Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di realizzare sezioni seriali ultrasottili in modo sicuro e semplice. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, fornendo informazioni strutturali quantitative e tridimensionali di un'intera cellula a livello di microscopia elettronica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il sezionamento seriale ultrasottile può essere eseguito senza una macchina costosa e con questo metodo è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione.

Per iniziare questa procedura, pulire la superficie di un vetrino. Quindi immergere metà del vetrino nella soluzione di Formvar all'1,5% nella colonna superiore dell'apparato cinematografico di supporto Formvar premendo la soluzione con aria attraverso il rubinetto a tre vie utilizzando una sfera di gomma. Scaricare la soluzione dalla colonna aprendo il rubinetto a tre vie e rilasciando aria per ridurre la pressione.

Quindi estrarre il vetrino dall'apparecchio e asciugarlo all'aria per formare una pellicola sulla superficie del vetrino. Raschiare i quattro bordi della pellicola sul vetrino con una lama di rasoio. Dopo aver respirato sul vetrino per facilitare la separazione della pellicola dal vetrino, galleggiare fuori dalla pellicola immergendo lentamente il vetrino in acqua con un angolo orizzontale basso.

Quindi raccogli la pellicola Formvar dall'acqua usando una griglia di alluminio con fori. Per tagliare il blocco del campione con una lama di taglio a ultrasuoni e una lama di rasoio sotto uno stereomicroscopio, assicurarsi innanzitutto che ci siano cellule sulla superficie del blocco osservando la punta del blocco con un microscopio ottico. Quindi montare il blocco campioni nel mandrino e montare il mandrino su una fase di rifilatura.

Taglia i blocchi a una dimensione di 0,7 per 1,0 millimetri. Se la resina epossidica è molto dura, taglia prima la scatola usando una lama da taglio a ultrasuoni, quindi taglia ulteriormente il blocco con una lama di rasoio. Tagliare una spalla per segnare la direzione di taglio.

Per tagliare il blocco del campione con un coltello diamantato utilizzando il microtomo, posizionare il mandrino del blocco del campione nel supporto del campione dell'ultra microtomo. Tagliare la superficie del blocco con un coltello da taglio diamantato. Posizionare il bordo del coltello diamantato parallelamente alla faccia del blocco del campione e tagliare la quantità minima di superficie del campione in modo da non perdere alcun campione.

Tagliare il bordo sinistro del blocco utilizzando il coltello da rifilatura ruotando il livello del coltello di 30 gradi a sinistra. Questo bordo diventa il lato superiore del campione nel sezionamento seriale. Quindi tagliare la faccia del blocco a circa 100 micron dal bordo sinistro del campione ruotando il tavolino del coltello di 30 gradi a destra.

Questo bordo diventa il lato inferiore del provino nel sezionamento seriale. Rimuovere il coltello di rifilatura e ruotare il blocco campione di 90 gradi in senso orario. Impostare un coltello da sezione ultrasottile sul palco del coltello.

Regolare la superficie del campione e il bordo del coltello in modo che siano rivolti parallelamente l'uno all'altro utilizzando la maggior parte della superficie del campione. Quindi, applicare il nastro adesivo sul mandrino e sul supporto del mandrino del microtomo e tagliare il nastro al limite. Estrarre il campione dal microtomo e metterlo sotto lo stereomicroscopio.

Tagliare la maggior parte del campione con una lametta da rasoio lasciando la parte sottile da cui si otterranno le sezioni seriali Rendere i lati della sezione adesivi utilizzando una pipetta Pasteur per far cadere circa un microlitro di soluzione di Neoprene allo 0,5% sul campione da utilizzare per il sezionamento seriale. Quindi coprire l'intero campione con una soluzione di neoprene. Assorbire immediatamente la soluzione di neoprene in eccesso con un pezzo di carta da filtro posizionato vicino al campione.

Quindi, prepara tre griglie a fessura per la raccolta di sezioni seriali. Per fare ciò, piegare l'impugnatura delle griglie a 60 gradi e trattare le griglie con una soluzione di neoprene allo 0,5%. Quindi rendere le griglie idrofile mediante scarica a incandescenza.

Riposizionare il mandrino del blocco campioni nel microtomo nella stessa posizione allineando le parti nastrate. In questo modo la faccia del blocco e il bordo del coltello sono perfettamente paralleli tra loro. Quindi avvicinare il coltello al campione.

Dopo aver riempito d'acqua la barca a coltello, coprire il microtomo con un coperchio di plastica per impedire il flusso d'aria. Iniziare a tagliare il campione con uno spessore di sezione di 200 nanometri. Dopo aver tagliato la prima sezione, impostare lo spessore della sezione su 70 nanometri.

Quando il numero di sezioni seriali raggiunge 20, impostare lo spessore della sezione su 10 nanometri. Poiché il microtomo non può tagliare sezioni spesse 10 nanometri, non appare alcuna nuova sezione e le sezioni precedentemente tagliate si separano dal bordo del coltello. Quindi, impostare lo spessore della sezione su 60 nanometri.

Questo produrrà sezioni di 70 nanometri perché la macchina aggiungerà il precedente spessore di 10 nanometri. Infine, riportare lo spessore della sezione a 70 nanometri e continuare il taglio fino ad ottenere sezioni lunghe 1,8 millimetri. Per prelevare le sezioni seriali, posizionare prima l'anello di tenuta della sezione sul terzo gruppo di sezioni.

Quindi posizionare l'anello di sollevamento della superficie dell'acqua sul coltello stage. Posiziona l'anello del WSRL appena sopra le sezioni seriali spostandone l'albero e la maniglia. Abbassare l'anello del WSRL sulla superficie dell'acqua in modo che l'anello circondi le sezioni.

Spingere l'anello verso il basso ruotando la vite verso il basso in modo che la superficie dell'acqua sia sollevata dalla tensione superficiale. Spostate la sezione al centro del loop. Posizionalo sull'apice dell'acqua e regola la direzione della sezione utilizzando una ciocca di capelli.

Prelevare i gruppi di sezioni toccandoli con una griglia a fessura nuda, che è aiutata da una pinzetta e mantenuta parallela alla superficie dell'acqua. Posiziona le griglie con le sezioni insieme a una piccola goccia d'acqua sulla pellicola di supporto Formvar. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando la carta da filtro.

Dopo che le sezioni sono completamente asciutte, strappare la pellicola Formvar attorno alle griglie; e rimuovere le griglie che sostengono le sezioni. Posizionare le griglie nella scanalatura del tubo di colorazione nell'ordine corretto e colorare le sezioni con acetato di uranile e citrato di piombo. Impostare le cinque griglie nel portacampioni multipli nell'ordine corretto, orientando l'asse lungo della fessura della griglia perpendicolarmente all'asse del portacampioni.

Fissare la griglia con i fissatori della griglia e inserire il portacampioni nel microscopio elettronico a trasmissione. Procedi a scattare foto delle cellule bersaglio e di tutte le sezioni delle celle ad alto ingrandimento. Qui è mostrata una vista a basso ingrandimento di cinque griglie che trasportano sezioni seriali.

18-25 sezioni sono state montate su una griglia. Si noti che le sezioni sono attaccate insieme e hanno lo stesso spessore. Qui sono mostrate sezioni seriali della miogenesi del pericarione.

La figura mostra 12 delle 67 sezioni complete. Si è scoperto che questa cellula ha un grande nucleoide costituito da fibre di DNA nude con una singola membrana nucleoide ed endosimbionti che assomigliano a batteri ma senza mitocondri. Pertanto, questo organismo sembra essere una forma di vita intermedia che si evolve da procariote a eucariote.

Qui sono mostrate sezioni seriali di Escherichia coli. La figura mostra 12 sezioni complete. È interessante notare che si è scoperto che questa cellula contiene 21.700 ribosomi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare sezioni ultrasottili seriali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente.