Name: Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri la tecnologia snap chip per immunoassay sandwich multiplex senza cross-reattività, ideale per la quantificazione proteica in oncologia. Questo metodo semplificato elimina la necessità di microarray spotter complessi.

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Ringraziamo il Dr. Rob Sladek per l'uso del cercatore a getto d'inchiostro. Riconosciamo il supporto finale da istituti canadesi per Health Research (CIHR), scienza naturale e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC), l'Istituto di ricerca di società cancri canadese e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI). D.J. grazie sostegno da un Canada Research Chair.

1. fabbricazione e deposito di scatto chip <ol><li>metodo di trasferimento singolo ( Figura 1a) <ol><li>Spot cabina soluzioni contenenti 400 µ g/mL anticorpi e glicerolo 20% in tampone fosfato salino (PBS) su una nitrocellulosa (o un bicchiere funzionalizzato) diapositiva di dosaggio con un getto di inchiostro microarray spotter 13 a un'umidità relativa del 60% (1.2 nL per ogni spot) con spaziatura di centro--centro 800 µm. Accertarsi che il vetrino sia fissato sul ponte spotter secondo un angolo (qui, nell'angolo inferiore sinistro è stato utilizzato).</li>
		<li>Incubare il vetrino di saggio macchiato a temperatura ambiente per 1 h con un'umidità relativa del 60%.</li>
		<li>Morsetto una guarnizione di modulo diapositiva a 16 scomparti sul vetrino di saggio di dividerlo in 16 pozzetti. Sciacquare il vetrino tre volte con l'aggiunta di 80 µ l di PBS contenente 0.1% Tween-20 (PBST) in ogni bene e agitazione a 450 giri/min con un agitatore, 5 min ogni volta.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di bloccare soluzioni per ogni bene e agitare per 1 h a 450 giri/min.</li>
		<li>Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino di saggio con un flusso di azoto.</li>
		<li>Fissare un trasferimento sul ponte spotter e spingere nell'angolo inferiore sinistro della diapositiva contro angolo inferiore sinistro del ponte spotter. A getto d'inchiostro spot matrice di segni di allineamento (una soluzione di microsfere di polistirolo) con lo stesso layout che per i taxi.</li>
		<li>Asciugare i segni di allineamento. Capovolgere la diapositiva di trasferimento e rimetterlo sul ponte spotter, fissaggio contro l'angolo inferiore sinistro.</li>
		<li>Preparare il dAb spotting soluzioni contenenti 20 µ g/mL anticorpi, 20% glicerolo e BSA 1%.</li>
		<li>Utilizzando lo spotter &#39; s fotocamera, prendere una foto di un marchio di allineamento. Implementare questa immagine nel programma spotting come un fiducial e ottenere il sistema di riconoscimento di immagine del cercatore a getto d'inchiostro per identificare il marchio di sinistro più in alto. Usare la sua coordinata come il primo spot della matrice dAb. Spot 8 nL per goccia con una spaziatura da centro a centro di 800 µm.</li>
	</ol></li> <li>Metodo di trasferimento doppia ( Figura 1b) <ol><li>disporre un vetrino di trasferimento 1 sul ponte spotter inkjet contro l'angolo inferiore sinistro. Individuare soluzioni di cabine contenenti 400 µ g/mL anticorpi, glicerolo 20% e 1% BSA in PBS sulla diapositiva con un spotter di microarray a getto d'inchiostro ad un'umidità relativa del 60% (0,4 nL per ogni spot e ~ 200 µm di diametro). La spaziatura da centro a centro è 400 µm.</li>
		<li>a scatto il trasferimento con una nitrocellulosa rivestito (o un bicchiere funzionalizzato) dosaggio diapositive utilizzando un apparato di snap ( Figura 2) per trasferire le goccioline di cabina il vetrino di saggio.
		<ol><li>Disabilita tutti i sei pulsanti sul lato apparato snap di 90 gradi per tirare e bloccare tutti i tuffatori in posizione aperta. Inserire la diapositiva di trasferimento il portavetrini in suo recipiente con l'angolo tagliato rivolto verso il perno fisso pogo. Girare la prima serie di tre pulsanti per rilasciare i tuffatori con il perno d'oro pogo e assicurarsi che le diapositive vengono spinti contro i perni di allineamento.</li>
			<li>Inserire una diapositiva rivestite con nitrocellulosa in snap apparato capovolto udienza i 4 perni di pogo. Girare la seconda serie di tre pulsanti per rilasciare pressori con il perno d'argento e assicurarsi che le diapositive vengono spinti contro i perni di allineamento.</li>
			<li>Chiudere l'apparecchio snap posizionando il guscio superiore sulla porta diapositive utilizzando i pilastri di allineamento e fori per un posizionamento preciso.</li>
			<li>Inserire l'apparecchio snap chiuso nella sua gabbia e spingere la linguetta di chiusura completamente verso il basso per portare i microarrays faccia a faccia, esercitando la pressione appropriata. Tenere chiuso per 1 min.</li>
		</ol></li> <li>Separare le diapositive. Incubare il vetrino di saggio a temperatura ambiente per 1 h con un'umidità relativa del 60%. Lavare, bloccare e far asciugare il vetrino di saggio come descritto nei passaggi 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>Mettere un altro trasferimento slide sul ponte spotter inkjet e spingere contro l'angolo inferiore sinistro. Soluzioni punto dAb contenente 50 o 100 µ g/mL di anticorpi (Vedi tabella 1), glicerolo 20% e 1% BSA in PBS. Garantire che ogni luogo è 0,8 nL e la spaziatura da centro a centro tra spot è 400 µm.</li>
		<li>Memorizzare il dosaggio e lo scivolo di trasferimento. Guarnizione sia saggio e trasferimento i vetrini in un sacchetto ermetico contenente essiccante e messo in un congelatore a-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexed immunodosaggi con snap chips <ol><li>recuperare il vetrino di saggio dal freezer. Lasciare il sacchetto sigillato per 30 min fino a quando la diapositiva viene a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare 7 punti serie campione soluzioni diluite di chiodare proteine in PBS contenente 0.05% Tween-20. 
	Nota: Qui, viene utilizzato un fattore di diluizione 5 volte. Le concentrazioni di partenza per ogni proteina sono elencate nella tabella 1.</li>
	<li>Preparare soluzioni campione come appropriato. Ad esempio, diluire il siero umano 4 volte in tampone PBST.</li>
	<li>Morsetto una guarnizione 16-vano sulla diapositiva test.</li>
	<li>Riempire una colonna di 8 pozzetti con le soluzioni di diluizione 7 proteina e una soluzione di tampone PBST privo di proteine di pipettaggio. Pipettare soluzioni campione in altri 8 pozzetti nella stessa diapositiva. 
	Nota: 80 soluzioni µ l possono essere in forma in ogni bene. Altre diapositive possono essere utilizzati per misurare campioni supplementari quando necessario.</li>
	<li>Incubare i campioni su un agitatore a 450 giri/min per 1 h a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. lavare il vetrino tre volte con PBST sull'agitatore a 450 giri/min, 5 min ogni volta. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino sotto un getto di gas azoto.</li>
	<li>Recuperare la diapositiva di trasferimento con i tocchi dal freezer. Tenere il sacchetto sigillato per 30 min a temperatura ambiente. Quindi, incubare il vetrino in una camera chiusa (ad esempio casella vuota suggerimenti) contenente microsfere di stabilizzazione di umidità 60% per 20 min per reidratazione.</li>
	<li>a scatto la diapositiva di trasferimento con il vetrino di saggio utilizzando un apparato di snap ( Figura 2) per trasferire le goccioline di dAb. Vedere sezione 1.2.2 per il funzionamento dell'apparato snap.</li>
	<li>Separare le diapositive. Incubare il vetrino di saggio in una camera chiusa contenente microsfere di stabilizzazione di umidità 60% per 1 h. morsetto il vetrino di saggio con una guarnizione di 16-vano e sciacquare il vetrino 4 volte con PBST su un agitatore a 450 giri/min, 5 min ogni volta.</li>
	<li>Pipetta 80 µ l di soluzioni contenenti 2,5 µ g/mL streptavidina fluoroforo in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 20 minuti su un agitatore a 450 giri/min.</li>
	<li>Sciacquare il vetrino 3 volte con PBST e una volta con acqua distillata sull'agitatore a 450 giri/min. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino utilizzando gas azoto.</li>
</ol> 3. Far scorrere la scansione e analisi dei dati <ol><li>scansione il vetrino di saggio con uno scanner di microarray di fluorescenza usando il laser-nm-635.</li>
	<li>Estrarre l'intensità netta di ogni spot utilizzando un'analisi software (ad es. matrice-pro analizzatore) 16.</li>
	<li>Calcolare il limite di rilevabilità (LOD) di ogni proteina usando un software di statistiche e determinare le concentrazioni di proteina nei campioni. 
	Nota: Il LOD è definito come l'intercetta Y della norma cuRVE incrementato di tre volte la deviazione standard dei tre saggi indipendenti.</li>
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
<li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers%3A+CEA%2C+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li>
<li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li>
<li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-analyte+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li>
<li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera%3A+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li>
<li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li>
<li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays%3A+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li>
<li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-chip+protein+arrays%3A+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%3A+A+Programmable+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li>
<li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Colocalization+Microarray%3A+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li>
<li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688(2015).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li>
<li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li>
<li>Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+%28MetaChip%29+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li>
<li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li>
<li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li>
</ol>

McGill University ha presentato una domanda di brevetto su alcuni aspetti di questo lavoro con Huiyan Li e David Juncker come inventori.

In questo lavoro, abbiamo presentato una tecnologia di chip di snap che rende i test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex ampiamente disponibili per i ricercatori con base messa a punto sperimentale. Diverso da microarrays dell'anticorpo esistente, nessun spotter microarray è necessaria per gli utenti finali. Sono dimostrati sia singola che doppia i metodi di trasferimento, e raddoppiare il transfer offre una precisione di allineamento superiore verso il basso per ~ 40 μm per macchie di 98%, con il più grande c...

Un pannello di biomarcatori che comprende proteine multiple può fornire maggiore sensibilità e specificità rispetto al singolo biomarcatore nella diagnosi di malattie complesse come cancri1,2. L'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) è stata la tecnologia di gold standard utilizzata nei laboratori clinici, raggiungimento di un limite di rilevazione a basso pg/mL nel plasma, ma limiti a una sola destinazione per dosaggio3,4,5. Microarrays dell'anticorpo sono stati sviluppati per accogliere migliaia di saggi miniaturizzati condotto in parallelo su un microscopio singola diapositiva6,7,8. Tuttavia, la capacità di multiplexing di questo metodo è limitata dalla reattività crociata reagente-driven, derivanti dall'applicazione di una miscela di dAbs, e diventa più problematico con un numero crescente di target9,10 , 11. Pla et al. hanno dichiarato che la vulnerabilità risultante di un'analisi multiplex panino bilance come 4N(N-1) dove N è il numero dei bersagli12.
Per attenuare la reattività crociata in microarrays dell'anticorpo, anticorpo colocalizzazione microarray (ACM) è stato sviluppato nel nostro laboratorio per sandwich multiplex assay12. Gli anticorpi di cattura (cabine) sono macchiati su un substrato con uno spotter di microarray. Dopo blocchi campioni vengono applicati sulla superficie, e quindi i singoli tocchi sono macchiati sulle stesse macchie con il complesso antigene-cabina. Tutti gli scenari di reattività crociata tra antigeni e anticorpi possono essere mitigati con ACM e limiti di rilevazione a pg/mL sono stati raggiunti. Tuttavia, il protocollo del test richiede preparazione e spotting i danti durante gli esperimenti usando un microarray in loco spotter con alta precisione per scopo di allineamento, che è costoso e richiede tempo, limitare l'ampia applicazione di questa tecnologia in altri laboratori. Un palmare ACM, denominato snap chip è stato sviluppato per cross-reactivity-gratis e privo di spotter multiplex panino immunoassays13,14,15. i taxi e i tocchi sono pre-macchiati su una diapositiva di dosaggio e un trasferimento rispettivamente nel formato microarray e memorizzati. Durante il dosaggio, le diapositive vengono recuperate e un microarray di tocchi sono trasferite collettivamente il vetrino di saggio semplicemente schioccando i due chip insieme. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento affidabile reagente. Diapositive di nitrocellulosa rivestita con una capacità di legame dell'anticorpo relativamente grandi sono stati usati come gli scivoli di dosaggio per assorbire le goccioline di liquide e facilitando così il trasferimento di reagente, tuttavia, le diapositive sono più costose di microarray e diapositive di vetro regolare scanner compatibile con diapositive non trasparenti sono necessari per l'acquisizione del segnale.
In questo lavoro, dimostriamo il protocollo di esecuzione di un immunodosaggio a sandwich multiplex con un chip di snap. Un apparato di romanzo snap è stato sviluppato per il trasferimento di reagente più conveniente e affidabile da microarray a DNA-microarray. Cosa importante, qui abbiamo stabilito il metodo di trasferimento di reagente su vetrini regolari con il chip di snap. 1024 punti correttamente trasferiti e allineati su una lastra di vetro, espandendo significativamente l'uso di questa tecnologia nella maggior parte dei laboratori.

<table><tbody><tr><td>Compressa salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 coniugato con streptavidina</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bloccaggio: Stabilizzatore per microarray StabilGuard Choice senza BSA</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti in nitrocellulosa</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti di aminosilano</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo a scatto</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Spotter di microarray a getto d'inchiostro</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione del modulo di scorrimento</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Perle di stabilizzazione dell'umidità</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer Software</td><td>Media Cybernetics</td><td>Versione 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Scanner per microarray a fluorescenza</td><td>Agilent</td><td>SureScan Software per microarray Software</td><td></td></tr><tr><td>di biostatistica</td><td>Software GraphPad</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo per cattura endoglina</td><td>R& Sistemi D</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>R& R sulla proteina endoglinica</td><td> D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo per la rilevazione dell'endoglina</td><td>R& Sistemi D</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6a (vedi Tabella 1)</td><td>R& D Sistemi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b (vedi Tabella 1)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex cross-reactivity e spotter-free

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Analisi multiplex della proteina ha mostrato sensibilità diagnostica superiore e precisione rispetto alle singole proteine. Microarrays dell'anticorpo consentono migliaia di test immunodiagnostici di micro-scala eseguite contemporaneamente su un singolo chip. Formato di dosaggio sandwich migliora la specificità dell'analisi rilevando ogni destinazione con due anticorpi, ma soffre di reattività crociata fra i reagenti, limitando così la loro capacità di multiplexing. Microarray di colocalizzazione dell'anticorpo (ACM) è stato sviluppato per la rilevazione di proteine "multiplex" cross-reactivity-gratis, ma richiede un costoso spotter in loco per la produzione di microarray durante le analisi. In questo lavoro, dimostriamo una tecnologia di chip di snap che trasferisce il reagente da microarray a DNA-microarray di schiocco semplicemente due chip insieme, che così nessun spotter è necessaria durante l'incubazione del campione e la successiva applicazione degli anticorpi di rilevamento (danti) su deposito di diapositive pre-macchiati, dissociando la preparazione del vetrino dall'esecuzione di test. Entrambi i metodi di trasferimento di singole e doppie sono presentati per ottenere l'allineamento tra i due microarray e la fabbricazione di diapositiva per entrambi i metodi sono descritti. I risultati indicano che &#60; 40 μm allineamento è stato realizzato con doppio trasferimento, raggiungendo una densità di matrice di 625 punti/cm2. Un immunoassay 50-plexed è stato condotto per dimostrare l'utilizzabilità del chip lo snap in analisi multiplex della proteina. Limiti di rilevazione delle 35 proteine sono nella gamma di pg/mL.

La procedura di analisi per singolo e doppio metodi di trasferimento è mostrato nella Figura 1. Nel singolo trasferimento, le cabine sono macchiate direttamente nella diapositiva saggio e i tocchi vengono trasferiti nella diapositiva di analisi al momento dell'impiego in un modello di specchio delle carrozze (Figura 1a). Un solo trasferimento procedura è necessaria, ma questo metodo soffre di disallineamento tra i due microarray,...

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare simultaneamente molteplici proteine sul chip utilizzando saggi immunoistochimici a sandwich in modo privo di stampa, senza reattività crociata tra i reagenti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della proteomica quantitativa, come la scoperta e la validazione di biomarcatori proteici candidati nel cancro. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'assenza di reattività crociata tra anticorpi e antigene nei saggi a sandwich multiplex e il fatto che gli utenti non necessitano di uno spotter per microarray complesso.La procedura sarà dimostrata da Heidi Larkin, direttore scientifico presso Parallex BioAssays. Per iniziare la preparazione dei vetrini per il metodo di trasferimento singolo, fissare un nuovo vetrino di trasferimento sul piatto dello spotter a microarray a getto d'inchiostro. Utilizzando una soluzione di microsfere di polistirene o glicerolo al 30%, depositare un array di segni di allineamento sul bordo del vetrino.Utilizzando il software dello strumento e la fotocamera del dispenser, scattare una foto dei segni di allineamento per il controllo di qualità. Successivamente, fissare una lamella per saggio in nitrocellulosa o vetro funzionalizzato a sinistra della lamella di trasferimento sul piatto di un microdispenser a getto d'inchiostro. Utilizzando i segni di allineamento, depositare 24 matrici di soluzioni di anticorpi di cattura con un interasse di 400 micrometri.Incubare il vetrino del saggio a temperatura ambiente in un'atmosfera con umidità relativa del 60% per un'ora. Quindi fissare una guarnizione in silicone a 24 pozzetti sul vetrino, allineandola con gli array. Pipettare 80 microlitri di una soluzione allo 0,1% di polisorbato 20 in PBS in ciascun pozzetto.Agitare la piastra a 450 giri al minuto per cinque minuti e scartare la soluzione. Lavare la piastra in questo modo per tre volte. Successivamente, aggiungere 80 microlitri di soluzione bloccante priva di BSA in ciascun pozzetto risciacquato.Agitare la lamella a 450 giri al minuto per un'ora. Successivamente, scartare la soluzione, rimuovere la guarnizione in silicone e asciugare la lamella per il saggio utilizzando gas azoto o una centrifuga. Sigillare la lamella per il saggio in un sacchetto ermetico con gel di silice o un altro disidratante e conservarla a meno 20 gradi Celsius.Utilizzando gli stessi segni di allineamento, depositare 24 matrici di soluzioni di anticorpi di rilevamento usando 3,2 nanolitri per spot con un passo centro-centro di 400 micrometri. Conservare il vetrino di trasferimento a meno 20 gradi Celsius in un sacchetto sigillato con un disidratante. Per iniziare a preparare i vetrini per il metodo di doppio trasferimento, fissare un vetrino di trasferimento sul piatto di un spotter microarray a getto d'inchiostro.Deporre 24 matrici di soluzioni di anticorpi di cattura con un passo centro-centro di 400 micrometri. Ruotare quindi gli interruttori a pistone dell'apparecchio di aggancio di 90 gradi per bloccare i pistoni in posizione aperta. Inserire la lamella di trasferimento per la cattura nell'apparecchio con l'angolo smussato contro il perno a molla fisso.Rilasciare i perni a molla ruotando di nuovo di 90 gradi gli appositi interruttori a pulsante. Assicurarsi che la lamella di trasferimento sia saldamente trattenuta dai perni a molla e sia perfettamente allineata con i perni di posizionamento fissi. Quindi posizionare una nuova lamella in nitrocellulosa o in vetro funzionalizzato sui perni a molla, con il lato rivestito rivolto verso il basso.Attivare gli altri tre interruttori per rilasciare i perni dritti. Verificare che entrambi i vetrini siano trattenuti in posizione contro i perni di allineamento fissi. Quindi inserire il coperchio superiore sul supporto dei vetrini, facendo in modo che il perno si inserisca nei fori di allineamento.Inserire l'apparecchio chiuso nella gabbia a scatto e premere completamente la linguetta di chiusura. Lasciare l'apparecchio chiuso per un minuto. Successivamente, sollevare la linguetta di chiusura per rilasciare l'apparecchio dalla gabbia.Rimuovere il coperchio superiore e separare i vetrini per il saggio e il trasferimento. Incubare il vetrino per il saggio per un'ora. Successivamente, fissare un guarnizione in silicone da 24 pozzetti sul vetrino e lavarlo tre volte.Quindi agitare la lamella con la soluzione di bloccaggio priva di BSA per un'ora. Rimuovere la guarnizione e asciugare la lamella per l'analisi sotto un flusso di gas azoto o in una centrifuga. Successivamente, fissare un'altra lamella di trasferimento sulla piattaforma dello spotter a getto d'inchiostro.Applicare 24 matrici di soluzioni di anticorpi di rilevamento sul vetrino con 3,2 nanolitri per spot, con una distanza centro-centro di 400 micrometri, per ottenere il vetrino di trasferimento. Conservare il vetrino di trasferimento per il rilevamento a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare il saggio immunoistochimico, rimuovere il vetrino per il saggio preparato dal congelatore e lasciarlo riscaldare alla temperatura ambiente all'interno della sua busta sigillata per 30 minuti.Preparare sette soluzioni di proteine diluite in serie in PBS con polisorbato 20 allo 0,05%. Preparare soluzioni campione opportunamente diluite nello stesso tampone. Fissare una guarnizione in silicone da 24 pozzetti sulla lamella dell'assay a temperatura ambiente.Caricare le sette diluizioni proteiche in sette dei otto pozzetti di una colonna. Caricare PBS privo di proteine con 0,05% di polysorbato 20 nell'ultimo pozzetto della colonna. Caricare le soluzioni campione nei pozzetti rimanenti.Agitare le vetrate a 450 rpm per un'ora a temperatura ambiente oppure a 4 gradi Celsius durante la notte. Quindi lavare la vetrata tre volte. Rimuovere la guarnizione e asciugare la vetrata sotto un flusso di gas azoto.Successivamente, lasciare che la lamella con l'anticorpo di rilevamento raggiunga la temperatura ambiente per 30 minuti all'interno della sua busta sigillata. Quindi, incubare le lamelle per 20 minuti in una camera chiusa con umidità relativa del 60% per reidratare le matrici. Utilizzare i perni pogo per fissare la lamella di trasferimento del rilevamento con la faccia rivolta verso l'alto nell'apparecchio a scatto.Posizionare il vetrino dell'assay con la faccia rivolta verso il basso sui perni pogo e allineare il vetrino con i perni dritti. Chiudere l'apparato e trasferire con uno scatto gli anticorpi di rilevamento sul vetrino dell'assay. Rimuovere i vetrini dall'apparato e incubare il vetrino dell'assay per un'ora.Stringere una guarnizione in silicone da 24 pozzetti al vetrino e lavare il vetrino tre volte. Successivamente, aggiungere in ciascun pozzetto 80 microlitri di una soluzione di streptavidina fluoro-4 a 2,5 microgrammi per millilitro in PBS. Agitare il vetrino a 450 giri al minuto per 20 minuti.Lavare il vetrino tre volte con una soluzione allo 0,1% di polisorbato 20 in PBS e una volta con acqua distillata. Quindi rimuovere la guarnizione e asciugare il vetrino. Scansionare il vetrino con un lettore a fluorescenza e misurare le intensità dei punti.Determinare i limiti di rilevamento nelle concentrazioni proteiche. Due proteine fluorescenti sono state stampate in sequenza su un vetrino rivestito con nitrocellulosa utilizzando il metodo di doppio trasferimento con un modello a 16 pozzetti. Non è stata osservata alcuna contaminazione incrociata durante il trasferimento della seconda proteina fluorescente.Punti più piccoli con una ridotta distanza tra un punto e l'altro possono essere trasferiti su un vetrino con una superficie altamente idrofobica. Il metodo di doppio trasferimento ha determinato un minimo disallineamento angolare degli array. Il metodo di doppio trasferimento è stato utilizzato per eseguire un immunoassay a 50 parametri di proteine associate al cancro al seno in formato saggio a sandwich.Non è stata osservata reattività incrociata, consentendo l'ottimizzazione indipendente di ogni coppia di anticorpi. Le curve standard calcolate a partire dai saggi hanno indicato che 35 delle 50 proteine presentavano limiti di rilevamento nell'ordine del picogrammo per millilitro. Una volta acquisita, questa tecnica può essere completata in circa tre ore.Questa tecnica consente agli scienziati di eseguire saggi basati su microarray e di erogare reagenti sotto forma di nano-gocce. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricordarsi di fissare correttamente i vetrini sul piano di stampa e nell'apparato snap. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare l'apparato snap per saggi immunoenzimatici sandwich multiplex privi di cross-reattività.

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Il video mostra l'implementazione della tecnologia snap chip per saggi immunologici a sandwich multiplex privi di cross-reattività. La semplice azione di far scattare due vetrini di microarray, ciascuno contenente reagenti diversi, garantisce il trasferimento dei reagenti senza contaminazione incrociata e aiuta a rilevare più proteine utilizzando il test immunologico a sandwich.

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