro; L di acqua priva di RNasi (fornita nel kit Qiagen) nel flaconcino. Mescolare capovolgendo delicatamente la bottiglia. Per evitare di denaturare l'enzima, non vortice. Utilizzando una pipetta, rimuovere questa soluzione madre dal flaconcino e conservare in congelatore (-20 &deg; C) in aliquote monouso (80 &micro; L ciascuno). La soluzione madre non deve essere scongelata e ricongelata.</td></tr><tr><td>Tampone RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluso nel kit Qiagen DNase</td></tr><tr>Provette <td></td><td></td><td>con tappo a vite da 2 mL ghiacciate</td><td>Per la lisi delle cellule durante l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>omogeneizzatore di microsfere</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Conservare in cella frigorifera</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>per terreni YPD liquidi</td></tr><tr><td>Estratto di lievito Bacto</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>per liquido Terreno YPD</td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>per terreni YPD liquidi</td></tr><tr><td>Provette per saggio Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici</td></tr><tr><td>Kit per il saggio Quant-iTTM dsDNA BR Thermo</td><td>Fisher</td><td>Q32853</td><td>per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici</td></tr> Kit per il <tr><td>test dell'RNA Quant-iTTM</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>per la misurazione della concentrazione di acidi nucleici</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi commerciale</td><td>Bioanalyzer Agilent</td><td>2100</td><td>per la misurazione della qualità degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Sequenziatore di nuova generazione</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>per librerie di sequenziamento</td></tr><tr><td>sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>per la creazione </td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'mRNA PrepX PolyA</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>per isolare l'mRNA dall'RNA totale</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ per il kit di libreria Illumina</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>per la creazione di librerie di sequenziamento specifiche per filamento dall'RNA totale</td></tr><tr><td>Splitter</td><td></td><td></td> <td>di codici a barrehttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, che include il comando</td><td></td><td></td> gzip <td>http://www.htslib.org/download/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installato prima di TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installato prima di R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (versione gratuita)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

misurazione dei livelli di mrna nel tempo durante la risposta hypoxic lievito s. cerevisiae

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complessi cambiamenti nell'espressione genica mediano in genere una grande porzione di una risposta cellulare. Ogni gene può cambiare espressione con la cinetica unico come il gene è regolato tramite la sincronizzazione particolare di uno dei molti stimoli, segnalazione vie o effetti secondari. Al fine di catturare l'intero gene espressione risposta all'ipossia nel lievito S. cerevisiae, analisi di RNA-seq è stata usata per monitorare i livelli di mRNA di geni tutti in momenti specifici dopo l'esposizione all'ipossia. L'ipossia è stato stabilito coltivando cellule in ~ 100% N2 gas. Cosa importante, a differenza di altri studi hypoxic, ergosterolo e acidi grassi insaturi non sono stati aggiunti ai media perché questi metaboliti influenzano l'espressione genica. Intervalli di tempo sono stati scelti nella gamma di 0 - 4 h dopo ipossia perché quel periodo acquisisce i principali cambiamenti nell'espressione genica. In ogni punto del tempo, le cellule hypoxic Mid-registro erano rapidamente filtrata e congelati, limitando l'esposizione di O2 e concomitanti cambiamenti nell'espressione genica. RNA totale è stato estratto dalle cellule e utilizzato per arricchire per mRNA, che è stato poi convertito in cDNA. Da questo cDNA, multisala librerie sono state create e otto o più campioni sono stati sequenziati in una corsia di un sequencer di prossima generazione. Una pipeline di post-sequenziamento è descritta, che include guarnizione base di qualità, leggere mapping e determinazione del numero di letture al gene. DESeq2 all'interno dell'ambiente statistico R è stato utilizzato per identificare i geni che cambiano significativamente in uno qualsiasi dei punti tempo ipossica. Analisi di tre replicati biologici ha rivelato alta riproducibilità, geni della cinetica differente e un gran numero di previsto O2-regolato geni. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare come le cellule di vari organismi rispondono all'ipossia nel tempo e adattati per lo studio di espressione genica durante altre risposte cellulari.

Il decorso di ipossia e RNA-seq analisi sono state eseguite in modo indipendente tre volte. Per esaminare la riproducibilità dei tre replicati, dati di espressione genica per tutti i geni è stati analizzati utilizzando Principal Component Analysis (PCA). La figura 2 Mostra come i campioni cambiano sopra i primi due componenti principali, che insieme rappresentano il 58,9% della variabilità. Questa analisi ha indicato che ogni corso tempo esibisce i cambiament...

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è monitorare nel tempo i livelli di mRNA di tutti i geni mentre le cellule di S.Cerevisiae sono esposte all'ipossia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione cellulare, come ad esempio: qual è la cinetica dei cambiamenti nell'espressione genica durante una risposta cellulare? Il vantaggio principale di questa tecnica è che i livelli di mRNA vengono misurati nel tempo, anziché in un singolo punto temporale durante la risposta cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla risposta ipossica del lievito, può essere applicato anche ad altre specie microbiche coltivabili in coltura liquida. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per illustrare in dettaglio la disposizione dei flaconi e delle connessioni dei tubi, nonché la rapida raccolta delle cellule dall'ipossia. Un giorno o più prima del corso temporale dell'ipossia, preparare i materiali necessari. Posizionare la bombola di azoto, l'incubatrice, il sistema a vuoto e il sistema di filtrazione in prossimità l'uno dell'altro per consentire un rapido trattamento delle cellule. Preparare il mezzo liquido YPD

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

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Vi presentiamo un semplice protocollo per ottenere filmati di microscopia a fluorescenza di crescita cellule di lievito, e un pacchetto software basato su GUI per estrarre i dati cella singola serie storica. L'analisi include lignaggio automatico e l'assegnazione a divisione di tempo integrato con ispezione visiva e curation manuale dei dati rilevati.

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Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.

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Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

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